¹聊城市第二人民医院神经外科，山东 聊城

²滨州医学院附属医院神经外科，山东 滨州

³聊城市第二人民医院急诊科，山东 聊城

收稿日期：2024年4月29日；录用日期：2024年5月21日；发布日期：2024年5月29日

摘要

目的：胶质瘤是人类中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，胶质瘤病人预后差、生存期短，寻找新的诊疗靶点以提高胶质瘤早期诊治率，改善胶质瘤患者预后，延长生存期，是目前临床亟待解决的问题。方法：在本研究中，我们从胶质瘤基因组图谱数据库中下载LncRNAs表达谱，通过R语言基因芯片分析技术筛选出胶质瘤中差异表达的LncRNA，通过LncRNA芯片(Agilent-045997 Arraystar human LncRNA microarray V3)对5例正常脑组织及5例胶质瘤组织中LncRNA的差异表达情况进行检测，选取差异表达最显著的LncRNA。随后，我们利用逆转录定量聚合酶链反应(RT-PCR)技术对63例患者差异基因的表达情况进行检测，分析其与胶质瘤临床病理特征及预后的关系。结果：通过聚类分析，我们发现LncRNA-TSIX是胶质瘤中表达差异最显著的LncRNA。RT-PCR结果发现胶质瘤中LncRNA-TSIX的表达量较正常组织显著下调，且在不同级别胶质瘤组织中表达量逐级下调，差异具有统计学意义(P < 0.01)。临床特征相关性分析显示LncRNA-TSIX与胶质瘤的恶性程度(WHO分级)密切相关。生存分析显示LncRNA-TSIX的低表达或表达缺失的患者预后更差。结论：胶质瘤组织中LncRNA-TSIX的表达与胶质瘤的进展及预后密切相关，有望成为协助胶质瘤诊断、治疗和预后方面的关键分子。

关键词

胶质瘤，LncRNA-TSIX，基因芯片分析技术

Relationship between the Expression of LncRNA-TSIX and Clinicopathological Characteristics and Prognosis in Glioma Tissue

Jinke Ding¹, Kai Xia¹, Chenglong Li², Qian Zhang^3*

¹Department of Neurosurgery, The Second People’s Hospital of Liaocheng, Liaocheng Shandong

²Department of Neurosurgery, Binzhou Medical University Hospital, Binzhou Shandong

³Department of Emergency, The Second People’s Hospital of Liaocheng, Liaocheng Shandong

Received: Apr. 29^th, 2024; accepted: May 21^st, 2024; published: May 29^th, 2024

ABSTRACT

Objective: Glioma is the most common malignant tumor in the human central nervous system. Glioma patients have poor prognosis and short survival. Searching for new diagnostic and therapeutic targets to improve the early diagnosis and treatment rate of glioma, improve the prognosis of glioma patients, and extend their survival time is an urgent clinical problem to be solved. Methods: In this study, we downloaded the expression profiles of LncRNAs from the glioma genome atlas database. Differentially expressed LncRNAs in glioma were screened using R language gene chip analysis technology. An LncRNA microarray (Agilent-045997 Arraystar human LncRNA microarray V3) was used to detect the differential expression of LncRNAs in 5 normal brain tissues and 5 glioma tissues, and the most significantly differentially expressed LncRNA was selected. Subsequently, we used reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) technology to detect the expression of the differentially expressed gene in 63 patients and analyze its relationship with the clinicopathological characteristics and prognosis of glioma. Results: Through cluster analysis, we found that LncRNA-TSIX was the most significantly differentially expressed LncRNA in glioma. RT-PCR results showed that the expression of LncRNA-TSIX in glioma was significantly downregulated compared with normal tissues, and its expression gradually decreased in different grades of glioma tissues, with statistically significant differences (P < 0.01). Clinical feature correlation analysis showed that LncRNA-TSIX was closely related to the malignancy of glioma (WHO grade). Survival analysis showed that patients with low expression or absence of LncRNA-TSIX had worse prognosis. Conclusion: The expression of LncRNA-TSIX in glioma tissues is closely related to the progression and prognosis of glioma, and is expected to become a key molecule in assisting the diagnosis, treatment, and prognosis of glioma.

