 Hans Journal of Agricultural Sciences 农业科学, 2012, 2, 37-42 http://dx.doi.org/10.12677/hjas.2012.23007 Published Online September 2012 (http://www.hanspub.org/journal/hjas.html) Studies on the Relationship between Anther Development and Reactive Oxygen Balancing in Xanthoceras sorbifolia Bunge* Shujing Zhang1, Qiang Wang2, Caixia Zheng1#, Fenglan Li1 1College of Bioscience and Biotechnology, Beijing Forest University, Beijing 2Aquatic Biological Research Institute, China Science Academy, Wuhan Email: #zhengcx@bjfu.edu.cn Received: Jul. 5th, 2012; revised: Jul. 16th, 2012; accepted: Jul. 30th, 2012 Abstract: The balancing of the metabolism of reactive oxygen in male fertile anthers and male sterile anthers in Xanthoceras sorbifolia B. from microspore mother cells stage to binuclear stage was studied in this paper. The results indicated that the activity of SOD and CAT was inharmonious, and the content of Vc was less in the male-sterile anthers during their development, which cause the H2O2, MDA and organic free radical accumulating in the male-sterile anthers. As a result, the membranes of some important organelles such as mitochondria were destroyed. It result in the anthers sterile because of impact supply of energy and nutrient substance that anthers upgrowth needed. Keywords: Xanthoceras sorbifolia B.; Anthers; Male Sterile; Metabolism of Reactive Oxygen 文冠果花药发育与活性氧平衡的关系* 张淑静 1，王 强2，郑彩霞 1#，李凤兰 1 1北京林业大学生物科学与技术学院，北京 2中国科学院水生生物研究所，武汉 Email: #zhengcx@bjfu.edu.cn 收稿日期：2012 年7月5日；修回日期：2012 年7月16 日；录用日期：2012 年7月30 日 摘 要：本文分析了文冠果不育和可育花药自小孢子母细胞至双核花粉粒发育期间的活性氧的平衡 性，结果表明：在发育过程中不育花药中的 SOD 与CAT 活性不协调，Vc 含量低，造成 H2O2、MDA 和有机自由基积累。这可使线粒体等重要细胞器膜破坏，影响了花药发育能量的供应和营养物质的供 应而最终导致花药不育。 关键词：文冠果；花药；雄性不育；活性氧代谢 1. 引言 文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bunge)为无患子科 (Sapindaceae)文冠果属植物，具有绿化、观赏和药用 的价值。因其种仁含油率高，被视为我国重要的木本 能源植物。但文冠果开花量大，结实率极低，因而大 大降低了文冠果作为能源植物资源的利用率。因此， 开展文冠果发育的机理研究，对于提高文冠果结实率 具有十分重要的意义。 植物发育的基础是细胞的生长和代谢，细胞生长 受基因表达、营养物质和植物激素等多种因素的调控 及代谢水平的影响。活性氧(Reactive oxygen species， *资助信息：国家自然科学基金项目(39670619)。 #通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 37  文冠果花药发育与活性氧平衡的关系 ROS)是植物有氧代谢过程中的副产物，对植物生命活 动具有利和弊的双重作用[1]。正常条件下，生物体内 活性氧产生和清除系统之间维持动态的平衡，但不利 因素的胁迫会打破这种平衡关系，从而引起生物体内 的生理的变化来适应变化了的环境[2]。近 10多年来， 随着细胞信号转导研究的深入，人们发现 ROS 通过 直接或间接作用调节细胞生长来控制植物的发育[3,4]， 成为植物发育的重要调节剂[5,6]，其可作为植物激素信 号的第二信使，调节离子通道活性和基因表达，并通 过影响胞壁的结构与松弛性等调节细胞的生长[7]。 Sagi 等[8]认为，除了调节细胞的生长外，ROS 还可能 有更为复杂的作用，如控制器官形成的启动和数量、 发育和性别分化等，但还缺少直接的证据。目前国际 上仅有少量的研究观察到ROS 在伸长的花粉管中大 量产生，以及可控制成熟果实的软化，对花器官和幼 果的生长调控作用需要开展系统研究。逆境胁迫以及 特殊的生理现象(如雄性不育的花药、花蕾败育)伴随 着ROS 代谢异常，细胞内 H2O2、2 O和·OH 与1O2 积累，导致细胞的膜受损，进而死亡[9-13]。 对水稻[14,15]，油菜[16]，棉花[17]，枸杞[18]，葱[19]， 小麦[20,21]等雄性不育系的研究结果表明，雄性不育系 体内活性氧由于代谢失衡而趋于积累，一般均会导致 细胞膜伤害，这可能是引起小孢子发育异常和不育的 原因。 文冠果为杂性花，雄花(不孕花)的花药可育，两 性花(孕花)的花药不育[22-24]。早期研究表明，文冠果 两性花花药不育可能与花粉中某些细胞器的减少及 代谢上的障碍造成花粉缺乏足够的营养物质等因素 有关[22]，进而发现，不育花药内花粉粘连，花药壁不 能开裂散粉[23]，花药中的部分花粉不能萌发，开花期 的不育花药与可育花药的多肽表达存在差异[25]。为 了 进一步揭示导致文冠果不育花药这种结构与功能异 常的原因，本文研究了文冠果花药发育过程中活性氧 的平衡关系。 2. 材料与方法 2.1. 材料 植物材料均为北京林业大学苗圃的成年文冠果 植株，选取有代表性的 3株，依据郑彩霞等[22]和彭伟 秀等[23]的方法确定花药发育时期，分别采取不育花药 和可育花药后立即进行测定。有机自由基检测所用材 料先用冷冻干燥机冻干，研磨成细粉末，然后上机检 测。 2.2. 方法 酶液制备：取 0.5 g植物材料在冰浴下用少量磷 酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 7.0)研磨提取，4℃，10,000 r/min 离心 15 min，上清液即为酶制剂，蛋白质的含 量测定参考Bradfo rd[26]的方法。酶活性测定均以等量 蛋白质控制酶液的加入量。每个样品设 3个重复。 过氧化氢酶(CAT)活性测定：采用高锰酸钾 滴定 法。取适量酶液加入到反应体系(5 ml H2O；4 ml 1% H2O2)中反应 10分钟后，加2 ml 10%的H2SO4，用 0.01 mol/L 的高锰酸钾滴定。酶活性以mg H2O2 mg–1·pro·min–1 表示。 过氧化物酶(POD)活性测定： 采用愈伤木酚氧化 法[27]，利用 Uvikon-180 的自动酶促反应速度扫描功能 作出酶促反应曲线，以反应初速度作为酶促反应速 度。酶活性以OD 470 mg–1·pro·min–1 表示。 超氧化物歧化酶(SOD) 活性测定：采用 NBT 光化 还原法[28]。将以对 NBT的还原反应抑制到对照一半 时所需酶量为一个酶活单位，酶活性表示为 u·mg–1·pro·h–1。 丙二醛(MDA) 含量测定：参考赵世杰等[29]的方 法，采取硫代巴比妥酸显色法。 抗坏血酸(Vc)含量测定：采用 2,6-二氯苯酚吲哚 酚滴定法[30]。 有机自由基的检测：参考 Mojović等[31]的方法， 取冻干并研磨精细样品粉末约50 mg，装入样品管， 置于电子顺磁共振波谱仪(德国产 BRUKER，ER 200D-SRC 型)的微波腔中检测有机自由基。测定条件 为：中心磁场(G)为3385，25℃，扫描范围(G)为200 G， 时间常数为 200 ms，扫描时间为 200 s，调制幅度为 1 G，调制频率为 100 kHz，放大倍数为 1.6 × 105，微 波 功率为 200 mW，微波频率为 9.47 GHz。自由基水平 由信号振幅(峰高)以cm 表示。样品中的自由基水平可 以表示为毫米振幅每毫克干重。 测定数据采用 SPSS17.0 软件分别进行单因子方 差分析和多重比较。