¹合肥工业大学食品与生物工程学院农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥

²江苏贝斯康药业有限公司，江苏 徐州

收稿日期：2023年2月17日；录用日期：2023年3月8日；发布日期：2023年5月8日

摘要

本文采用正己烷–乙醇混合溶剂降低银杏酚酸含量，建立一种低酚酸白果粉的工艺。作者探究了正己烷浓度、洗脱时间、洗脱温度单因素影响，并进一步通过响应面法优选出工艺参数：正己烷含量为16.69%，洗脱温度为41.73℃，洗脱时间为28.02 min，此条件下银杏酸含量 < 10 mg/kg，符合国家药典2020版标准。

关键词

白果粉，银杏酚酸，工艺优化

Optimization of Detoxification Process for Low Ginkgo Phenolic Acid in Ginkgo Powder

Jinming Kang¹, Yunchun Wang¹, Ensheng Fan², Pengcheng Liu², Zeyu Wu¹, Ailing Hui¹, Wencheng Zhang^1*

¹Engineering Research Center of Bio-Process from Ministry of Education, School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei Anhui

²Jiangsu Beisicang Pharmaceutical Co., Ltd, Xuzhou Jiangsu

Received: Feb. 17^th, 2023; accepted: Mar. 8^th, 2023; published: May 8^th, 2023

ABSTRACT

In this paper, n-hexane-ethanol mixed solvent was used to reduce the content of ginkgo phenolic acid, and a process design optimization idea for ginkgo powder with low phenolic acid was established. In the experiment of reducing phenolic acid content, the n-hexane concentration, elution time and elution temperature were investigated respectively. The optimal conditions for removing phenolic acid are obtained by response surface methodology: n-hexane content is 16.69%, the elution temperature is 41.73˚C, and the elution time is 28.02 min. Under this condition, the phenolic acid content is less than 10 mg/kg, which meets national pharmacopoeia 2020.

Keywords:Ginkgo Powder, Ginkgolic Acid, Technology Optimization

Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

中国银杏资源丰富，占世界70%；其全身是宝，提高资源的深加工水平是该领域研发热点之一。国内外对银杏的开发利用以银杏叶和白果(银杏种仁)为主。白果是一种营养丰富、药食兼备的天然资源。白果粉是白果加工而成的产品，具有保健作用和独特的风味，深受消费者的喜爱，用白果粉冲剂可制成具有保健作用的银杏粉冲剂 [1] [2] 。史垠垠等研究以白果为原料生产的饮料是营养价值很高的果味饮品，不仅有着独特的风味，而且有补心养气，益肾润肺，涩精固元，延年益寿，止咳平喘等功效 [3] 。同时以银杏果为主料，配以玉米粉、脱脂奶粉等为辅料制成营养丰富、易吸收的早餐粉 [4] 。

银杏酚酸类物质存在于白果、银杏外种皮和银杏叶中，是银杏及其制品中具有重要生物活性的成分。银杏酚酸属漆酚类物质，具有杀虫、杀菌和抑菌作用 [5] [6] ，也有研究表明，银杏酚酸类物质具有细胞毒性、非免疫毒性、引起变态反应、以及诱导有机体突变和致癌的可能性 [7] [8] [9] 。Lepoittevin等通过豚鼠的过敏试验也发现了银杏酚酸是主要的过敏原 [10] 。银杏酚酸类物质的毒性包括胚胎毒性、致突变毒性和肾毒性等；如将银杏酸置于小鸡胚中进行试验，其胚胎毒性较强；若银杏提取物含16%银杏酸，半数致死量可为1.8 mg/只。银杏酸在大鼠的原代肝细胞中，能够致使DNA双链断裂，具有潜在的致突变毒性 [11] 。银杏酚酸作为银杏药物、提取物及半成品质量标准的重要控制指标之一，受到人们的广泛关注。目前国际生产标准，要求必须将银杏酸含量控制在5 ppm以下。2020版中国药典标准规定：用HPLC法检测，GBE中总银杏酸不得超过5 ppm [12] 。

