湖南环境生物职业技术学院医药技术学院，湖南 衡阳

收稿日期：2023年9月19日；录用日期：2023年10月13日；发布日期：2023年10月20日

摘要

目的：研究三叶青黄酮对荷肿瘤小鼠MDSCs、PGE2和COX-2的影响，以及它们在调控肿瘤免疫和逆转肿瘤免疫逃逸中的作用。方法：40只C57BL/6小鼠随机分为实验组、环磷酰胺组和三叶青黄酮高、中、低剂量组；每组8只小鼠(以下简称高，中，低)。结果：其它各组的肿瘤体积、肿瘤重量均明显低于模型组(P < 0.05)，外周血中COX-2和PGE2的水平以及脾脏中MDSCs的比例均明显低于模型组(P < 0.05)。小剂量组第8，12，14天的肿瘤体积明显大于环磷酰胺组(P < 0.05)，且外周血中COX-2和PGE2的浓度明显高于小剂量组(P < 0.0.05)，差异有统计学意义。中剂量组在第8天时，肿瘤变大，PGE2在外周血中的含量明显高于对照组(P < 0.05)；高剂量组第14天的瘤体明显缩小(P < 0.05)，与对照组比较差异有统计学意义。中低剂量组的肿瘤抑制率低于对照组(P < 0.05)，而MDSCs的比例高于对照组(P < 0.05)；结论：三叶青黄酮对肿瘤细胞有一定的抑制作用，这种抑制作用可能是通过抑制肿瘤细胞的增殖和凋亡而实现的。

关键词

三叶青黄酮，荷肺癌小鼠MDSCs，因子表达

Effect of Trifolium flavone on MDSCs Formation and Expression of Related Factors in Mice with Lung Cancer

Tianping Li, Lingzhi He, Guiping Xuan, Zhonghou Liang, Deyong Liu

Medical Technology College, Hunan Polytechnic of Environment and Biology, Hengyang Hunan

Received: Sep. 19^th, 2023; accepted: Oct. 13^th, 2023; published: Oct. 20^th, 2023

ABSTRACT

Objective: To study the effects of Trifolium flavone on MDSCs, PGE2 and COX-2 in tumor-bearing mice, and their role in regulating tumor immunity and reversing tumor immune escape. Methods: 40 C57BL/6 mice were randomly divided into experimental group, cyclophosphamide group and trifoliate flavonoid high-dose, medium-dose and low-dose groups. There were 8 mice in each group (hereinafter referred to as high, medium and low). Results: The tumor volume and tumor weight in other groups were significantly lower than those in model group (P < 0.05), the levels of COX-2 and PGE2 in peripheral blood and the proportion of MDSCs in spleen were significantly lower than those in model group (P < 0.05). The tumor volume in the low-dose group was significantly higher than that in the cyclophosphamide group at day 8, 12 and 14 (P < 0.05), and the concentrations of COX-2 and PGE2 in peripheral blood were significantly higher than those in the low-dose group (P < 0.05), with statistical significance. On the 8th day, the tumor was enlarged and the PGE2 content in peripheral blood of the medium dose group was significantly higher than that of the control group (P < 0.05). The tumor volume of the high-dose group was significantly reduced on the 14th day (P < 0.05), and the difference was statistically significant compared with the control group. The tumor inhibition rate of medium-low dose group was lower than that of control group (P < 0.05), and the proportion of MDSCs was higher than that of control group (P < 0.05). Conclusion: Trifolium flavone has a certain inhibitory effect on tumor cells, which may be achieved by inhibiting the proliferation and apoptosis of tumor cells.

Keywords:Trifolium flavone, MDSCs in Mice with Lung Cancer, Factor Expression

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1. 引言

肿瘤免疫抑制是肿瘤发生、发展、转移及复发的重要原因，已成为当前肿瘤治疗领域亟待解决的难题 [1] 。髓源性抑制细胞(MDSCs)是近年来发现的一种新型免疫抑制细胞，可激活PGE2、COX-2和IL-6，增加Treg，抑制NK细胞和T细胞的免疫功能，并诱导M2型巨噬细胞产生 [2] [3] [4] 。三叶青具有显著的抗肿瘤活性，其中黄酮类化合物是三叶青抗肿瘤的重要物质基础 [5] [6] ，张祺箐、孙倩倩等 [7] [8] 早在2017就已经证实三叶青黄酮对肺癌小鼠体内PGE2、COX-2等免疫相关因子具有一定的调节作用，但其具体机制一直未阐明。本项目拟在前期工作基础上，利用荷Lewis肺癌模型，观察三叶总黄酮对荷肺癌小鼠脾脏内MDSCs比例的影响，验证三叶青黄酮对肺癌小鼠COX-2，PGE2等细胞因子的影响与MDSCs的关系，探索三叶总黄酮在体内的抗肿瘤效应及分子机制。

