¹重庆科技学院化学化工学院，重庆

²重庆长风化学工业有限公司，重庆

³重庆市药物种植研究所，重庆

收稿日期：2022年9月22日；录用日期：2022年10月8日；发布日期：2022年11月1日

摘要

目的：运用相似性筛选、分子对接筛选方法联合分子动力学模拟技术从天然产物数据库中挖掘松材线虫乙酰胆碱脂酶(Acetylcholinesterase, AChE)抑制剂。方法：运用同源建模技术构建松材线虫乙酰胆碱脂酶AChE的蛋白质结构，并将已知抑制活性的鱼藤酮作为AChE的配体小分子以获得最佳对接参数及对接网格大小。利用结构相似性筛选、类药性评价、分子对接、分子动力学模拟及结合自由能计算等多种策略，从天然产物数据库中筛选AChE抑制剂。结果：经过多轮筛选，共获得21个命中分子，其中前2位最佳命中分子为M1魚藤素小分子，对接分数达−11.0 kcal∙mol⁻¹，其次为M2槐黄烷酮G小分子，对接分数达−10.6 kcal∙mol⁻¹。结合分子动力学模拟，发现魚藤素和槐黄烷酮G小分子与受体蛋白具有强氢键作用和疏水相互作用，能形成稳定的复合物。结合自由能计算结果表明两分子与AChE蛋白结合具有类似的作用方式，有较高的AChE酶抑制活性，为AChE抑制剂开发的有效先导化合物。结论：运用该研究思路从天然产物数据库中挖掘出了对乙酰胆碱酯酶AChE有高抑制活性的小分子化合物，可为松材线虫AChE小分子抑制剂的开发提供物质参考。

关键词

松材线虫，乙酰胆碱酯酶(AChE)，分子对接，虚拟筛选，分子动力学模拟

Virtual Screening of Bursaphelenchus xylophilus AChE Inhibitors Based on Molecular Docking from the Natural Products Database

Shuangkou Chen^1*, Si Tang¹, Xiaoqing Tan¹, Xi Xu¹, Zhenning Yang², Fengming Ren³, Jingyi Sun¹, Xinlong Hu¹

¹Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chongqing University of Science and Technology, Chongqing

²Chongqing Changfeng Chemical Industry Co. LTD, Chongqing

³Institute of Medicinal Plant Cultivation, Chongqing

Received: Sep. 22^nd, 2022; accepted: Oct. 8^th, 2022; published: Nov. 1^st, 2022

ABSTRACT

Objective: Similarity screening, molecular docking and molecular dynamics simulation were used to explore Acetylcholinesterase (AChE) inhibitors of Bursaphelenchus xylophilus from natural product databases. Methods: The protein structure of Bursaphelenchus xylophilus AChE was constructed by homology modeling technology, and rotenone with known inhibitory activity was used as the ligand of AChE to obtain the optimal docking parameters and mesh size. The AChE inhibitors were screened from natural product databases by multiple rounds of virtual screening strategies, such as structure-based similarity screening, drug-like evaluation, molecular docking, molecular dynamics simulation and binding free energy calculation. Result: A total of 21 hit molecules were obtained through multiple rounds of virtual screening, among which the top two best hit molecules were rotenin (M1) small molecule with docking fraction of −11.0 kcal∙mol⁻¹, followed by sophorflavanone G (M2) small molecule with docking fraction of −10.6 kcal∙mol⁻¹. Combined with molecular dynamics simulation, rotenin and sophorflavanone G small molecules showed strong hydrogen bond and hydrophobic interaction with target receptor protein, and could form stable complexes. Binding free energy calculation found that the two molecules combined with ACE protein had similar action mode and high inhibition activity on AChE enzyme, which were effective lead compounds for AChE inhibitor development. Conclusion: The small molecule compounds with high inhibitory activity on AChE were discovered from natural product database by using this research idea, which could provide material reference for the development of Bursaphelenchus xylophilus AChE small molecule inhibitors.

