黑龙江大学现代农业与生态环境学院，黑龙江 哈尔滨

收稿日期：2021年4月19日；录用日期：2021年5月20日；发布日期：2021年5月27日

摘要

目前大部分对植物氮营养和光合作用之间影响的研究表明，氮添加会引起叶片氮含量增加，使植物的净光合速率升高，过量的氮素水平则会降低光合速率。但是对叶片酶和氮添加的作用机制的研究不足。因此，本综述旨在总结氮添加对叶片酶的影响，叶片酶对光合作用影响的生理机制，以便为以后研究氮–叶片酶–光合作用相互作用的生理机制提供思路，引发思考。

关键词

氮沉降，光合作用，叶片酶，响应机制

Response of C₃ Plants Leaf Enzymes to Nitrogen Addition

Shuang Liu, Qinggui Wang^*

College of Modern Agriculture and Ecological Environment, Heilongjiang University, Harbin Heilongjiang

Received: Apr. 19^th, 2021; accepted: May 20^th, 2021; published: May 27^th, 2021

ABSTRACT

At present, most of the studies on the effects of nitrogen nutrition and photosynthesis in plants show that nitrogen addition can increase the nitrogen content in leaves and increase the net photosynthetic rate of plants, but the excessive nitrogen level can decrease the photosynthetic rate. However, the mechanism of leaf enzyme and nitrogen addition is not well studied. Therefore, the purpose of this review is to summarize the effects of nitrogen addition on leaf enzymes and the physiological mechanism of leaf enzymes on photosynthesis, so as to provide ideas for the future study of the physiological mechanism of nitrogen-leaf enzyme-photosynthesis interaction.

Keywords:Nitrogen Deposition, Photosynthesis, Leaf Enzyme, Responding Mechanism

Copyright © 2021 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

随着人类社会的进步与工业的迅猛发展，能原材料燃烧及化学氮肥施用等导致了大气中含氮化合物增多 [1]，例如，氨气、二氧化氮、硝酸、铵态氮、硝态氮、HONO等 [2] [3]。中国是世界上最大的发展中国家，氮沉降量增加迅速，目前中国已经是世界上氮沉积量最高的三个地区之一。在过去的30年里，这一数字增长了大约60% [4]。虽然氮沉降可以让植物获得更多的氮营养，但其带来的负面影响不容小觑。长期的氮沉降可导致土壤酸化，植物多样性破坏，富营养化与氮饱和，光合作用减弱等 [5] [6]。植物在碳同化的同时，会把太阳能转换成化学能，将化学能储存在其产物中，这样的化学能除了供给植物自身营养和全部异养生物之外，更重要的是可作为人类的重要能量来源。光合作用可吸收CO₂释放O₂，因此还可以稳定大气中的CO₂和O₂含量 [7]。

在光合同化碳素的途径中，最基本的同化途径便是C₃途径，又称作卡尔文循环 [7]。C₃途径是一系列酶促反应，参与反应的酶有许多，其中核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)在许多C₃植物的叶片中蛋白质含量最高，是卡尔文循环的关键酶之一 [7]。由此可见，完成光合作用的过程，离不开其有关酶的贡献。因而，研究氮素营养和叶片酶与光合作用之间的响应机制尤为重要。

2. 国内外研究进展

2.1. 氮素与光合作用研究进展

Claussen & Lenz [8] (1999)，提出在NH⁴⁺营养条件下，植物叶片中的NH⁴⁺积累引起光合磷酸化过程中的电子传递在叶绿体中断裂，从而导致光合速率的下降。NakajiT等 [9] (2001)研究表明，在一定范围内，氮沉降会增加叶绿素含量及Rubisco的浓度和活性，从而使光合速率增加。当氮沉降过量后植物体内养分的平衡会被破坏，而养分失衡会对光合作用有不好的影响。李德军等 [10] (2004)研究发现，通过模拟氮沉降，中氮处理对三种幼苗的光合作用有促进作用，而高氮处理则对光合作用不利。张蕊等 [11] (2013)，通过模拟氮沉降研究对不同种源木荷幼苗叶片生理及光合特性的影响，发现在一定范围内，氮增加会引起叶片叶绿素含量、光合酶的浓度和活性增加，从而使光合速率增加。李红梅等 [12] (2014)，将NH₄NO₃作为外加氮源去模拟氮沉降，试验结果发现，随氮水平的增加，墨西哥柏幼苗的净光合速率先升高后降低。

