ABSTRACT

Effects of Cu²⁺ on the body weight, body length, SOD and POD enzyme activities of Danio rerio under different water hardness were studied. Results showed that there was no significant effect of different Cu²⁺ concentrations on body length and weight either at water hardness of 50 mg/L or 250 mg/L. However, there were effects of Cu²⁺ concentrations on SOD and POD enzymatic activities of Danio rerio. SOD enzymatic activity was induced at low Cu²⁺ concentrations and was inhabited at high Cu²⁺ concentrations after 2-day exposure. POD enzymatic activity was first inhabited, then induced and then inhabited at low concentrations, while it was first inhabited and then induced at high concentrations.

Keywords:Cu²⁺, Danio rerio, Enzymatic Activity, SOD, POD

Cu²⁺对斑马鱼SOD及POD酶活的影响研究

郭京君

山东省青岛第二中学，山东 青岛

收稿日期：2018年4月7日；录用日期：2018年4月21日；发布日期：2018年4月28日

摘 要

以斑马鱼(Danio rerio)为研究对象，研究了不同硬度条件下Cu²⁺对斑马鱼体长体重、SOD和POD酶活性的影响。结果表明，在硬度为50 mg/L与250 mg/L条件下，不同的Cu²⁺浓度，对斑马鱼的体长体重无明显影响。另一方面，Cu²⁺对斑马鱼SOD和POD活性有不同的影响，其中斑马鱼SOD活性在暴露2天后呈现低浓度诱导高浓度抑制的状态。POD活性表现为低浓度为抑制-诱导-抑制效应，高浓度为抑制-诱导效应。

关键词 :铜，斑马鱼，酶活，SOD，POD

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1. 引言

重金属铜是生命必需的微量元素，作为氧化还原催化剂或氧的载体参与生物体内30多种酶的组成，但超过一定浓度就会产生毒性 [1] [2] 。在淡水中的背景值一般为0.20~0.30 μg/L，但其进入水环境的途径相当多，在水产养殖中常使用硫酸铜防治疾病及灭杀藻类 [3] [4] ，如鱼类养殖中常用0.7 mg/kg CuSO₄防治车轮虫、口丝虫等原生动物疾病并可杀死复口吸虫、甲壳类等寄生虫，蛙类养殖中也常用0.7 mg/kg CuSO₄防治体表寄生虫病等 [5] 。

铜是水产养殖中常用的药物，可以防治鱼病，也可作除藻剂，杀死除去丝状藻等浮游植物。同时，较多的鱼用药物添加了铜以增加药效，且以硫酸铜为主要形式，研究表明溶解态铜对水生生物的毒性最强 [6] 。铜导致鱼类产生行为回避反应，这主要是由于铜可损害鱼类的神经生理功能，破坏嗅觉上皮结构，减少嗅觉中受体数目。同时铜也可影响鱼类的血液生理，这进一步影响了耗氧率 [7] 。

目前，水环境的污染日趋严重，引起了人们的广泛重视 [8] 。水环境重金属污染的来源除了自然因素之外，更主要的是人类活动造成的。污染重金属可以通过积累作用蓄积在水生动、植物体内，并通过食物链最终传递给人类 [9] 。尽管被铜污染的水体，很少导致水生生物急性中毒 [10] 。但慢性中毒会经常发生而影响水生生物的生长、繁殖和抗病能力。研究重金属对水生生物的活性胁迫作用，对于水产品养殖及环境治理乃至人类自身都具有重要的意义 [11] 。本文以标准试验材料斑马鱼为试验生物，Cu作为目标污染物，进行斑马鱼的21天延长试验，研究其SOD、POD酶活变化，为揭示Cu的毒性机理提供科学依据。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

试验用鱼为斑马鱼(Danio rerio)，为国际上公认的标准试验鱼，已被广泛应用于药物毒理学、生态毒理学、环境监测以及疾病研究等科研领域 [12] [13] 。本实验用鱼体长为2.71 ± 0.81 cm，体重为0.11 ± 0.10 g。

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O，AR)为北京化学试剂三厂生产。配制时，先用蒸馏水配制成质量浓度为320 mg/L的Cu²⁺的母液，在实验中所用的质量浓度由其稀释而成。

缓冲液：含0.25 mol/L蔗糖、6 mmol/L EDTA-Na₂，10 mmol/L Tris，pH值为7.14。

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)酶活力检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白浓度测定试剂盒为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产。

