海南医学院第二附属医院甲乳外科，海南 海口

收稿日期：2023年4月28日；录用日期：2023年5月21日；发布日期：2023年5月31日

摘要

目的：Tubacin可以转变恶性肿瘤的胱氨酸不敏感的状态，我们研究主要目的是验证Tubacin在胱氨酸剥夺条件下处理三阴型乳腺癌细胞HCC38的实际效果，并验证细胞死亡类型是否为铁死亡。方法：将细胞株HCC38在DMSO、Tubacin、Erastin、及Tubacin联合Erastin四组条件下培养，通过7-AAD、LDH、ROS及脂质过氧化物检测细胞死亡及类型。结果：1) 在胱氨酸剥夺处理条件下加入Tubacin，HCC38细胞死亡增加；2) Tubacin联合Erastin处理HCC38，细胞死亡显著增加；3) Tubacin联合Erastin处理的HCC38，细胞脂质过氧化物显著和盘状结构域受体2增多。结论：Tubacin增敏在胱氨酸剥夺条件下三阴型乳腺癌铁死亡。

关键词

三阴型乳腺癌，细胞死亡，Tubacin，Erastin，Ferroptosis

Tubacin plus Erastin Treatment Sensitizes Cell Ferroptosis of Triple Negative Breast Neoplasms

Canzhang Wu^*, Bo Jing, Wuping Zheng, Huangfu Wu^#

Department of Breast and Thyroid Surgery, Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou Hainan

Received: Apr. 28^th, 2023; accepted: May 21^st, 2023; published: May 31^st, 2023

ABSTRACT

Purpose: Tubain can change the cystine insensitive state of malignant tumors. Our main purpose is to verify the actual effect of Tubain on HCC38 cells of triple negative breast cancer under the condition of cystine deprivation, and to verify whether the type of cell death is iron death. Methods: Cell line HCC38 was cultured under four conditions: DMSO, tubacin, erastin, and tubacin plus erastin, and cell death and types were determined by 7-AAD, LDH, ROS, and lipid peroxides. Results: 1) Addition of tubacin under cystine deprivation treatment conditions increased HCC38 cell death; 2) Treatment of HCC38 with tubacin in combination with erastin significantly increased cell death; 3) HCC38, treated with tubacin in combination with erastin, showed a significant increase in cellular lipid peroxides and discoidin domain receptor 2. Conclusions: Tubacin sensitizes iron death in triple negative breast cancer under cystine deprived conditions.

Keywords:Triple Negative Breast Neoplasms, Cell Death, Tubacin, Erastin, Ferroptosis

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1. 引言

女性恶性肿瘤是危害女性健康的重要因素，其中最为常见的是乳腺癌，化学药物治疗和手术治疗是主要诊疗方案。由于细胞分子特征存在，传统治疗方式联合靶向、免疫、内分泌治疗，对于改善乳腺癌患者生活质量，延长患者生存情况，均取得不错的疗效。但是，三阴型乳腺癌缺乏明确的雌、孕及Her-2靶标，导致相应的治疗药物缺乏，也更容易对化疗药物产生抗性，使得三阴型乳腺癌的疗效也要明显低于其他亚型的乳腺癌 [1] 。三阴性乳腺癌靶点研究及药物研发是目前亟待解决的问题。随着恶性肿瘤的分子生物学的发展和细胞内代谢特征理论的完善，学者们通过观察细胞恶变过程，并提出“代谢脆弱性”，比如，众所周知的沃伯格效应，细胞在足够多的02供给下，某些恶性肿瘤在发生有氧氧化反应的过程中，肿瘤细胞仍会出现糖酵解这一反应。究其内在原因，是因为癌细胞快速增殖过程中对葡萄糖高度成瘾性，因此，葡萄糖类似物的药物被发现可以有效地抑制对葡萄糖高敏感性的肿瘤细胞 [2] [3] 。此外，在许多因为基因突变引起的致癌性疾病当中，我们也经常观察到氨基酸代谢的紊乱，比如，原癌基因KRAS能下调GLUD的表达并上调GOT的表达，促进ME1将天冬氨酸释放到细胞质中用于生成NADPH，这有助于恶性肿瘤细胞的快速增殖，满足癌细胞对ATP、生物合成前体和还原剂的需求，因此，消耗或者抑制天冬氨酸就可实现抑制肿瘤的目的 [4] 。因此，癌细胞代谢异常和脆弱性为肿瘤的抑制创造条件，也让正面临困境的三阴型乳腺癌治疗研究有了新的转机。