2.2. 氮素与叶片酶研究进展

John R. Evans [13] (1989)研究发现，氮含量与Rubisco和叶绿素均有较强的线性关系。随着单位叶面积氮素含量的增加，在类囊体中叶片总氮量的占比保持不变，而可溶性蛋白质的占比增加。曹翠玲等 [14] (1999)提出，氮素水平及氮形态对作物的光呼吸强度包括乙醇酸氧化酶有明显的影响；氨基酸对硝酸还原酶参与的某一阶段(可能是吸收、硝酸分布或酶的合成)有显著影响，但对酶的代谢却没有影响。曹翠玲等 [15] (2004)表明，不同形态氮素使植物光合速率会有显著不同的最根本原因可能是，不同氮素的形态会使核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的活性与含量发生不同的改变。在过氧化物酶体中,乙醇酸经乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase)催化会形成乙醛酸和过氧化氢 [17]，产生的H₂O₂被过氧化氢酶降解为H₂O和O₂ [16]。Martin, W. F. & Cerff, R. [18] (2017)研究指出，植物细胞的叶绿体和胞质溶胶分别与Calvin循环和有3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)参与的糖酵解过程有许多平行的生化反应。Arnold J. B. & Kyle M. L [19] (2018)研究表明，植物蛋白质浓度不仅取决于叶绿体中二氧化碳和氧的相对浓度，而且取决于镁和锰的相对活性。Tobias & Jan [20] (2018)提出，随着大气中O₂浓度的上升，Rubisco为了区分CO₂和O₂，降低了催化速率。Florian A. B.等 [21] (2018)认为，碳和氮代谢在光呼吸途径中的整合会导致二氧化碳同化率的增加，从而抵消光呼吸对光合作用的不利影响，光呼吸代谢可能有一定的好处。

2.3. 科学问题

基于这些文献所论述内容可见，氮素在一定范围内对光合作用、叶绿素及酶浓度和活性有促进作用，过了一定范围后有使之降低的趋势；部分研究了光呼吸和某些酶之间的相互影响；酶的浓度可能与某些离子相对活性有关，但对于氮素、酶、光合作用之间相互的影响机理研究不足。因此，探讨氮素对酶的作用机制和酶对植物光合作用的作用机制是一个非常重要且有意义的科学问题。

3. 核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)

3.1. Rubisco的结构

在卡尔文循环这一系列酶促反应中，核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)是最关键的酶(图1)。大多的Rubisco都有8个大亚基(L)和8个小亚基(S)。Rubisco的大亚基由N、B和C三个结构域组成。N结构域从N端开始包含了137个氨基酸残基，并含有5股β折叠。B、C结构域多为α螺旋，且C结构域是一个α/β桶状的结构，包括8个平行的α螺旋和8个β折叠以及连接这两者的8个环。一个大亚基的羧基末端的α/β桶状区域与另一个大亚基的氨基的末端区域构成了活性中心，并有Mg²⁺参与，活性中心和酶的三个氨基酸残基发生作用。小亚基远离活性中心，可以调控Rubisco的加氧酶的活性 [22]。