Keywords:Bursaphelenchus xylophilus, Acetylcholinesterase (AChE), Molecular Docking, Virtual Screening, Molecular Dynamic Simulation

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1. 引言

松材线虫病又名松树萎蔫病，是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的一种重大的检疫性森林病害，具有致病力强，传播迅速和潜伏期长等特点 [1] 。自1982年于南京紫金山首次发现以来，我国已有江苏、安徽、四川和云南等18个省市成为了松材线虫病疫区 [2] 。且随着疫情的不断蔓延，发病面积正逐年扩大，松林毁灭面积达数十万公顷，松树累计死亡5亿株以上，而造成的经济损失已达数亿元，严重破坏我国乃至全球的森林生态，若不加以控制，在未来可能将引起巨大的生态灾难 [3] 。目前，我国对松材线虫病采取的防治手段主要分为对松材线虫的直接防治和对媒介昆虫的间接防治两种。其中对媒介昆虫的防治则利用化学药剂、引诱剂及引入媒介昆虫天敌的生物防治等手段将可传播松材线虫病的松墨天牛等媒介昆虫杀死，抑制疫情在健康树木中的进一步传播。但药剂的大面积喷洒和引诱剂的放置不仅对生态环境造成破坏，还将耗费大量人力、物力和财力，防治效果仍无法达到预期 [4] [5] [6] 。同时，引入媒介昆虫的天敌白僵菌(Beauveria bassiana)等虫生菌的防治手段也将受到寄生率的影响，难以真正达到防病的要求 [3] 。而对于松材线虫本身，则利用注射树干法，向树木中注射鱼藤酮、阿苯哒唑、磷酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑、噢吩哒唑、甲苯哒唑和氟苯哒唑等7种植物源触杀型靶向农药，其作用机制主要通过抑制松材线虫的呼吸代谢系统直接杀死松材线虫，表现出出色的灭杀效果 [7] 。而天然产物具有资源丰富、耐药性低的特点，对环境的负面影响较小，符合我国发布的《“十四五”全国农药产业发展规划》中对行业指出的坚持安全发展，坚持绿色发展，坚持高质量发展和坚持创新发展的方针策略。因此，以松材线虫的相关基因为靶标，从天然产物中发现可有效抑制松材线虫的药物分子，开发出靶向明确、抗性低的新型杀线虫剂具有十分重要的意义。

乙酰胆碱脂酶(acetylcholinesterase, AChE)为生物神经传导中的一种糖蛋白，在生物神经传导过程中发挥关键作用，即通过降解乙酰胆碱来终止神经递质对突触后膜兴奋的刺激作用，以确保神经信号的正常传递，最终发挥对生物中正常肌肉活动的调节作用 [8] 。据相关研究报道，松材线虫中已克隆到BxACE1，BxACE2和BxACE3等3种AChE基因，并已开发出有机磷(Organo-phosphates, Ops)和氨基甲酸酯(Carbamates, CBs)两种以AChE为作用靶标的抑制剂，其主要作用机制为通过积累过量的Ach引起去极化阻断，从而阻断神经冲动的正常传递，最终导致松材线虫死亡 [9] 。但有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的使用，不仅污染环境，还将导致抗药性等问题。此外，研究还发现AChE在生物细胞凋亡、促进造血细胞形成、炎症反应和免疫反应等方面发挥重要作用 [10] [11] 。在诱导细胞凋亡的体外研究发现，生物体内的细胞在凋亡时将大量表达AChE，进一步表明AChE的表达可加剧生物细胞的凋亡 [12] [13] 。因此，本文以松材线虫的乙酰胆碱脂酶AChE为药物靶标，利用基于配体结构的相似性筛选、类药性评估及分子对接等手段从天然产物数据库中虚拟筛选出可有效抑制松材线虫AChE的药物分子，为新型的环保型植物源AChE抑制剂的开发提供物质参考。