Keywords:Glioma, LncRNA-TSIX, Gene Chip Analysis Technique

Copyright © 2024 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

胶质瘤(Glioma)是人类中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，复发率和死亡率较高。根据胶质瘤组织学分类及肿瘤恶性程度，WHO将其划分为I~IV级 [1] 。虽然近年来胶质瘤的诊疗策略有了明显的提高，但由于胶质瘤细胞对放、化疗表现出较高的耐受性，加之其极具组织侵袭性，常常浸润正常脑组织，极大地增加了手术切除的难度，直接导致了该病预后差、总体生存期短的现状 [2] 。即便接受规范系统的放化疗的II级胶质瘤患者，其中位生存时间也只有约13.3年，中位无进展生存时间只有约10.4年；尤其是胶质母细胞瘤(Glioblastoma，WHO IV级)患者，其平均生存期只有大约15个月 [3] 。因此，有必要寻找与胶质瘤发生发展相关的新的分子机制，探讨治疗胶质瘤的有效诊疗靶点。

长链非编码RNA (Long non-coding RNA, LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸且基本无蛋白质编码功能的内源性转录本，在表观遗传水平以及转录和转录后水平等方面调控基因的表达，参与机体内多种生物学过程，与人类多种疾病的发生发展密切相关 [4] 。有研究报道，LncRNA可以通过调控肿瘤相关基因的表达、调节肿瘤相关通路，在包括胶质瘤在内的多种恶性肿瘤的发生发展过程中发挥促癌或抑癌的作用，其中肺腺癌转移相关转录本1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT-1)、家族分子母源性印迹基因19转录因子(Familial molecular maternal imprinted genes and transcription factors, H19)、Hox转录反义RNA (Hox transcript antisense RNA, HOTAIR)以及核富集转录体1 (nuclear enriched abundant transcript 1, NEAT1)在胶质瘤中过表达，通过不同通路促进胶质瘤细胞增殖和转移；而作为抑癌基因的母系表达基因3 (maternally expressed gene 3, MEG3)、生长停滞特异性转录本5 (growtharrest-specific transcript 5, GAS5)等，在胶质瘤内表达下调，从而诱导细胞周期停滞，抑制肿瘤细胞增殖，并增强肿瘤细胞凋亡 [5] [6] 。

目前仍有很多与胶质瘤发生发展密切相关的LncRNA分子亟待被发现，本研究旨在通过基因芯片技术筛选出新的胶质瘤相关LncRNA分子，以期寻找新的诊疗靶点，提高胶质瘤早期诊治率，改善胶质瘤患者预后，延长生存期，为以后胶质瘤诊疗及预后带来新的希望。

2. 资料与方法

2.1. 一般资料

纳入所有于2015年1月至2018年12月间在滨州医学院附属医院神经外科行胶质瘤切除术的63例患者，其中：男性30例，女性33例；年龄介于31~80岁之间，≤55岁者22例，>55岁者41例；肿瘤直径 ≤ 5 cm者37例，肿瘤直径 > 5 cm者26例；肿瘤发生部位，额叶15例，顶叶25例，颞叶17例，其他部位6例；I~IV级胶质瘤组织标本分别10、21、18、14例。另选取10例来源于脑出血患者必须切除的正常脑组织作为正常对照。所有患者资料完整，术前均未接受放化疗，且无其他肿瘤疾病。

收集手术切除的胶质瘤组织，迅速转移至液氮保存。所有手术标本均由我院两位病理科专家按照2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准进行评估分级。

本研究经滨州医学院附属医院伦理委员会批准，所有标本的收集均已取得患者及家属的知情同意。

2.2. 主要试剂和设备

TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit (Takara，日本)、PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara，日本)、TB Green® Premix Ex Taq^TM II (Tli RNaseH Plus) (Takara，日本)、CFX96 Real-Time PCR Detection System (BIO-RAD，美国)。Agilent-045997 Arraystar human LncRNA microarray V3