图1. 植物核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶结构图

3.2. Rubisco的类型

按照Rubisco大亚基氨基酸序列同源性及空间结构的相似性来划分的话，可以将其分为4个类型，即I、II、III、IV型。I型它存在于细菌和真核生物的叶绿体间质中。它是一个十六进制，包含八个相同的大亚基，呈L₈S₈的结构每个都有一个金属结合位点 [22]。II型Rubisco由2~8个大亚基组成，呈L_2n的结构，与I型的大亚基大约有30%的同源性。多数存在于一些细菌和海产甲藻中 [23] [24]。III型也仅由大亚基组成，呈L_X结构，存在于某些嗜热古生菌中。IV型又称为Rubisco类似蛋白，存在于非光合细菌、部分不依赖卡尔文循环的光合细菌和古生菌中 [25] [26] [27]。

3.3. Rubisco的功能

Rubisco是一个双功能酶，它既能在卡尔文循环中催化RuBP的羧化反应，同时又能在光呼吸中催化RuBP的加氧反应 [28]。一般的C3植物中Rubisco的这种加氧反应几率超过20%，因为光呼吸是耗能高的反应，它花费3.5ATP和2NADPH用于Rubp氧化和再生，但不产生糖的任何净生产 [29]。它消耗了光合产物并且不产生糖，因此光呼吸被认为是无用的循环 [30] [31]。

许多研究已证实，O₂是Rubisco羧化反应的竞争性抑制剂，而CO₂是Rubisco加氧反应的竞争性抑制剂。光合作用(光合碳还原)和光呼吸(光合碳氧化)两个方向相反但又相互连锁的循环反应。Rubisco同时处于两个反应中，是两者的交叉点。若CO₂浓度与O₂浓度的比值较高，此时会促进Rubisco羧化功能，光合作用会得到促进。这一过程为羧化反应一般分为5个阶段，即烯醇化、羧化、水合、C-C键断裂、质子化。Rubisco催化游离的CO₂，使其共价结合到底物RuBP上，得到两分子的3-磷酸甘油酸，推动了C₃循环。若CO₂浓度与O₂浓度的比值较低，此时会促进Rubisco加氧功能，光呼吸会得到促进，RuBP将裂解生成的磷酸乙醇酸会进一步分解成乙醇酸和磷酸，参与叶片的光呼吸循环 [7]。

Rubisco的羧化和氧化反应之间的平衡取决于几个因素。第一个因素是进入Rubisco活性部位的CO₂和O₂的相对数量。第二个因素是Rubisco对每种气体的特异性。第三个因素也是一个通常被忽略的因素，就是Rubisco与Mn²⁺或Mg²⁺结合的程度 [32]。当Rubisco与Mn²⁺结合时，羧化和氧化以相似的速度进行，Mn²⁺在每一次氧化中都转移了一个电子 [33] [34] [35]；当Rubisco与Mg²⁺结合时，羧化的速度比氧化快四倍，但是没有电子被转移 [36]。RuBP与Mn²⁺结合的I型Rubisco氧化时，普遍的观点认为RuBP氧化过程中释放出的热(−319 kJ mol⁻¹)以废热的形式消散 [37]。

4. 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)

4.1. GAPDH的结构

在叶绿体中，光合GAPDH有两个亚基，即GAPA和GAPB。光合GAPDH可以利用NADH和NADPH作为辅酶，且优先利用NADPH，催化C₃循环促进CO₂的固定。不同于糖酵解的GAPDH的是，光合的GAPDH是细微的复杂的调控并且包含超分子复合物的形成。

植物叶绿体起源于蓝藻，所以光合GAPDH与蓝藻的GAP2是同源蛋白。在卡尔文循环中，GAP2会优先参与糖酵解的逆过程。与糖酵解GAPDH不同的是GAPA在卡尔文循环中对NAPDH有专一性。CP12是松散蛋白质复合体，由GAPDH以及PRK构成。作为陆地植物特有的GAPA的同源蛋白，GAPB的羧基端比起GAPA延长了30个氨基酸左右，而这些延长出的氨基酸与CP12调节酶同源。CP12负责在光暗周期中调节光合GAPDH。