银杏酚酸难溶于水和乙醇，易溶于石油醚等非极性溶剂，属于脂溶性化合物。在紫外线光照射过程中会出现强烈的淡蓝色荧光反应，为银杏酚酸的紫外吸收特性。银杏酚酸的酸性可以在皂化反应中酸碱中和，易于银杏酚酸的萃取分离，但是副产物较多。由于银杏酚酸羧基的存在，在200℃的条件下，银杏酚酸苯环上的羧基发生脱羧反应，表现出其热不稳定的性质，可利用这种性质特点，对银杏酚酸进行高温处理，从而达到去除部分银杏酚酸的目的 [7] 。考虑到溶剂法操作简单、脱除银杏酚酸较为彻底，为确保银杏酚酸含量在标准范围之内，预防白果粉安全隐患，本文拟采用复合溶剂法进行脱银杏酚酸的工艺研究，以制作一种稳定性良好、营养健康、具有保健功效的低银杏酚酸白果粉。

2. 材料与仪器设备

主要材料：市售银杏果：色谱纯乙腈(南京盛庆和化工)，色谱纯甲醇、正己烷、无水乙醇(国药集团化学试剂公司)。

主要仪器设备：1260 Infinity高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；BSA124S分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；FD-1冷冻干燥机，北京博医康技术公司。

3. 实验方法

3.1. 工艺流程

原料→初选→蒸煮→脱壳→研磨→脱酸→筛分→包装

操作要点：

1) 初选：将新鲜的白果用水选法除去霉烂和空心果，用40℃的风箱烘干直至其质量不会下降。

2) 蒸煮：先用开水煮沸20~30分钟，以1:3的比例将白果和水的比例煮沸，同时搅拌，以去除白果表皮上的银杏酸和其他有害物质。经预煮后，果皮的某些部位发生了裂痕，使果肉与果皮分离。

3) 脱壳：把水份排出，然后把它去掉。去皮及核：用清水反复冲刷，去掉内皮，取出内心。果芯中银杏酚酸的含量一般为核桃的200~500倍，去掉果核后，银杏果实的毒性物质含量明显下降。

4) 研磨：用胶体研磨机把水和白果仁按一定的比例加到一起，然后研磨均匀，然后在实验室里用小型药剂研磨机研磨，然后用120目筛分，存放在阴凉、干燥的地方。

5) 脱酸：采用正己烷–乙醇水洗脱：采用正己烷–乙醇溶液洗脱去残余的银杏酚酸，并分别测定了正己烷浓度、洗脱振荡频率、温度、时间和反应面法。

6) 筛分：用分选机对颗粒大小和大小适宜的全白果粉进行筛分。

7) 包装：将白果粉末定量称重后，按盒自动打包。

3.2. 白果粉中银杏酚酸含量的检测方法

以中国药典2020中银杏叶浸膏中的酚酸为主要成分，使用HPLC法测定其含量 [13] 。总银杏酸参照高效液相色谱法(通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150 mm，柱内径为4.6 mm，粒径为5 μm)；以含0.1%三氟乙酸的乙腈为流动相A，含0.1%三氟乙酸的水为流动相B，梯度洗脱；检测波长为310 nm。

对照品溶液的制备：取白果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含1 μg的溶液，作为对照品溶液；另取总银杏酸对照品适量，用甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，作为定位用对照溶液。

供试品溶液的制备取本品粉末约0.500 g，精密称定，置具离心管中，精密加入甲醇5 mL，称定重量，超声使其溶解，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各50 μL，注入液相色谱仪，计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果酸对照品外标法计算总银杏酸含量，即得。根据白果酸(C15:1)标品(纯度90%)做出标准曲线(如图1所示)，使用最小二乘法进行线性回归得Y = 9.8692X − 0.5249，R² = 0.9996，表明线性关系良好，总银杏酚酸含量可用白果酸含量乘以其对应的比例系数得到。白果酸的标准品HPLC图如图2所示。