2. 材料和方法

2.1. 软件

基于已知活性配体结构的相似性虚拟筛选采用Open babel 3.1.1软件的fingerprints模块；天然产物数据库中筛选的小分子的类药性评估采用DruLiTo软件 [14] ；受体蛋白与原晶体配体的重对接采用PyRx软件；分子对接的虚拟筛选均在linux系统下采用AutoDockvina软件 [15] ；受体蛋白与配体小分子间的作用模式采用PyMOL v2.0 [16] 软件和LigPlus v.2.2 [17] 软件进行可视化；蛋白质晶体结构的构建采用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)网站在线三维建模，氨基酸序列号采用ACZ64207.1，从NCBI中下载 [9] ；并采用PROCHECK (http://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/)对乙酰胆碱酯酶的结构进行评估。

2.2. 受体蛋白质结构的构建及对接参数生成

为获取松材线虫乙酰胆碱酯酶的蛋白质结构，根据已报道的BxACE1基因，从生物数据库NCBI中下载序列号为ACZ64207.1的氨基酸序列，并利用SWISS-MODEL对BxACE1进行模板搜寻，选择同源性最高的冈比亚按蚊乙酰胆碱酯酶(PDB ID: 5ydi)为模板，其同源性为48.3%，满足同源建模模板同源性需大于30%的标准，通过同源建模最终获得松材线虫乙酰胆碱酯酶的蛋白结构。同时，采用PROCHECK分析蛋白结构的合理性。而对于其配体小分子，则运用PyMOL软件将模板5ydi的原结晶配体通过align命令叠合至结构中，获得其活性位点。然后根据文献报道鱼藤酮分子对松材线虫具有高效灭杀作用，可有效作用于松材线虫的呼吸系统的相关靶点，但当其作用于乙酰胆碱酯酶时对松材线虫的灭杀作用远强于以乙酰胆碱酯酶为主要靶标的克线磷 [7] 。因此，采用鱼藤酮分子作为相似性虚拟筛选和分子对接虚拟筛选的阳性对照分子，并利用PyRx及Audodockvina软件将鱼藤酮分子对接至松材线虫乙酰胆碱酯酶的蛋白活性位点中，以对接前后两配体重叠的均方根偏差(RMSD)值对对接参数的合理性进行评判，一般认为RMSD ≤ 2.0 Å [18] 代表对接参数能较好地重现原配体小分子的空间位置及构象，最终确定对接参数。并采用PyMOL可视化鱼藤酮与AChE蛋白间的作用模式。

2.3. 基于已知活性配体结构的相似性计算和类药性评估的多轮虚拟筛选

以鱼藤酮小分子作为模板分子，利用babel 命令调用Open babel的fingerprints模板分别计算陶术2800数据库中的2497个天然产物小分子在FP2，FP3及FP4的计算方法下与模板分子间的相似性系数，并由大到小进行排序，然后选取3种分子指纹下的相似性系数排名靠前的200个分子，于Bioinformatics & Evolutionary Genomics (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)网站在线绘制venn图，获得交集分子，即为与模板分子高度相似的小分子。接着，基于类药性5规则“Lipinski’s Rule” [19] (MW ≤ 500；H-bond acceptors ≤ 10；H-bond donors ≤ 5；Rotatable bonds ≤ 10和LogP ≤ 5)对命中分子进行2轮筛选，从氢键给体、供体、分子量、脂水分配系数及可旋转键数等方面对经过相似性筛选的小分子进行成药性评估，获得成药性质良好的分子。