2.3. 芯片分析LncRNA表达

使用Agilent-045997 Arraystar human LncRNA microarray V3分析5例胶质瘤标本及5例正常脑组织标本中的LncRNA的表达情况。芯片数据结果用DNAstar软件(Lasergene)进行，差异基因的筛选及热图通过R软件分析，GO功能聚类分析通过DAVID在线分析工具进行。

2.4. 实时荧光定量PCR检测不同级别胶质瘤组织和正常脑组织中LncRNA-TSIX的表达量

使用实时荧光定量PCR检测所有患者胶质瘤组织和正常脑组织中LncRNA-TSIX的表达量，步骤如下：取40 mg待检组织，按照TaKaRaMiniBEST通用RNA提取试剂盒操作说明提取总RNA，利用NanoDrop 1000测定RNA浓度及纯度，以吸光度比值A260/A280和A260/A230接近2.0为准。利用PrimeScript^TM RT试剂盒建立10 uL体系进行去除基因组DNA反应，然后采用TB Green qPCR法建立20 uL体系完成反转录反应，反转录条件：37℃ 15 min，85℃ 5 sec，4℃。应用TB Green® Premix Ex Taq^TM II试剂盒建立25 uL反应体系在CFX96 Real-Time PCR Detection System下完成Real Time PCR反应，每个标本设置3个平行样，扩增条件：Hold stage为95℃ 30 s；Cycling stage为95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；Melt stage为95℃ 10 s，65℃ 5 s，95℃ 5 s。以GAPDH作为内参，所用引物序列：RNA-TSIX上游引物：5’-CTCTAAGCCAGACCAATGAGCAA-3’，下游引物：5’-GAATCCCCCAAATCACTTCCTCA-3’；GAPDH上游引物：5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’，下游引物：5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。进行3次独立实验。LncRNA-TSIX的相对表达量以2 − ΔΔCt (ΔΔCt = (Ct试验组基因 − CtGAPDH) − (Ct对照组基因 − CtGAPDH))表示，以中位数划分其表达量的高低。

2.5. 随访

对63例患者采取电话和门诊复查的方式进行随访，随访内容包括一般情况、临床症状和影像学检查，首次随访时间为病理活检日期，末次随访时间为2019年9月1日，筛选术前治疗方案基本一致且排除非胶质瘤原因死亡的患者，最后共收集了38符合条件且具有完整随访资料的病例，对所收集的生存资料进行统计分析，探讨LncRNA-TSIX的差异性表达与胶质瘤临床病理特征及预后的关系。

2.6. 统计学方法

应用GraphPad Prism 5.01统计软件对数据进行统计学分析。RT-PCR测得数据以Mean ± SEM表示，组间比较采用两独立样本非配对t检验。应用χ²检验统计LncRNA的表达水平与肿瘤临床特征的相关性。采用Kaplan-Meier分析法分析LncRNA-TSIX的表达与患者生存时间及预后的关系。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 芯片分析LncRNA表达

我们通过LncRNA芯片(Agilent-045997 Arraystar human LncRNA microarray V3)分析5例正常脑组织及5例胶质瘤组织中LncRNA的差异表达情况。以Fold change绝对值大于4及P < 0.05作为筛选条件筛选差异表达的LncRNA，通过聚类分析，差异表达最显着的LncRNA如图1(a)和图1(b)所示。其中LncRNA-TSIX差异表达最为明显。

3.2. LncRNA-TSIX在不同级别胶质瘤组织和正常脑组织中的表达量

I~IV级胶质瘤组织及正常脑组织中LncRNA-TSIX的相对表达量分别为0.3686 ± 0.0465、0.1530 ± 0.0185、0.0547 ± 0.0099、0.0060 ± 0.0014、1.0000 ± 0.0264 (图2)；LncRNA-TSIX在各级别胶质瘤组织表达水平较正常脑组织明显降低，差异具有统计学意义(P < 0.01)；且在不同级别胶质瘤组织中表达量逐级下调，差异具有统计学意义(P < 0.01)。