一部分光合真核生物的GAPDH都是由4个亚基形成，例如细蓝藻。还有的光合生物比如，在菠菜中，它是由A和B按一定比例或形成A₂B₂，或形成A₈B₈。在序列上尽管A和B很相像，但是B延长了一个独特的羧基末端。因此，杂聚肽(A₂B₂, A₈B₈)是互相转变的，并且自动调节过硫氧化蛋白，吡啶核苷酸，ATP和GAPDH亚基和1,3-二磷酸甘油酸。而A₄聚合体因为不具有B的特殊结构，所以其活性需要通过复合体CP12作为转换站来调节。在无光条件下CP12是氧化的，会在内部形成两个二硫化物的纽带，这个纽带会把GAPDH和PRK结合起来形成超分子复合体。最后，每两个GAPDH和两个CP12/PRK二聚体会构成GAPDH-CP12-PRK复合体，将四个单体互相关联，在嵌入到复合体中时GAPDH的活性会被强烈地抑制。而在光照条件下，过硫氧化蛋白会通过释放GAPDH和PRK调节CP12，这时被分离出来的GAPDH会恢复它所有的活性，这时GAPDH再与NAPDH特异结合，促进3-磷酸甘油醛脱氢氧化磷酸化产生1,3-二磷酸甘油酸 [38]。

4.2. GAPDH的功能

植物细胞的叶绿体和胞浆分别与卡尔文循环和糖酵解有许多平行的生化反应 [39]。甘油酸-3-磷酸被ATP磷酸化，在甘油酸-3-磷酸激酶催化下，形成甘油酸-1,3-二磷酸(DPGA)，然后在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作用下被NADPH⁺还原，形成甘油醛-3磷酸(PGAld) [28]。通常除了GAPDH参与糖的利用中作为糖酵解的关键酶，叶绿体GAPDH也是加尔文循环光合固碳的重要的酶 [40]。

5. 果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)

5.1. FBPase的类型

植物中功能性的FBPase包括两种类型，一种为细胞质FBPase (cytosolic FBPase, cy FBPase)，与酵母FBPase作用相同，是糖异生途径的关键酶，同时也被认为是蔗糖生物合成的关键酶,其表达和活性受到光照和干旱等环境因素的影响 [41]。另一种类型是叶绿体FBPase(chloroplast FBPase, cp FBPase)，它定位于类囊体基质中，其催化的FDP与F-6-P之间的转化是卡尔文循环及淀粉生物合成途径的组成部分，因此也是绿色植物实现其自养功能的重要一环 [42]。研究发现，硫氧还蛋白(thioredoxin, TRX)以及光照引起的pH和Mg²⁺浓度的变化能够调节cp FBPase活性 [43]。而后又在草莓中分离出一种新型的叶绿体FBPase-cp FBPase II，它不受硫氧还蛋白的激活，已被证实可补充酵母细胞中FBPase的缺失和非发酵碳源的生长缺陷，但对底物的亲和力较低 [44]。

5.2. FBPase的功能

绿色植物通过光合作用将大气中CO₂首先固定成磷酸三碳糖,而叶绿体中的磷酸三碳糖有两种用途：一是送转到细胞质中合成蔗糖，二是在叶绿体中转变成淀粉。细胞质型FBPase和叶绿体型FBPase分别是蔗糖和淀粉合成的关键酶，叶绿体FBPase同时还是卡尔文循环的关键酶，因此这两种FBPase在光合碳同化和分配过程中起重要作用。

研究表明，改变叶绿体FBPase表达水平对植物的光合作用和淀粉及可溶性糖的分配都有着重要影响。利用反义RNA技术降低了拟南芥叶绿体FBPase的表达量，从而使植物中蔗糖含量提高，同时氮代谢也发生了改变 [45]。在其基因功能完全敲除的突变体中，光合作用和CO₂固定速率等许多过程都受到影响，突变体比野生型明显生长迟缓；胞质型和叶绿体型FBPase的双突变体则表现为叶绿体FBPase突变体的表型 [46]。叶绿体FBPase的不同表达量对光合碳同化产生不同的影响：当叶绿体FBPase的活性被抑制20%以内会促进光合作用和碳同化，而被抑制80%以上将会对植物造成伤害 [47]。叶绿体FBPase的活性受f型及m型硫氧还蛋白调节 [48] [49]。