2.4. 基于分子对接的虚拟筛选

根据AChE受体蛋白与鱼藤酮小分子的对接参数，以分子对接进行第3轮筛选。采用obabel命令对经过前2轮筛选的命中分子批量进行加氢、格式转换(SDF转换为PDBQT格式)等预处理，然后在linux系统下采用AutoDockvina软件将数据库中的命中分子与AChE受体蛋白进行分子对接，计算对接分数。以鱼藤酮与AChE受体蛋白的对接分数为阈值，筛选出对接分数低于阈值的小分子，并根据对接所得的结合能∆G (单位为kcal∙mol⁻¹)，利用公式 $K_i=\exp \left\{\left(\Delta G\times 1000\right)/\left(R_{cal}\times T\right)\right\}$ 计算小分子与靶点蛋白的结合亲和力(K_i)，其中T为298 K，Rcal为1.98719 cal/(mol∙K) [20] 。亲和力强于配体鱼藤酮的小分子即为松材线虫乙酰胆碱酯酶抑制剂的有效候选小分子。并采用PyMOL和LigPlus可视化亲和力最强的前2个分子与AChE受体蛋白间的3D和2D作用模式。

2.5. 分子动力学模拟

本文选取了前2位最佳命中分子M1和M2，利用GROMACS 2020.6软件包分别对两个蛋白–配体复合物进行10ns的分子动力学模拟(MD) [21] ，以探究不同配体对ACHE的相互作用。其中ACHE晶体蛋白和配体小分子均采用AMBER99SB力场。运用UCSF Chimera结合ACPYPE软件在AMBER ff99SB力场下生成配体的拓扑文件并赋予部分电荷 [22] [23] [24] 。在模拟之前，将蛋白–配体复合物体系置于周期边界充满水分子的立方体SPC水盒中，并使用Cl⁻和Na⁺来中和系统中的电荷。使用最抖下降法使系统的能量在10,000步内达到最小化。然后用NVT对整个系统进行平衡，在1000 ps内缓慢加热至300 K，并限制系统位置。最后，在NPT系综下，对整个体系实施10 ns的恒温恒压分子动力学模拟。模拟完成后，抽取最后2 ns的动力学轨迹计算MM/PBSA结合自由能，进一步考察命中分子与松材线虫乙酰胆碱酯酶ACHE的结合强弱及能量组分贡献情况。

3. 结果

3.1. 材线虫乙酰胆碱酯酶的同源建模

采用SWISS-MODEL对材线虫乙酰胆碱酯酶蛋白进行同源建模，并利用Procheck获得Ramachandran图对蛋白结构的合理性进行评估。如图1所示，86.7%的氨基酸位于最合适的A，B，L区域，代表氨基酸构象具有非常高的稳定性。11.5%的氨基酸位于较合适的a，b，l，p区域，说明此区间的氨基酸构象仍然拥有较高的稳定性。而0.8%的氨基酸位于一般合理的~a，~b，~l，~p区域，此区间的氨基酸拥有基本稳定的构象。对于不合理区，仅有1%氨基酸位于该区域，允许区和最佳合理区的氨基酸占整个蛋白质的比例大于90%，表明该蛋白结构具有合理性，可应用于进一步研究。此外，采用PyMOL、PyRx及Autoduckvina为蛋白添加了配体并获得对接参数，其相互作用模式如图2所示。通过分子对接，发现配体鱼藤酮分子与乙酰胆碱酯酶的对接分数达−9.4 kcal/mol，表明两者具有较高的结合活性。由图2可知，乙酰胆碱酯酶的活性口袋主要由SER215、HIS470、GLU214、GLY133、TYR350、TRP98、ALA308、PHE351、GLU306等氨基酸残基组成，而鱼藤酮配体小分子在活性口袋中与氨基酸残基以疏水作用结合，并与GLN355 (2.8 Å)和TRP137 (2.8 Å)氨基酸残基形成两个氢键，最终形成稳定的复合物，进一步表明蛋白及其配体的构建合理。