3.3. LncRNA-TSIX的表达与胶质瘤临床特征的相关性分析

以LncRNA-TSIX相对表达量的中位数(0.0813)将63例胶质瘤组织划分为高表达组和低表达组。分析结果显示LncRNA-TSIX的表达量与胶质瘤组织WHO分级呈显著相关(P < 0.0001)，与患者的性别、年龄、肿瘤大小和肿瘤结节数量均无明显相关性(表1)。

图1. 胶质瘤组织芯片分析。(a) 芯片分析胶质瘤标本及正常脑组织标本中差异表达LncRNA热图。红色代表上调基因，绿色表达下调基因。(b) 芯片分析火山图，|Fold change| > 4且P < 0.05

图2. LncRNA-TSIX在各组织标本中的相对表达量。各级别胶质瘤组织与正常脑组织中LncRNA-TSIX表达的比较(与正常脑组织相比，aP、bP、cP、dP均 < 0.01)；LncRNA-TSIX在IV级胶质瘤组织表达水平较III级胶质瘤组织明显降低(P < 0.01)；LncRNA-TSIX在III级胶质瘤组织表达水平较II级胶质瘤组织明显降低(P < 0.01)；LncRNA-TSIX在II级胶质瘤组织表达水平较I级胶质瘤组织明显降低(P < 0.01)

表1. LncRNA-TSIX的表达与胶质瘤临床特征的关系

3.4. 基于LncRNA-TSIX表达的胶质瘤患者Kaplan-Meier分析

随访期间(1700 d)，经筛选后63例患者中共收集到38符合条件且具有完整随访资料的病例，其中低级别胶质瘤(I、II级)病例23例，其中LncRNA-TSIX低表达组5例，3例死亡，高表达组18例，4例死亡；高级别胶质瘤(III、IV级)病例15例，其中LncRNA-TSIX低表达组11例，7例死亡，高表达组4例，2例死亡。根据RT-PCR结果，经Kaplan-Meier分析结果显示：在胶质瘤患者中，LncRNA-TSIX的表达与胶质瘤患者的预后密切相关，差异具有统计学意义(P < 0.01)；在低级别胶质瘤中，LncRNA-TSIX的表达与患者预后密切相关，差异具有统计学意义(P < 0.05)，而在高级别胶质瘤中，LncRNA-TSIX的表达与患者预后无明显相关性(P > 0.05) (图3)。低表达组总体生存率(37.50%)低于高表达组(72.73%) (P < 0.05)；且低表达组总生存时间(556 ± 73 d)低于高表达组(834 ± 103 d) (t = 2.046, P < 0.05) (图4)。生存分析显示LncRNA-TSIX的低表达或表达缺失的患者预后更差。

4. 讨论

胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤，占成人原发性颅内肿瘤的60%。目前胶质瘤的主流治疗方法是手术联合放疗，辅以替莫唑胺(TMZ)辅助化疗 [7] ，因其恶性增殖能力强，极具侵袭性，常侵犯临近正常脑组织，而且大多数胶质瘤患者确诊即晚期，致使该病患者预后较差，生存期普遍较短，IDH野生型和IDH突变型胶质瘤患者诊断时的中位年龄分别为62岁和44岁，而治疗后的中位生存时间分别为15

图3. 基于LncRNA-TSIX表达的胶质瘤患者Kaplan-Meier生存曲线。(a) LncRNA-TSIX的表达情况和胶质瘤患者的总体生存率；(b) 在低级别胶质瘤中，LncRNA-TSIX的表达情况和患者的生存率；(c) 在高级别胶质瘤中，LncRNA-TSIX的表达情况和患者的生存率

图4. LncRNA-TSIX的表达情况与胶质瘤患者生存率及生存时间的关系

个月和31个月 [8] 。胶质瘤的发病机制尚不清楚，但已有研究表明，许多基因分子的变化关系着胶质瘤发生发展。因此，探索与胶质瘤发生发展相关的新的分子机制，寻找与之相关的分子生物标志物尤为重要。