P < 0.05 表示有显著性差异。 3. 结果与分析 Copyright © 2012 Hanspub 38  文冠果花药发育与活性氧平衡的关系 Copyright © 2012 Hanspub 39 3.1. CAT活性变化 CAT 活性的测定结果如图 1a 所示。在小孢子母 细胞和四分体时期，两种花药的 CAT 活性都相对较 低，且没有明显差异；至单核时期两者活性显著提高 (P < 0.05)，而且两者的 CAT 活性相近。到单核中期， 不育的 CAT 活性维持前期水平，而可育花药的活性持 续提高，显著高于不育的(P < 0.05)；至双核时期，二 者中的 CAT 活性均急剧下降，但是可育的活性仍稍高 于不育的。不育花药发育后期 CAT 活性较低将会使花 药中 H2O2积累，进而影响花粉的正常发育。 3.2. POD活性变化 由图 1b 看出，在花药发育的早期，POD 活性较 高，随着发育逐渐降低，不育花药的POD活性始终 高于可育花药的，这种差异至单核中期达显著水平(P < 0.05)。 3.3. SOD活性变化 对于简单的公式，可以直接以文本方式输入；对 于复杂的公式，可以考虑使用公式编辑器，或者将公 式制作成图片后插入文中。编辑公式的过程中要特别 注意减号与连字符的区别，前者较长，后者较短。在 小孢子母细胞时期，可育花药的 SOD 活性显著高于不 育花药的(P < 0.05)，随着发育进程逐渐下降；至单核 中期和双核时期，显著低于不育花药的(P < 0.05)。不 育花药的 SOD 活性在四分体阶段之前变化不显著，到 单核时期有一个明显下降(P < 0.05)，随后逐渐上升， 并且显著高于可育花药的(见图 1c)。这可能是因为不育 花药在发育后期有较多的超氧物需要清除，而 SOD 的 过度作用也可导致花药发育后期 H2O2的积累。 3.4. Vc含量变化 图1d 表明，在文冠果花药发育过程中，不育花 药的抗坏血酸含量相对较低，而且在发育的各时期基 本处在同一水平。而可育花药的含量则逐渐上升，花 药发育后期增加显著(P < 0.05)，几乎是不育花药的3 倍。推测抗坏血酸在维持文冠果花药活性氧的平衡中 具有重要作用。 3.5. 丙二醛含量变化 整个发育进程中，两种花药中MDA含量均趋于 V型变化，不育花药的 MDA含量始终高于可育 Figure 1. Changes of the activities of antioxidase and the content of Vc during anther development in Xanthoceras sorbifolia Bunge 图1. 文冠果花药发育过程中抗氧化酶活性及 Vc含量的变化  文冠果花药发育与活性氧平衡的关系 花药的。至双核期在不育花药中有显著增加(P < 0.05)。 表明此刻不育花的膜脂过氧化程度较高(见图 2)。 3.6. 有机自由基的变化 花药发育过程中有机自由基的水平变化如图 3所 示。不育和可育的花药中自由基水平的变化规律一 致，在单核时期均显著提高，达到高峰。在花药发育 前期，可育花药的自由基含量明显高于不育花药的， 但自单核时期之后，就转变为不育的高于可育的，并 持续至花药发育成熟，但是差异没有早期那么显著。 4. 讨论 ROS 是氧的某些中间代谢产物及其衍生的含氧 物质，具有比氧活泼的化学性质，主要包括单线态分 Figure 2. Changes of the con tent of MDA during anther development 图2 文冠果花药发育过程中丙二醛含量的变化 Figure 3. Changes of the lev e l of organic radical during anther development in Xanthoceras sorbifolia Bunge 图3. 文冠果花药发育过程中有机自由基水平的变化 子氧(1O2)，过氧化氢(H2O2)和脂过氧化物(LOOH)，自 由基是指超氧物阴离子(2 O)和羟自由基(·OH 和 HO·)。实际上，氧自由基也是 ROS 的一部分。细胞 中的有机态活性氧，如烷氧自由基(RO·)，烷氧过氧化 自由基(ROO·)可能是有机自由基的重要组成部分 [1,15]。生物体内存在一些清除它们的酶类和非酶类物 质。前者如 SOD，POD 和CAT，后者如 Vc，谷胱甘 肽，类胡萝卜素等。正常情况下这些自由基和ROS 区域化地分布于细胞内，为植物生长和发育所必需， 可通过调节细胞生长来控制植物的发育[3]。人们常采 用促进或抑制ROS 产生的方法来研究 ROS 对植物发 育的影响用。