3.2. 基于相似性的虚拟筛选

基于生物活性较高的鱼藤酮小分子的结构，对数据库中2497个天然分子进行了相似性虚拟筛选，3种相似性方法共筛选出相似性系数较高的69个分子，交集Venn图及前10个分子的相似性系数如图3所示。由相似性筛选发现，T2970为鱼藤酮分子，三种相似性方法计算的相似性系数均等于或接近1，表明相似性计算方法的合理性。与鱼藤酮分子结构高度相似的分子为魚藤素，属鱼藤酮类化合物，可抑制昆虫的生长发育和食欲，具有毒杀昆虫的生物活性 [25] 。随着研究的深入，发现鱼藤素还具有较强的抗癌活性 [26] 。接着，对上述69个天然分子进行了类药性评估，发现仅有10个分子不满足类药5原则，其余49个分子均具有较好的成药性，可进行下一步研究。

图1. 乙酰胆碱酯酶蛋白的Ramachandran图

图2. 乙酰胆碱酯酶AChE的蛋白质结构及与鱼藤酮的结合模式

图3. FP2、FP3和FP4三种相似性计算方法中前200个分子的Venn图

3.3. 基于分子对接的虚拟筛选

基于靶标乙酰胆碱酯酶AChE的三维空间结构，对成药性良好的49个天然分子进行分子对接，计算其与松材线虫靶点蛋白的结合亲和力。其中，鱼藤酮分子的亲和力Ki为127.71 nmol∙L⁻¹最终筛选获得结合亲和力高于鱼藤酮的21个候选化合物，其亲和力Ki及类药性相关数据列于表1中。21个候选化合物中与受体蛋白结合亲和力最高的为M1魚藤素小分子，Ki为8.57 nmol∙L⁻¹，其次为M2槐黄烷酮G小分子，Ki为16.83 nmol∙L⁻¹。为进一步探究上述两分子与乙酰胆碱酯酶受体蛋白间的作用模式，分别采用PyMOL和LigPlus软件可视化了AChE-M1和AChE-M2两蛋白复合物的3D和2D相互作用关系，如图4所示。从相互作用可视化图3发现，M1和M2小分子与鱼藤酮相似，在与乙酰胆碱酯酶蛋白结合时，紧紧包裹于由SER215、HIS470、GLU214、GLY133、TYR350、TRP98、ALA308、PHE351和GLU306等氨基酸残基形成的活性口袋中。其中，通过图4的2D相互作用图可知，在AChE-M1蛋白复合物中，M1小分子主要与活性口袋中的GLN355、TYR354、TRP98、GLN214、HIS470、TRP137及PHE310等氨基酸残基形成疏水作用，最终与AChE受体蛋白形成稳定的复合物。而M2小分子，不仅与上述氨基酸残基形成疏水作用，还分别与ASP309、ALA308和GLU306氨基酸残基形成4个氢键，研究报道氢键在药物分子与靶标蛋白的作用中是最重要的一种结合作用，因此，M2小分子可与AChE蛋白紧密结合，形成稳定的复合物。上述结果在蛋白–配体复合物的3D作用关系图中被进一步验证。研究表明M1和M2小分子与AChE蛋白的作用方式与鱼藤酮的一致，均为氢键和疏水作用等作用力促进复合物的形成，以抑制松材线虫乙酰胆碱酯酶AChE的活性，最终导致松材线虫神经冲动的阻断，发挥灭杀松材线虫的作用，为最佳命中分子。

表1. 21个候选化合物的相关参数

图4. M1和M2候选化合物与AChE的3D和2D相互作用可视化图

3.4. 分子动力学模拟

3.4.1. 蛋白–配体复合物的均方根偏差(RMSD)值计算

为探究前2位最佳命中分子与受体蛋白结合的动力学稳定性，对AChE-M1和ACHE-M2复合物体系进行了10 ns的分子动力学模拟。图5展示了两个模拟体系的主链Cα原子的RMSD值随时间的变化情况。由图可知，两个复合物体系在整个模拟过程保持稳定，主链C骨架并未发生较大的波动。模拟运行8 ns后，所有体系的RMSD值稳定在0.20~0.25 nm之间，且整个模拟过程体系的RMSD值涨落范围不超过0.1 nm，表明虚拟筛选的小分子化合物M1、M2与AChE受体蛋白能够形成稳定的复合物，且经过10 ns模拟后最终达到了平衡状态。