6. 光呼吸和乙醇酸氧化酶(GO)

6.1. 光呼吸

植物光合用碳代谢包括两种途径：还原性光合用碳循环(也被称为卡尔文循环)和氧化性光合用碳循环(即光呼吸 [50] )。光呼吸过去被认为是一种潜在的浪费过程，限制了植物的生产力，因为C₃植物在正常情况下可能会对光合作用固定的碳的25%进行光固化 [51] [52]。到目前为止，已经提出了两个假设来解释这些不同光呼吸突变体光合抑制的机制 [50]。第一，光呼吸碳循环和/或氮再同化的损害导致C₃循环中间体和光合蛋白的耗竭，导致光合抑制。第二，光呼吸途径的破坏导致代谢物的积累，这将抑制卡尔文循环 [53]。近年来研究的证据似乎更好地支持了第二种观点，因为据观察，当某些不同的光呼吸酶被破坏时，这些下游代谢物并没有明显的耗尽 [54] [55] [56] [57]。此外，Chastain和Ogren (1985年，1989年)进行的一系列研究表明，乙醛酸盐的积累，而不是其他代谢物降低Rubisco激活水平的主要效应物，从而导致光合抑制 [57] [58]。许多研究还表明，无论是在其钝化形式还是在分离的叶绿体中，乙醛酸盐能够有效地灭活Rubisco [58] - [64]。光呼吸途径在两个方面与氮同化有着内在的联系：第一，通过与氨重化相关的能量需求；第二，通过新氮的还原和同化，新氮通常以 ${\text{NO}}_3^{-6}$ 的形式进入叶片 [65]。氮在C₃植物叶片中的同化可以通过光呼吸途径发生，在光合组织中，这一途径被认为是丝氨酸的主要来源，丝氨酸是其他几种氨基酸的前体 [66]。光呼吸的一个关键步骤是随着CO₂和氨的释放，甘氨酸转化为丝氨酸。释放的CO₂中有许多是从叶片中排出的，因此代表了C₂的损失，而氨的回收在能量上是昂贵的，因为它需要ATP和减少铁氧还蛋白 [67]。光呼吸也被认为是浪费的，因为在加氧酶反应过程中，O₂与CO₂竞争Rubisco活性中心，消耗RuBP，降低净碳同化的能量效率 [68]。通常，在25℃的叶片温度下，光呼吸系统CO₂的释放速率约为ATP的15%~20% [69]。之前这些研究已经导致了一个被广泛接受的观点，即光呼吸抑制了碳的增加，从而阻碍了生长和产量。然而，虽然在一定程度上有抑制作用，但光呼吸代谢也可能有益；例如，光呼吸消耗还原剂(每个氧合反应消耗4个电子)，因此是过量能量耗散的一个重要形式 [70]。

6.2. 乙醇酸氧化酶(GO)

乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase, GLO/GOX)作为光呼吸过程中的关键酶之一，主要存在于叶片的过氧化物酶体，氧化乙醇酸产生乙醛酸和过氧化氢(H₂O₂)。植物在生长发育过程以及胁迫条件下均能产生H₂O₂，并可以自发地被歧化或者在过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，形成H₂O和O₂ [71]。当H₂O₂过度积累而不能及时清除，H₂O₂将跨过生物膜并在膜外金属螯合物的作用下生成有害的·OH，借助远距离运输，造成氧化损伤。而光呼吸产生的H₂O₂含量占植物H₂O₂含量的70%以上，因此GLO催化产生的H₂O₂能在信号物质抗性调控中起重要作用 [72] [73] [74]。

7. 讨论

卡尔文循环是光合碳固定的起始反应步骤，为了不使卡尔文循环的中间物处于缺乏状态，必须使消耗和再生之间维持平衡，要想达到这种平衡就需要参与卡尔文循环的一些关键酶的活性必须受到精确的调控，尤其是一些酶的活性，比如，Rubisco、GAPDH和FBPase等 [7]。