实验用水为标准稀释水，由CaCl₂、MgSO₄、NaHCO₃、KCl和去离子水配置而成。实验水温为(22 ± 1)℃。

2.2. 实验方法

2.2.1. 预实验

选定4个间隔较大的质量浓度范围进行预实验，与此同时，设不加毒物的空白组对照，观察24、48、72、96 h斑马鱼反应，并按50 mg/L和250 mg/L两种硬度设置每组不同的浓度梯度。

具体浓度设计如下：1) 50 mg/L：2，8，32，128 μg/L；2) 250 mg/L：8，32，128，512 μg/L。根据半静态生物试验法，实验期间每24 h更换一次实验液，每浓度放5尾斑马鱼，在实验中观察其行为和中毒症状。中毒后，经多次刺激无反应则判断为死亡，将死亡斑马鱼从水中捞出并记录死亡数。根据预实验所得出的质量浓度范围来确定正式实验的质量浓度。

2.2.2. 正式实验

本实验参考鱼类14天延长毒性试验的标准方法 [14] ，分别在硬度为50 mg/L和250 mg/L条件下，按1.5倍浓度梯度设置6个质量浓度组。Cu²⁺质量浓度设计如下：1) 50 mg/L：2，3，4.5，6.75，10.13，15.19 μg/L；2) 250 mg/L：6，9，13.5，20.25，30.38，45.56 μg/L。每组设1个空白对照组，同时设3个平行组，试验温度22 ± 1℃。试验容器为2 L烧杯(盛试液1.6 L)，随机放入大小均一的斑马鱼10条，每隔24 h换试液一次，试验开始时连续观察供试斑马鱼的中毒症状，记录死亡数量并及时清出死亡个体。同时加设一套同样的试验，检测不同暴露时间的鱼体酶活。实验期间每日喂食1次，试验光暗比为12 h:12 h。分别在暴露2、4、8、14与21 d时，每个梯度各平行组烧杯中随机选取3尾幼鱼，用预冷双蒸水洗净，滤纸吸干后，于−20℃保存。测定各暴露时间下斑马鱼的SOD和POD酶活。21天试验完毕后，用游标卡尺测出不同硬度下不同浓度组的每条鱼的体长，用纸吸干鱼身上的水分后用分析天平测出斑马鱼体重。

2.2.3. 酶液制备

取整条斑马鱼，用预冷蒸馏水(0~4℃)洗净，滤纸吸干。按每克组织加9 mL冰冷酶提取液(0.125 mmol/L蔗糖，6 mmol/L EDTA-Na₂，10 mmol/L Tris，pH = 7.14)，用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆。匀浆液在高速冷冻离心机中于10,000 r/ min 离心20 min，取上清，测定酶活力。多余酶液−20℃冷冻保存。

2.2.4. 酶活力的测定

样品上清液中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝比色法，SOD测定采用黄嘌呤氧化法改进的方法-羟胺法，POD测定采用一般分光光度法。酶活检测试剂盒按照操作说明进行 [15] 。

SOD活性单位定义为每mg组织蛋白在1 mL反应液中，SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为1个活性单位(U) [16] ；POD酶活性单位定义为，在37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1 μg底物的酶量定义为1个酶活力单位(U) [17] 。酶蛋白含量用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定。SOD酶活力单位采用U/(mg pr)表示，POD酶活力单位采用U/(mg pr)表示。

2.2.5. 数据处理

所有数据分析均采用单因素方差分析(One-factor analysis of variance)。数据分析与作图软件为SPSS18.0与Origin 9.0。

3. 结果与分析

3.1. 斑马鱼的中毒症状

斑马鱼在不同质量浓度Cu²⁺中表现出不同程度的中毒症状，在最高浓度组，斑马鱼暴露24 h后开始出现异常现象，喜欢在水面附近活动，开始剧烈水平游动然后逐渐变得缓慢，最后躺卧死于水面，死亡个体有轻微浮肿。

3.2. 对斑马鱼体长体重的影响

表1显示，各Cu²⁺处理组，斑马鱼体长与体重与对照组相比，无显著性差异(p > 0.05)。说明在水体硬度50 mg/L且长期暴露于Cu²⁺条件下，Cu²⁺对斑马鱼体长与体重的影响不显著。

表2显示，各Cu²⁺处理组，斑马鱼体长与体重与对照组相比，无显著性差异(p > 0.05)。说明在水体硬度250 mg/L且长期暴露于Cu²⁺条件下，Cu²⁺对斑马鱼体长与体重的影响不显著。