3.3. 实验设计

3.3.1. 脱酸单因素试验设计

根据相似相容原理，采用正己烷–乙醇溶液进行提取。精准称取0.500 g白果粉于10 mL离心管中，加入4 mL一定比例的正己烷–乙醇溶液，在一定条件下水浴震荡一定时间，在3500 r/min转速下下离心10 min，回收有机溶剂，真空冷冻干燥后，用甲醇超声提取去酸后的白果粉，使用高效液相色谱仪检测其银杏酚酸含量 [14] 。

图1. 白果酸标准曲线图

图2. 样品总银杏酚酸HPLC色谱图

对正己烷浓度、洗脱温度、振荡频率、洗脱时间4个因素检测其脱酸作用；设定温度 = 30℃，震荡频率 = 120 r/min，时间 = 20 min，分别使用浓度为5%，10%，15%，20%，25%的正己烷溶液洗脱，检测银杏酚酸含量，选取最优浓度水平；设定温度 = 30℃，震荡频率 = 120 r/min，浓度为最优水平，分别选取10、20、30、40、50 min的时间进行洗脱，检测结果，选取最优时间水平；控制其他条件一致，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃进行洗脱，检测结果，选取最优温度水平；控制其他条件一致，分别在80、100、120、140、160 r/min的振动频率下进行洗脱，检测结果，选择最优振动频率水平。从单因素实验中选择显著(P < 0.05)的因素，在最佳结果对应水平左右均匀选出3个水平，为后续响应面试验铺垫 [9] 。

3.3.2. 脱酸响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选取对感官评分影响显著的3个因素，利用Box-Behnken试验设计与分析进行3因素3水平响应面优化。

4. 实验结果

4.1. 溶液中正己烷含量对降低酚酸含量的影响

先固定其他变量，洗脱温度为40℃，振动频率为120 r/min，洗脱时间为30 min，分别加入正己烷浓度在5%、10%、15%、20%、25%的正己烷–乙醇溶液，进行反应，然后通过HPLC检测白果酸含量计算出银杏酚酸的总含量。

图3. 正己烷浓度对银杏酚酸含量的影响

通过单因素方差分析，如图3所示，淀粉浆浓度该因素的P < 0.01，即对结果非常显著，如图所示，在正己烷浓度从5%到15%，银杏酚酸含量逐渐减少，白果酸的极性跟接近于正己烷，并且白果酸占总银杏酚酸比例较高，故总酸含量显著降低，在浓度为15%酚酸含量降至最低；从15%~25%，由于白果粉中部分金属离子与乙醇和正己烷逐渐形成了配位化合物，正己烷的相对浓度反而下降，拟优选10%~20%范围进行后续优化。

4.2. 振动频率对降低酚酸含量的影响

先固定其他变量，洗脱温度为40℃，正己烷浓度为15%，洗脱时间为30 min，分别设置卧式振荡床转速在80、100、120、140、160 r/min，进行反应，然后通过HPLC检测白果酸含量计算出银杏酚酸的总含量。

通过单因素方差分析，如图4所示，振动频率浓度该因素的P > 0.05，即对结果不显著，振荡频率的快慢一定程度上可以改变提取的速率，然而一方面由于酚酸含量较低容易提取，一方面是在其他提取条件，如温度和正己烷浓度的影响远超振动频率的影响；根据低能效原则，在影响不显著的情况下，可以不选择进行后续优化实验。

图4. 振动频率对银杏酚酸含量的影响

4.3. 洗脱温度对降低酚酸含量的影响

先固定其他变量，振动频率为80 r/min，正己烷浓度为15%，洗脱时间为30 min，分别设置卧式振荡床保持恒温在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃进行反应，然后通过HPLC检测白果酸含量计算出银杏酚酸的总含量。

通过单因素方差分析，如图5所示，洗脱温度该因素的P < 0.01，即对结果非常显著；在洗脱温度从30℃到40℃，银杏酚酸含量逐渐减少，正常大气压下，正己烷在乙醇内的最适溶解温度为33℃，而在封闭环境下气压高于外界大气压，最适溶解温度有所上升，故提取效果变好；从40℃到70℃，由于乙醇逐渐接近沸点，正己烷的溶解性下降导致洗脱效果下降，拟优选30℃到50℃范围进行后续优化。