陈锦强等的试验证明，在适宜的范围内，氮素水平提高，黄麻的光合速率升高。但氮素过高，光合速率降低 [75]。Evans研究发现，小麦叶片含氮量增加，CO₂同化速率增加。但超过一定值时，碳同化速率降低 [76]。这些研究表明，在一定氮素浓度范围内，随着光合部位的氮增加，光合速率总的呈上升趋势。在超过一定氮素浓度范围后，光合速率下降。因此，在超过一定氮水平后光合速率降低的可能原因是氮添加影响了参与卡尔文循环重要阶段的酶的活性，导致光合速率降低。

7.1. 氮添加影响了Rubisco的活性和光呼吸

Rubisco属于光调节酶，受Fd-Td系统调节。光调节酶中含有二硫键(-S-S-)，当被还原为2个巯基(-SH)时表现活性。光驱动的电子传递能使基质中Fd还原，进而使Td (硫氧还蛋白)还原，被还原的Td又使光调节酶等靶酶上相邻的半胱氨酸上的二硫键打开变成2个巯基，使靶酶活化。在暗中则相反，巯基氧化形成二硫键，酶失活 [7]。Claussen & Lenz [8] (1999)提出在NH⁴⁺营养条件下，植物叶片中的NH⁴⁺积累引起光合磷酸化过程中的电子传递在叶绿体中断裂，从而导致光合速率的显著下降。Nakaji T等 [9] (2001)研究表明，在一定范围内，氮沉降增加引起Rubisco的浓度和活性及叶绿素含量增加，从而光合速率增加。但是，过量的氮沉降对光合作用不利。由此可见，氮素增加过了一定程度会导致光合速率下降的原因可能是由于随着氮素增加，NH⁴⁺增多，引起光合磷酸化过程中的电子传递在叶绿体中断裂，巯基被氧化形成二硫键，丢失半胱氨酸残基，使活性下降，导致光合作用下降。亦或是氮素过高，Rubisco的加氧作用升高，促进了有乙醇酸氧化酶参与的光呼吸，抑制了卡尔文循环，使光合速率降低。

7.2. 氮添加影响了GAPDH的活性

3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)在光合作用的还原阶段第二步起作用，其中需要有ATP和NADPH的参与，并基本完成光合作用还原储能过程 [7]。随着光合部位氮素含量增加，氮同化得到了加强。氮同化增强后，就会与光合碳同化竞争抢夺光合作用光反应产生的ATP和NADPH(还原型辅酶II) [14]。超过一定氮浓度范围后，参与卡尔文循环的ATP和NADPH慢慢被氮同化抢夺，使3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的活性下降，还原作用降低，最后导致光合碳同化速率降低。

7.3. 氮添加影响了FBPase的活性

在一定范围内，氮添加使光合速率升高 [9]，其产物的蔗糖也会随之增多。在超过一定氮水平后，卡尔文循环的关键酶活性下降 [77]，过多的光合产物蔗糖会使光合作用受到抑制，进而导致光合速率降低，因而果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)的活性降低 [78]。

8. 展望

作为植物叶中主要含氮有机物之一，叶片酶必然与植物中氮素的吸收、利用及循环有着密切关系。大多关于光合作用的研究认为，大多数植物的光呼吸途径以余热的形式消散了30%以上的光合产物，而这一循环却是徒劳的 [7]。这是因为大多数植物已经到了进化的死胡同。植物体内的叶片酶可否被改造成减少参与光呼吸途径或者将光呼吸的途径改造为不利用光合作用的产物，有待进一步研究。

文章引用

刘 爽,王庆贵. C₃植物叶片酶对氮添加的响应
Response of C₃ Plants Leaf Enzymes to Nitrogen Addition[J]. 世界生态学, 2021, 10(02): 320-330. https://doi.org/10.12677/IJE.2021.102038

参考文献