3.4.2. 蛋白的均方根波动(RMSF)值分析

为深入了解受体蛋白中与配体小分子结合的氨基酸残基对配体作用于受体蛋白的贡献，分析了在动力学模拟中氨基酸的均方根波动(RMSF)值及动力学模拟后受体–配体间的相互作用关系，结果如图6所示。从图中可知，2个体系中受体各氨基酸的RMSF值的波动趋势相似，表明两个不同的配体具有相似的结合模式。且在两个复合物体系中，RMSF值波动较大的氨基酸残基大部分为loop连接螺旋结构，增加了残基的柔性。而AChE蛋白130-150、305-355、430-475区域内氨基酸残基的RMSF值波动较小，结合受体–配体的相互作用图(图4)可知，上述氨基酸残基与M1和M2小分子发生了相互作用，即对受体产生了抑制作用，维持了复合物体系的稳定性，与分子对接结果一致。

3.4.3. 结合自由能计算

两个复合物体系在进行10 ns的分子动力学模拟后，分别从模拟轨迹中抽取最后2 ns计算MM/PBSA结合自由能并分析能量组分贡献情况，计算结果如表2所示。M1的结合自由能强于M2，与分子对接的打分高低一致。从各组分的能量发现，范德华力、静电势能及表面溶剂化作用均有利于配体小分子与受体蛋白结合，其中范德华力对体系的结合最有利，而极性溶剂化作用则不利于体系结合。MM/PBSA结合自由能分析表明，命中药物分子主要利用疏水作用和氢键相互作用与受体蛋白紧密结合，从而发挥抑制乙酰胆碱酯酶的作用，有望成为松材线虫AChE抑制剂的候选分子。

图5. 乙酰胆碱酯酶蛋白主链Cα原子随时间变化的RMSD值

图6. 蛋白–配体复合物中蛋白骨架原子的RMSF值分布图

表2. AChE-M1和AChE-M2复合物体系的结合自由能及相关能量组分

4. 结论

松材线虫的乙酰胆碱脂酶AChE作为生物神经传导中的一种糖蛋白，可通过降解乙酰胆碱来终止神经递质对突触后膜兴奋的刺激，最终发挥对生物中正常肌肉活动的调节作用，可成为灭杀松材线虫抑制剂开发的一个有效靶标。本文通过对松材线虫乙酰胆碱脂酶蛋白的同源建模，构建了靶标的蛋白质结构。运用基于已知活性配体结构的相似性筛选、类药性评估、分子对接的虚拟筛选及分子动力学模拟等从天然产物数据库中经过多轮筛选，发现抑制活性较高的2个最佳命中分子。M1和M2小分子与参考化合物(鱼藤酮)的结构类似，分子对接分数远高于参考化合物，且通过分子动力学模拟发现，两个分子与AChE受体蛋白结合形成的复合物具有较高的稳定性，结合自由能计算结合受体–配体相互作用模式分析进一步发现M1和M2小分子主要通过静电、疏水作用及范德华力与受体蛋白稳定结合，发挥酶抑制作用，可作为AChE抑制剂的先导化合物，为开发灭杀松材线虫强效AChE酶抑制剂提供参考。

基金项目

重庆英才计划–创新创业示范团队项目(CQYC20210309793)资助；重庆英才计划–基础研究与前沿探索项目(cstc2022ycjh-bgzxm0029)资助。

文章引用

陈双扣,唐 思,谭小庆,徐 曦,杨振宁,任风鸣,孙静怡,胡新龙. 基于分子对接方法从天然产物数据库中筛选松材线虫的乙酰胆碱脂酶抑制剂
Virtual Screening of Bursaphelenchus xylophilus AChE Inhibitors Based on Molecular Docking from the Natural Products Database[J]. 药物化学, 2022, 10(04): 307-317. https://doi.org/10.12677/HJMCe.2022.104032

参考文献