2. 材料与方法

2.1. 实验动物

浙江中医药大学动物试验中心(SCXY(沪)2003-0016)提供的SPF级5周龄C57BL/6雌性小鼠40只。饲养于浙江中医药大学实验动物中心，试验用的动物执照：SYXK(苏)2015-0001，动物伦理学批准编号：IACUC-20190729-13。在恒温25 ± 2度，恒湿60% ± 5%，SPF环境下自由摄食基础饲料1周。

2.2. 实验细胞

中国科学院上海细胞所购得的小鼠原代肺癌细胞系，浙江中医药大学动物试验中心冷冻保存。

2.3. 实验药物、试剂及仪器

三叶青是从浙江省中医医院购买的，浙江中医药大学药学系对其进行了初步的临床试验。三叶青总黄酮粉按照相应的方法进行萃取，三叶青总黄酮粉按照既定的方法溶解在蒸馏水中，按照需要配置100 mg/ml、50 mg/ml和25 mg/ml的高剂量、中剂量和低剂量。环磷酰胺胶囊是从齐鲁制药有限公司购买的，规格为0.5g，5支/盒，产品质量满足试验要求。达文生物科技公司生产的COX-2和PGE2 ELISA检测工具。Ly-6G (Gr-1), CD11b单抗(美国eBioscience，Inc.)上海精宏试验器材公司生产的DK-8D电加热恒温水箱。鼓风干燥器GZX-9140MBE (上海博迅工业有限公司)美国BIO-Rad酶联免疫检测装置(BIO-Rad) FACSCanto II型流式细胞术(美国BD公司)。

2.4. 动物分组及模型制备

以40只小鼠为研究对象，随机分为高、中两组；每组8只小鼠(以下简称高，中，低)。本项目拟采用浙江中医药大学动物试验中心的Lewis细胞进行体外回输，在保证细胞数量和质量的前提下，将细胞浓度调节到1 × 10⁷个/mL，然后将0.2 mL的细胞悬浮液注入小鼠右腋下，建立荷带Lewis肺癌小鼠模型。

2.5. 给药方法

模型制备时间达24小时后，取高、中、低剂量组的三叶青黄酮0.2 mL，以100 mg/mL，50 mg/mL，25 mg/mL，每日给药。环磷酰胺组，以100 mg/ml/ml的浓度，每日口服0.2 ml。模型组以0.9%生理盐水灌胃，给小鼠喂服14天 [9] 。

2.6. 各指标检测方法

一般情况。在肿瘤疫苗接种之后，对试验动物进行常规监测，主要包括：试验动物的活动性、摄食、饮水状况，还有体重的增减情况，眼睛、被毛等异常情况。

ELISA检测小鼠血清中COX-2、PGE2含量 [10] [11] 。在灌胃14天后，从小鼠的眼球中取出血液，放入1.5 mL Ep试管，在室温下放置30~60分钟后，用3000× g离心10分钟，再用移液枪将血清提取出来，放入清洁的EP试管中，在−20℃下保存。按照标准的要求进行稀释。空白对照中仅加入显色剂A，B和终止液，不加入任何试样。将50微升的标准物质和50微升的链霉素–辣根过氧化物酶(HRP)分别放入标准物质孔中。将40微升的试样装入待测试样孔，接着分别装入10微升的抗COX-2抗体、50微升的链酶亲和素-HRP。用保鲜膜轻摇混合，37℃保温60分钟。仔细拆下封口板的薄膜，把里面的液体扔掉，然后抖落水份，在每个孔洞里注上水份；放置30秒，扔掉。重复五次。用手拍打干燥。首先将50微升的显色剂A注入到每个孔洞中，然后再将50微升的显色剂B注入到每个孔中，轻摇混合均匀后，在37℃的遮光条件下显色10分钟。加入50微升的终止溶液，在每个孔洞中(这时由蓝色从红色转变为黄色)结束反应。用无孔调零后，依次测定每个孔的吸收系数(OD)，并在45 nm处测定。检测必须在加入终止剂后10分钟之内完成。用COX-2法测定PGE2。以标准品的浓度和相应的OD值为基础，计算出标准曲线的直线回归方程，再以样品的OD值为基础，在回归方程上计算出相应的样品浓度。

取眼内血液后，将颈动脉脱位，将肿瘤完全切除，称量肿瘤重量，计算肿瘤抑制率。抑制肿瘤的比率 = (1 − 实验组肿瘤的平均重量/模型组肿瘤的平均重量) × 100%。

脾脏组织标本制备与检测。切断颈项，取脾脏，用玻璃片剂将脾脏粉碎，滤过筛子，获得细胞悬液。红血球溶解液避光溶解20分钟后，用PBS冲洗2次。PBS重悬细胞至1 × 10⁶个/100μL，将100 μL放入流式管中，取1 mL PBS液洗涤细胞2次，取100 μL PBS液重悬细胞，按照细胞表面抗原染色法法标记表面抗原，在每管加入0.5 μL Anti-MouseLy-6 G (Gr-1) FITC，0.5 μL Anti-MouseCD11b PE，4℃避光培养30 min，然后上机进行检测。1.7统计方法应用SPSS Statistics19.0对试验数据进行处理，计量数据以x ± s为单位，进行单因子变异数分析，在方差齐性的情况下，使用LSD、SNK等方法进行多组间的配对比较，使用Dunnett’sT3方法进行比较。以P < 0.05为有显著性差异。