2012年，Dixon的研究团队最先提出铁死亡概念 [5] ，他们认为铁死亡是一种铁离子介导，诱导活性氧生成，以过氧化脂质蓄积为特征的细胞死亡形式。近年来，它在人体多种疾病系统中，如肿瘤、心血管系统疾病等均有发现 [6] [7] 。研究发现，人体肿瘤细胞的发生发展及增殖也容易受到铁死亡的影响 [8] ，肿瘤细胞的增殖往往有铁依赖性，如：乳腺癌 [9] 、结直肠癌 [10] 、前列腺癌 [11] 。随着铁离子增多，过氧化物和活性氧积聚，这使得一些高度恶性的肿瘤细胞对于铁死亡有天然的易感性，而诱导癌细胞发生铁死亡成为治疗恶性肿瘤的新方法。因此，这也为乳腺癌的治疗提供新的思路和策略。有学者研究发现，通过抑制“system Xc-”，可引起活性氧堆积，触发癌细胞铁死亡 [12] [13] [14] 。胱氨酸谷氨酸转运体，通过转运胞外胱氨酸或转硫途径直接提供胱氨酸用于谷光甘肽的合成，用以调节细胞铁死亡。因此，许多研究者针对该转运体进行铁死亡靶向药物研究与设计，其中，Erastin是经典的铁死亡诱导剂 [15] [16] [17] ，通过直接抑制“system Xc-”发挥作用，这对不同亚型乳腺癌细胞诱导铁死亡及抑制细胞增殖均有作用。但非间充质三阴型乳腺癌细胞增殖不过分依赖胱氨酸，故Erastin对非间充质三阴型乳腺癌细胞铁死亡效果平平 [18] 。因此，我们尝试为非间充质TNBC寻找死亡增敏剂，有研究发现，Tubacin可以作为一种佐剂，改变癌细胞胱氨酸不敏感的特征 [19] [20] 。我们尝试将Tubacin加入胱氨酸剥夺处理条件下的HCC38当中，观察细胞死亡具体情况，并鉴定死亡类型是否为铁死亡，进行初步探索。

2. 材料及方法

2.1. 细胞来源及主要试剂

三阴型乳腺癌细胞HCC38细胞购自ATCC；Erastin、Tubacin购自Cayman Chemicals；7-Aminoactinomycin D (7-AAD)、DMSO购自ThermoFisher Scientific；DMEM培养基购自Hyclone；EDTA胰酶消化液购自Biosharp；PBS购自Boster、ROS探针均购自南京建成生物研究所。

2.2. 细胞活力和毒性实验

严格按照说明书，通过7-AAD染色HCC38细胞，对细胞活力进行测定。将7-AAD原液5 μl加入到在缓冲液中配成100 μl的7-AAD工作液，在培养基的96孔板中培养的HCC38细胞中，37℃孵育细胞5分钟，并使用流式细胞仪检测发光强度。严格按照说明书，使用LDH实验法，通过细胞膜破裂和释放的蛋白酶来测量细胞毒性试验。将催化液30 μl与2.25染色液Catalyst配置成可使用20次的LDH工作液，随后加入缓冲液配置成200 μl在96孔板中，随后加入HCC38细胞，在37度下孵育5分钟，微孔读板仪在490~500 nm检测所有样本的吸光值。

2.3. 活性氧的测定

按照ROS测定试剂盒的说明，将细胞与2¢，7¢-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针在黑暗中孵育30分钟。然后，在荧光微孔板下观察荧光强度。受激光波长为485 nm，发射光波长为525 nm。ROS水平(%) = 干预组/对照组的荧光值100%。

2.4. Western blot

按照制造商的方案，使用BCA测定法对蛋白质浓度进行定量。将约20 μg的蛋白质负载在8% SDS-PAGE凝胶上，转移到PDVF膜上，用含有5%脱脂乳的TBST进行封闭，与DDR2/GAPDH的一抗在4℃下孵育过夜。随后，依次进行TBST洗涤，加入相应二抗孵育，再次洗涤。最后，以相同的比例的显影配置液进行配制，随后将膜置入其中，并且曝光于曝光机上，最后将处理好的PVDF膜通过凝胶成像分析系统进行检测分析。