由以上可知，Cu²⁺对斑马鱼的体长体重无明显影响。

3.3. Cu²⁺对斑马鱼SOD活力的影响

图1显示，当水体硬度为50 mg/L时，斑马鱼的Cu²⁺各处理组在2 d内组织SOD活性变化不明显，但随着时间的延长，到4 d后，Cu²⁺各处理组的变化趋于显著，且低浓度组SOD 的活性提高，高浓度组SOD活性得到抑制。其中浓度为2.00 μg/L和3.00 μg/L的Cu²⁺处理组，SOD活性在开始均表现为增强，后表现出抑制；浓度为4.50 μg/L组在2~8 d时间段呈现缓慢上升趋势，14 d后开始呈现显著下降趋势。10.13 μg/L和15.19 μg/L组在2~8 d期间呈现下降趋势，8 d之后有上升趋势，14 d后趋于平稳。

图2表明，当水体硬度为250 mg/L时，整体上在前4 d内，所有浓度组SOD活性均处于被抑制状态，然后SOD活性逐渐上升。6.00 μg/L和9.00 μg/L Cu²⁺浓度组在8 d之后趋于稳定，并且略有下降。而其他浓度组在8 d到14 d内有所下降，14 d后逐渐上升。

表1. 50 mg/L硬度下Cu²⁺对斑马鱼体长与体重的影响

表2. 250 mg/L硬度下Cu²⁺对斑马鱼体长与体重的影响

图1. 水体硬度50 mg/L下斑马鱼SOD活性与Cu²⁺暴露时间关系

图2. 水体硬度250 mg/L下斑马鱼SOD活性与Cu²⁺暴露时间关系

3.4. Cu²⁺对斑马鱼POD酶活的影响

Cu²⁺对斑马鱼POD酶活影响的数据见图3和图4，在50 mg/L硬度组中，Cu²⁺浓度为2.00 μg/L和3.00 μg/L时，POD活性在2 d内受到抑制，在2~4 d内逐渐增强，4 d后又开始受到抑制，8 d之后趋于稳定。Cu²⁺浓度为4.50 μg/L和6.75 μg/L组在2~8 d呈现缓慢下降趋势，8 d之后逐渐上升。10.13 μg/L和15.19 μg/L组从第2 d到14 d呈现下降趋势，14 d后10.13 μg/L浓度组趋于平稳，15.19 μg/L浓度组略有上升。

图3. 水体硬度50 mg/L下斑马鱼POD活性与Cu²⁺暴露时间关系

图4. 水体硬度250 mg/L下斑马鱼POD活性与Cu²⁺暴露时间关系

图4表明，在250 mg/L硬度组中，浓度为6.00 μg/L组的POD活性在2 d增强，其余浓度组2 d内基本无明显变化。2 d后6.00 μg/L组的POD活性开始受到抑制，其后逐渐下降，8 d之后趋于稳定。9.00 μg/L组4 d后开始受到抑制，POD活性随时间逐步降低。13.50 μg/L 4 d内趋于平稳，4 d后呈现抑制诱导状态，14天又趋于平稳。20.35 μg/L，30.38 μg/L和45.56 μg/L组4 d后呈现抑制状态。

4. 讨论

动物体在新陈代谢过程中，产生的超氧阴离子自由基(OH⁻、等)可引发脂质过氧化，破坏膜的结构，进而引发DNA断裂、酶蛋白失活，甚至导致细胞、机体死亡。由于脂质过氧化物最终分解产物中有丙二醛(MDA)，所以MDA含量可以作为自由基中毒损伤的指标。鱼体中SOD是一类金属酶，含Cu、Zn原子，能催化超氧阴离子自由基()转化为过氧化物，POD等酶类又进一步催化组织中低浓度的过氧化物氧化其他底物，清除过氧化物和H₂O₂，从而降低自由基对机体的损害作用。因此，SOD和POD的活性也可以用来评价污染物对水生生物的影响 [1] 。

4.1. Cu²⁺对斑马鱼SOD酶活的影响

SOD是的清除剂，它能专一清除生物经氧化产生的超氧阴离子自由基，将其歧化为H₂O₂和O₂，是机体防御过氧化损害的关键酶之一。在正常生理状态下，由代谢产生的活性氧可为抗氧化防御系统所控制，但当某些污染物在体内进行生物转化时，同时产生氧化还原循环，生成大量活性氧，从而引起机体氧化应激反应，在这些活性氧的产生和转化中，SOD起着非常重要的作用 [18] 。