LncRNA作为内源性转录本，参与人体内多种生物学过程，与人类多种疾病的发生发展密切相关。近年来，研究表明LncRNA的异常表达调控着包括胶质瘤在内的多种肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡，并且在恶性肿瘤的侵袭和转移中发挥着重要作用 [9] 。如LncRNA-SNHG12在胶质瘤组织中高表达，在高级别胶质瘤中，LncRNA-SNHG12高表达患者的5年总生存率较低，且下调LncRNA-SNHG12的表达，可降低胶质瘤细胞的增殖、侵袭以及迁移能力 [10] ；LncRNA-ANRIL在胶质瘤组织中均呈高表达，LncRNA-ANRIL表达与胶质瘤分级呈正相关，其高表达提示患者很可能预后不良 [11] ；Lnc001089在胶质瘤组织中表达下调，且与预后不良有关，Lnc001089过表达导致细胞在体外的增殖、迁移和侵袭能力下降 [12] 。

LncRNA-TSIX最初以LncRNA-XIST的反义基因进入我们的视野，同处于X染色体失活中心(X chromosome inactivation center, XIC)中的XIST基因相互调控，共同参与X染色体的随机失活过程 [13] 。有研究发现血清LncRNA-TSIX在区分肝细胞癌患者、慢性丙肝病毒感染患者和健康人方面显示出了高度的敏感性和特异性，推测血清LncRNA-TSIX或可作为HCC的诊断和预后生物标志物 [14] ；Wang [15] 等也发现LncRNA-TSIX能够明显抑制HCC细胞增殖、侵袭，促进HCC细胞凋亡，其机制可能与LncRNA TSIX负调节miR-548-a-3p有关。而LncRNA-TSIX在胶质瘤方面尚无相关研究报道。

在本研究中，我们发现胶质瘤中LncRNA-TSIX的表达量较正常组织显著下调，且在不同级别胶质瘤组织中表达量逐级下调。在Shen等 [16] 的研究中，LncRNA-TSIX 在胰腺癌组织和细胞中高表达；Habieb A [13] 的研究表明与健康人和慢性丙肝患者相比，肝细胞癌患者血清中LncRNA-TSIX表达水平明显增高。我们猜测不同肿瘤类型中LncRNA-TSIX存在表达差异，亦可能发挥致癌或抑癌两种截然不同的生物学功能。

我们发现，LncRNA-TSIX的表达量与胶质瘤组织WHO分级呈显著相关性，与患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小均无明显相关性；LncRNA-TSIX的低表达或表达缺失的患者生存率低，生存期短。Yang等 [17] 在研究食管鳞癌转移相关RNA时，对差异表达LncRNA-TSIX进行生存能力分析，结果也显示TSIX与食管鳞癌患者生存时间具有显著相关性。根据我们的研究结果，我们认为LncRNA-TSIX在胶质瘤中可能发挥着抑癌基因的作用，其表达与胶质瘤的恶性程度呈负相关，与患者预后密切相关；LncRNA-TSIX低表达或表达缺失可能与胶质瘤的发生发展有关，可能是导致高级别胶质瘤患者生存期普遍较短的关键原因。

本研究仍有一些局限性，本研究仅对临床数据进行了初步分析，探讨了胶质瘤中LncRNA-TSIX的差异表达，仍需进一步研究探讨胶质瘤中LncRNA-TSIX的具体作用机制及信号通路。

5. 结论

我们认为LncRNA-TSIX有望成为胶质瘤诊断、预后评估的新的分子标记物，甚至可以成为胶质瘤的治疗靶点。

基金项目

山东省医药卫生科技发展计划，面上项目，基金号(2019WS323)。

文章引用

丁金科,夏 凯,李承龙,张 倩. 胶质瘤组织中LncRNA-TSIX的表达与临床病理特征及预后的关系
Relationship between the Expression of LncRNA-TSIX and Clinicopathological Characteristics and Prognosis in Glioma Tissue[J]. 临床医学进展, 2024, 14(05): 1953-1961. https://doi.org/10.12677/acm.2024.1451639

参考文献