林植芳等[6]在综述中介绍，如用H2O2 处理后可改变植物基因的表达，一般一些编码抗氧化 酶、氧化酶及木质素生物合成途径相关蛋白的基因表 达被上调，而与胞壁软化有关的细胞壁扩展蛋白的基 因表达则被下调，表明ROS 可通过控制一些基因的 表达来调节发育的程序。在不利的环境条件下，或植 物趋于衰败的发育阶段，ROS 往往代谢异常，细胞内 H2O2、2 O和·OH 与1O2积累，如果不能被及时清除， 可导致膜脂过氧化而产生大量的有机自由基，进而对 细胞造成膜水平上的伤害，引起细胞代谢紊乱而死亡 [9,12,13]。许多研究表明氧自由基的积累可以抑制叶绿体 的正常发育，降低其固定CO2的能力；引起线粒体结 构的损伤而导致其生化功能的丧失；膜脂过氧化的产 物MDA 又可直接引起植物细胞的毒害；氧自由基对 生物大分子如蛋白质，酶，核酸等都有较强的毒害作 用[1,32]。 关于植物雄性不育和活性氧代谢之间的关系国 内已有大量研究，表明活性氧代谢失衡与植物不育密 切相关，膜脂过氧化作用增强是不育花药的普遍特征 [16-21]。 我们的研究表明，文冠果不育花药在发育早期 SOD 活性较低，不能有效地清除超氧物自由基，单核 期以后活性又提高，而同期 CAT 的活性又远低于可育 花药，这种 SOD和CAT 活性的不协调性可能会造成 H2O2的积累而导致花药发育异常。这与陈贤丰等 [14](1991) 早期的研究结果相似，他们认为雄性 不育的 发生与不育花药能量代谢异常和H2O2的积累有关。 王俊生[20]用杀雄剂 SQ-1处理能诱导小麦花药中 2 O 和H2O2大量积累和SOD、POD、CAT 等活性降低， Copyright © 2012 Hanspub 40  文冠果花药发育与活性氧平衡的关系 导致不育。蒋培东等[17]研究发现，在棉花不育系败育 初期的花药中 2 O、H2O2和MDA 的指标均高于保持 系或杂种F1，同 时SOD、CAT 和POD 活性也随着提 高，认为败育初期花药的活性氧增加对抗氧化酶有诱 导作用。 MDA 在植物体内积累是活性氧毒害的结果，它 的含量是判断膜脂过氧化程度的一个重要指标。文冠 果不育花药中丙二醛含量始终高于可育花药，在双核 期有明显的增量。表明不育花药细胞膜的伤害程度高 于可育花药的，结果与米海莉[18]对枸杞雄性不育系的 研究结果一致。枸杞雄性不育株花蕾的MDA 含量高 于可育株的，MDA 大量积累致使花蕾中花药发育不 正常。苗锦山等[19]对葱细胞质雄性不育系的研究结果 也与之相同。葱雄性不育系从小蕾期开始，活性氧产 生速率和丙二醛含量显著高于保持系，丙二醛含量从 中蕾期开始大量积累，至败育盛期接近最高值。 Vc 是活性氧的有效清除剂。庞勇等[33]用还原型 Vc 处理能有效缓解植物细胞内丙二醛(MDA)含量的 增加，可以有效降低氧化胁迫带来的细胞代谢损伤。 文冠果不育花药的Vc含量在各发育时期相对较低， 特别是在发育的后期其活性仅占可育花药的 30%，这 也是造成发育后期不育花药内MDA积累的原因。在 文冠果花药发育前期，可育花药的有机自由基含量明 显高于不育花的，但自单核期之后，就转变为不育花 的高于可育花的，并持续至花药发育成熟。林植芳等 [15]在早期研究中指出，水稻细胞质雄性不育花药在发 育过程中发生了有机自由基代谢异常。 植物体内叶绿体和线粒体中的代谢反应必然会 导致 1O2和2 O的产生， 2 O可被SOD 歧化为H2O2， 这可引起更高毒性的·OH产生。·OH可攻击膜脂，产 生RO·和ROO· 等有机自由基，这些有机自由基不但 是膜脂过氧化的产物，而且是膜脂过氧化更强的诱发 剂，因此在体内膜保护中，CAT 具有至关重要的作用， 其他活性氧清除剂如Vc 等亦具有重要作用。我们的 研究结果表明，文冠果不育花药的败育与发育关键时 期花药内 SOD 活性较高而 CAT 活性低及 Vc 含量低 有密切的关系。至于这种活性氧代谢的异常现象是花 药败育的原因还是结果，尚待进一步确定。我们在前 期的研究中已经观察到不育花药线粒体等细胞器含 量少且呈空泡状[22]，花药内花粉粘连，花药壁不能开 裂散粉[23]，认为这种现象可能与活性氧伤害膜结构有 关。因此可以推测，文冠果不育花药中 SOD 与CAT 活性的不协调，Vc含量低造成 H2O2、MDA和有机自 由基的积累，导致膜脂过氧化，致使线粒体等重要细 胞器膜破坏，影响了花药发育能量的供应和营养物质 的供应，最终导致花药不育。这个观点与前人的一致， 也得到汪李宏[21]和王俊生[20]近期研究结果的支持。 参考文献 (References) [1] 王爱国, 植物的氧代谢, 余叔文, 汤章城主编, 植物生理与分 子生物学第二版[M]. 北京: 科学出版社, 1998. 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