3. 结果

3.1. 各组小鼠瘤组织体积变化比较

所有组随着时间的增加肿瘤的体积都在不断的增大，而在同一时间内其他组与模型组相比，肿瘤体积则明显缩小(P < 0.05)。小剂量组第8、12、14天的肿瘤体积比环磷酰胺组大，差异有统计学意义(P < 0.05)。中剂量组第8天，瘤体增大，与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。高剂量组第14天的瘤体明显缩小(P < 0.05)，与对照组比较差异有统计学意义(见表1)。

表1. 不同组别小鼠肿瘤的体积

3.2. 各组小鼠瘤重及抑瘤率比较

14天后，其它各组肿瘤重量均低于模型组(P < 0.05)；小剂量组的肿瘤重量明显高于环磷酰胺组(P < 0.05)。中低剂量组和低剂量组的肿瘤抑制率均低于低剂量组(P < 0.05) (见表2)。

表2. 不同组别小鼠肿瘤的重量、抑瘤率

3.3. 各组小鼠体内MDSCs比例以及COX-2、PGE2 含量比较

与模型组比较，各组MDSCs比例下降(P < 0.05)。与环磷酰胺组比较，低、中剂量组MDSCs比例较高(P < 0.05)。各组小鼠的外周血中COX-2和PGE2的水平均低于模型组(P < 0.05)，差异有统计学意义。与环磷酰胺组相比，低剂量组外周血液中COX-2和PGE2的水平显著升高(P < 0.05)，差异有统计学意义(见表3)。中剂量组外周血液中PGE 2水平显著高于对照组(P < 0.05)。

表3. 不同组别小鼠体内MDSCs比例及相关蛋白水平

4. 讨论

早在1979年，Lord等正式提出了“肿瘤微环境(Tumor micro-environment, TME)”并得到了大家广泛认可，TME指肿瘤在发生、发展过程中所处的细胞微环境，它由肿瘤细胞本身、间质细胞以及少量浸润细胞和细胞生长所需的微血管、微淋巴管、组织液、众多细胞因子等共同构成 [12] 。肿瘤微环境中炎症因子、肿瘤细胞产生的细胞因子、肿瘤间质细胞分泌Toll样受体、补体等通过不同信号通路众多途径发挥负向免疫作用。我们前期实验发现，该模型组小鼠脾内MDSCs显著上调，外周血液中COX-2和PGE2显著上调，于是猜想MDSCs在肿瘤形成过程中可能扮演非常作用的角色，并且这种角色很可能与肿瘤免疫有关。本课题拟在前期研究基础上，以三叶青黄酮与环磷酰胺联合应用，观察其对小鼠肿瘤生长、小鼠肿瘤体积、小鼠脾内MDSCs比例、外周血液内COX-2、PGE2等的影响，并进一步验证其作用机制，为临床应用提供依据。结果表明，三叶青黄酮成分在高浓度下对MDSCs和PGE2、COX-2的抑制效果与环磷酰胺类似，但在高浓度下对MDSCs和PGE2、COX-2的抑制效果略好，这一现象可能与三叶青素类成分通过多个途径发挥抗肿瘤效应相关，值得深入探讨。

基金项目

本文系2018年湖南省衡阳市科技局指导性项目《三叶青黄酮对肺癌小鼠抗肿瘤作用的研究》，(课题编号：S2018F9031018293)阶段性研究成果之一；2020年，湖南省教育厅科学研究一般项目：《基于PAA/GO/M-NP电化学传感器检测黄酮类药物的研究》(项目编号：20C0688)的研究成果；2023湖南省教育规划“十四五”规划课题《高职药学专业“产学研用创”五位一体科教融汇人才培养模式的研究》(项目编号：ND233231)的研究成果；2021年，湖南省自然科学基金项目《基于金属硫化物MxSy负载贵金属纳米粒构建电化学传感器检测残留抗生素的研究》(项目编号：221JJ50088)的研究成果；2020年湖南环境生物职业技术学院校级青年基金项目《三叶青黄酮对肺癌小鼠抗肿瘤作用的研究》的阶段性研究成果。

文章引用

李天平,贺灵芝,轩贵平,梁忠厚,刘德勇. 三叶青黄酮干预荷肺癌小鼠MDSCs生成及相关因子表达的研究
Effect of Trifolium flavone on MDSCs Formation and Expression of Related Factors in Mice with Lung Cancer[J]. 临床医学进展, 2023, 13(10): 16633-16638. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.13102328

参考文献