对于斑马鱼，Cu²⁺各处理组在2 d内，组织SOD活性的变化不明显，但随着时间的延长，Cu²⁺各处理组的变化趋于显著。低浓度组提高了SOD的活性，高浓度组SOD活性得到抑制。

在低浓度或短时间内，鱼暴露在重金属中，鱼体内产生过量，诱导鱼体SOD活性提高。重金属是离子通道的阻碍物，能阻碍各种离子通道，从而影响细胞内信号传导而导致体内各种酶活性的变化，对生物体产生毒害作用。当大量重金属离子进入体内，随着时间的延长，鱼体产生大量，超过鱼体SOD清除能力时，就会对组织细胞造成损伤，影响鱼体的正常生理活动，使SOD活性降低和丧失，甚至导致细胞死亡 [5] 。高浓度显示出被抑制的趋势，这可能是由于铜离子浓度较低时，产生少量的，在O₂^–的诱导下，SOD的合成能力增强。但SOD清除的能力总是有限度的。

SOD清除的能力与其含量和活性有关，许多研究表明，当生物体受到轻度逆境胁迫时，SOD活性往往升高；而当受到重度逆境胁迫时，SOD活性通常降低，使生物体内积累过量的活性氧，从而导致生物体受到伤害。本实验结果同样发现，低浓度铜胁迫下，斑马鱼体内的SOD活性升高 [19] .

毒物在低浓度下出现的这种现象，是其在无毒情况下的应激反应，这一现象称为“毒物兴奋效应”。到目前为止，许多研究证明，“毒物兴奋效应”具有普遍性；高浓度Cu²⁺胁迫下，斑马鱼体内SOD性极显著性下降，因此，Cu²⁺胁迫下SOD活性的降低，造成斑马鱼的活性氧伤害很可能是Cu²⁺对斑马鱼形成毒害的重要原因之一 [20] 。

4.2. Cu²⁺对斑马鱼POD活力的影响

POD存在于真核生物细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，能催化过氧化氢、氧化酚类等有毒物质和调节氧含量使细胞免受高浓度氧毒害。它利用H₂O₂氧化供氢体，它对H₂O₂要求专一而对供氢体要求广泛，能够反映生物体产生和消除自由基的能力以及细胞代谢的强度。SOD是生物体防御氧化损伤的重要酶类，它能催化发生歧化反应，生成H₂O₂和O₂ [21] 。

有研究表明生物在轻度逆境胁迫时，POD会升高来抵御外界刺激，但在重度逆境胁迫下超过机体抵御能力，POD会降低，生物积累大量活性氧自由基导致机体受损。

Cu²⁺暴露对斑马鱼POD活性表现为低浓度为抑制-诱导-抑制效应，高浓度为抑制-诱导。暴露初期斑马鱼机体产生POD清除含氧自由基，抵抗外界刺激机体增强自身防御，但此时POD产生和清除含氧自由基平衡已打破，表现为POD活性降低。而Cu²⁺随暴露时间增加，POD活性降低。这是因为斑马鱼机体受到损伤，含氧自由基浓度增大，超出POD清除能力，机体清除含氧自由基机制严重失衡的表现，导致POD活性急剧下降 [22] 。

Cu²⁺各处理组中低浓度组Cu²⁺暴露时，对斑马鱼体长体重无显著影响，而短期内斑马鱼SOD活性变化不明显，但随着时间的延长，SOD活性提高，导致“毒物兴奋效应”。高浓度Cu²⁺曝露时，随着时间的延长和浓度的增加，SOD的活力抑制明显。而POD活性表现为低浓度为抑制-诱导-抑制效应，高浓度为抑制-诱导。

5. 结论

Cu²⁺对斑马鱼体长体重无显著影响，Cu²⁺各处理组SOD活性表现为低浓度诱导-抑制，高浓度抑制。而POD活性表现为低浓度为抑制-诱导-抑制效应，高浓度为抑制-诱导。

基金项目

青岛二中教师发展基金项目(EZ2016010)资助。

文章引用

郭京君. Cu²⁺对斑马鱼SOD及POD酶活的影响研究
Effects of Cu²⁺ on SOD and POD Enzymatic Activities in Danio rerio[J]. 农业科学, 2018, 08(04): 397-405. https://doi.org/10.12677/HJAS.2018.84062

参考文献