图5. 洗脱温度对银杏酚酸含量的影响

4.4. 洗脱时间对降低酚酸含量的影响

先控制其他变量一致，振动频率为80 r/min，正己烷浓度为15%，洗脱温度为40℃，分别设置洗脱的时间为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min进行反应，然后通过HPLC检测白果酸含量计算出银杏酚酸的总含量。

图6. 洗脱时间对银杏酚酸含量的影响

通过单因素方差分析，如图6所示，洗脱时间该因素的P < 0.05，即对结果显著，洗脱时间的长短一定程度上可以改变提取的总量，由于在一定时间后达到提取饱和故提取量不再增加，拟优选20~40 min范围进行后续优化。

4.5. Box-Behnken试验结果与分析

在单因素试验的基础上，以银杏酚酸含量(Y)为响应值，以对影响显著的3个因素正己烷浓度(A)、洗脱温度(B)和洗脱时间(C)为考察因素，Box-Behnken试验结果与分析见表1。

表1. Box-Behnken法优化脱银杏酚酸参数

运用Design expert里面的软件对表3.3中得分进行拟合，得回归方程：Y = 2.83 − 1.31*A − 0.3513*B − 0.425*C − 0.1650*AB + 0.5625AC + 0.2475BC + 2.12A² + 2.29B² + 0.8500C²，将上述回归方程进行方差分析，结果如表2所示。

表2. 响应面试验结果方差分析

注：“^*”表示对结果影响显著(P < 0.05)；“^**”表示对结果影响极显著(P < 0.01)。

由表2可知，所建立模型的P < 0.001显著；失拟项P > 0.05，不显著，表明模型具有较高可靠性；调整决定系数RAaj = 0.9865表明银杏酚酸含量的变化有98.65%来源于正己烷浓度、洗脱温度和洗脱时间；信噪比(signal-to-noise, S/N) = 32.81 > 4，也从另一个方面表明此模型是可靠的。经方差分析，3个因素对降低银杏酚酸含量影响的主次顺序为A > B > C，即正己烷浓度 > 洗脱温度 > 洗脱时间。

利用Design Expert 8.0.5软件对所得的回归方程进行逐步回归，确定最佳工艺参数正己烷含量为16.69%，洗脱温度为41.73℃，洗脱时间为28.02 min，此时银杏酚酸的含量预测值为2.29 mg/kg，小于规定的5 mg/kg，可以采用。为了便于实际操作，将最佳工艺参数修订为正己烷含量17%、洗脱温度42℃、洗脱时间30 min，在此最优条件下，银杏酚酸的总含量为2.31 mg/kg，与模型预测值(2.25 mg/kg)较一致，验证了模型的可靠性。

5. 结论

本文主要对白果粉中银杏酚酸进行脱除实验工艺参数优化，主要采用正己烷–乙醇混合溶液洗脱法进行实用化工艺尝试，获得如下结果或结论：

1) 通过预蒸煮、复合型有机“绿色”溶剂洗脱，可有效降低白果粉中银杏酚酸含量；

2) 采用响应面法获得较优条件，为满足实际生产应用，再进行工艺参数的整数修订，具体结果如下：正己烷含量17%、洗脱温度42℃、洗脱时间30 min，在此最优条件下，银杏酚酸的总含量为2.31 mg/kg；

3) 利用最优工艺参数，制备的实验样品，完全符合国家药典2020版标准对酚酸含量的限定要求，满足制药标准。

基金项目

江苏省科技项目(苏北科技专项) (编号XZ-SZ202133)、佛山市科技创新专项资金(2015IT100015)。

文章引用

康津铭,王云春,樊恩生,刘鹏程,吴泽宇,惠爱玲,张文成. 低银杏酚酸白果粉脱毒工艺优化
Optimization of Detoxification Process for Low Ginkgo Phenolic Acid in Ginkgo Powder[J]. 药物化学, 2023, 11(02): 41-49. https://doi.org/10.12677/HJMCe.2023.112007

参考文献