3. 结果

3.1. 在胱氨酸剥夺条件下加入Tubacin，HCC38细胞死亡显著增加

此前，我们已经知道，胱氨酸剥夺治疗可以有效抑制乳腺癌细胞增长，诱导铁死亡发生，但是非间充质的三阴型乳腺癌细胞增殖对胱氨酸并不过分依赖，胱氨酸剥夺对TNBC细胞抑制作用较差。然而，有研究者发现，Tubacin常常作为佐剂，改变恶性肿瘤细胞的表观遗传特征，协助靶向药物或者化疗药物，增强对癌细胞的抑制作用，尤其是存在药物抗性的癌细胞 [19] [20] 。因此，我们尝试在胱氨酸缺乏的培养基中加入Tubacin，观察细胞死亡情况。首先我们设立四组，分别在DMSO、Tub、-Cys、-Cys + Tub条件下处理HCC38，检测细胞死亡的情况。我们观察到，各组的LDH、7-AAD均不同程度增加，而在-Cys + Tub组别中，细胞死亡情况显著。有学者研究发现 [21] ，对乳腺癌进行胱氨酸剥夺处理引起癌细胞铁死亡，而这一过程中常常伴有GSH/GPX4合成减少，活性氧/羟基自由基等氧化性物质增多，因此，检测活性氧产生情况，对于鉴别癌细胞铁死亡存在一定意义。我们观察到，在-Cys、-Cys + Tub组别中，活性氧不同程度增高，而后者显著增高，见图1。

图1. 三阴型乳腺癌细胞死亡及活性氧的情况

3.2. Tubacin联合Erastin处理HCC38，细胞死亡显著增加

许多正常细胞恶变过程中，大多数都会出现氨基酸代谢异常，其中癌细胞增殖过程中的胱氨酸成瘾性的特征较为常见。在上述数据中，我们证实单独使用胱氨酸剥夺处理三阴型乳腺癌细胞的组别，细胞并没有出现明显死亡。然而，加入Tubacin后，细胞死亡则显著增加，这说明Tubacin作为佐剂，处理胱氨酸不敏感的HCC38是有效的。为了观察胱氨酸剥夺的药物性抑制剂是否可以取得同样抑制癌细胞的效果，我们尝试将Erastin取代-Cys对HCC38进行处理。我们观察到了与乏胱氨酸培养基处理癌细胞的相似结果，与DMSO、Tub相比，Era、Era + Tub组中，LDH和7-AAD均不同程度增高，活性氧也检测到相似情况，见图2。

图2. 三阴型乳腺癌细胞死亡及活性氧的情况

3.3. Tubacin联合Erastin处理的HCC38，细胞脂质过氧化物显著和盘状结构域受体2增多

尽管活性氧在鉴别细胞铁死亡类型存在一定意义，但是ROS作为验证铁死亡的标志物特异性并不高，为了进一步确定细胞死亡类型是否为铁死亡，利用C11-BODYPY探针染色四组细胞，通过流式细胞仪分析细胞当中铁死亡标志物产生情况。我们观察到，与DMSO、Era及Tub相比，Tub + Era组别脂质过氧化显著增多。此外，我们检测铁死亡重要基因表达情况，我们意外，发现盘状结构域受体2 (DDR2)升高，见图3和图4。

图3. 各组三阴型乳腺癌细胞脂质过氧化物产生的情况

图4. 各组三阴型乳腺癌盘状结构域受体2 (DDR2)产生的情况

4. 讨论

在乳腺恶性肿瘤不同类别中，TNBC是侵袭程度较高，预后较差的亚型，化疗是其重要治疗方案，其在分子代谢上诱导癌细胞发生程序性死亡 [22] 。但是，三阴型乳腺癌缺乏敏感靶点，这就导致可以使用的化疗药物有限，并且治疗效果较差，同时，在化疗过程中，TNBC患者易出现耐药性和复发，Jae Young So等人研究表明，在对部分TNBC患者持续随访过程中，发现三阴型乳腺癌患者预后差，10年内约50%患者出现复发或转移，其中约20名化疗后患者对化疗药物产生抗性 [23] 。幸运的是，乳腺癌铁死亡研究或许能改变这一情况。有研究者发现，对胱氨酸饥饿治疗可以有效抑制癌细胞增殖，并且诱导细胞的铁死亡，而这一情况在乳腺癌当中也获得了相同的效果 [24] [25] 。比如属于间充质状态的复发性乳腺癌当中高表达RIPK3可以增加对细胞外胱氨酸依赖，因此使用药物消耗小鼠内胱氨酸可以抑制乳腺癌的生长 [26] [27] 。然而，三阴型乳腺癌细胞大多数是属于非间充质的乳腺癌，其增殖和生长并不过分依赖胱氨酸，对胱氨酸饥饿的治疗没有明显反应 [28] [29] 。因此，在我们的实验当中，无论是在乏胱氨酸培养基(-Cys)或者Erastin组中，我们都没有看到TNBC细胞受到明显的抑制。但是，随着我们加入Tubacin这一佐剂后，LDH、7-AAD阳性细胞比率显著增加，这让我们确定Tubacin可以增敏胱氨酸剥夺条件下增敏三阴型乳腺癌细胞的死亡。尽管我们已经知道Erastin是一种经典的铁死亡诱导剂，而在我们上述数据中证实Tubacin可以作为一种TNBC死亡增敏剂。但是，对于Erastin联合Tuabcin引起的细胞死亡类型是否为铁死亡我们仍需要进一步检测。首先，我们检测了各组中的活性氧(ROS)的情况，Erastin致癌细胞铁死亡过程中伴随ROS的增多，因此ROS检测对铁死亡的判断存在一定价值 [30] [31] ，我们观察到-Cys、-Cys + Tub和Era、Tub + Era中ROS均不同程度的增高，联合组别中较为显著。尽管ROS的检测对癌细胞铁死亡鉴别存在帮助，但是ROS特异性不高。随后，我们进一步对各组中脂质过氧化物的产生情况进行检测。通过使用C11-BODYPY染剂和流式细胞仪，我们观察到，Tub + Era组中脂质过氧化物显著增多，这一情况符合铁死亡特征。此外，Erastin诱导癌细胞铁死亡时伴有铁相关蛋白的表达增多 [32] [33] 。并且，我们尝试检测铁死亡相关基因的表达 [34] [35] ，令人意外的是，我们观察到Era、Tub + Era组中盘状结构域受体2 (DDR2)条带增粗，这说明Tubacin联合Eratin引起的铁死亡的分子机制可能与DDR2存在联系。在我们传统的认知当中，DDR2往往在肿瘤细胞的增殖密度、转移中起到重要作用 [36] ，然而，近期有学者研究发现，DDR2、细胞密度以及铁死亡之间存在一定关联 [37] ，这为我们继续研究Tubacin联合Erastin诱导铁死亡的机制打开了新思路。在目前数据中，我们已经证实了Tubacin联合Erastin增敏了TNBC铁死亡，但是在Aldana-Masangkay等人研究中提到单独使用Tubacin处理急性淋巴细胞白血病细胞则可以诱导凋亡的发生 [38] 。因此，尽管我们确定Tubacin可以改善TNBC胱氨酸不敏感的特征并作为佐剂协助铁死亡诱导剂Erastin治疗TNBC，但是对于Tubacin联合Erastin引起细胞死亡是否只有铁死亡尚不能完全定论，这在后续实验中还需要进一步论证。总而言之，在未来的研究中，我们将继续沿着这一思路，对Tubacin、Erastin及包括铁死亡在内的细胞死亡之间联系继续进行探索。

基金项目

海南省重点研发计划(ZDYF2021SHFZ248)。

文章引用

吴灿章,敬 波,郑武平,吴煌福. Tubacin增敏在胱氨酸剥夺条件下三阴型乳腺癌铁死亡
Tubacin plus Erastin Treatment Sensitizes Cell Ferroptosis of Triple Negative Breast Neoplasms[J]. 临床医学进展, 2023, 13(05): 8741-8748. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.1351222

参考文献