Bioprocess 生物过程, 2012, 2, 105-110 http://dx.doi.org/10.12677/bp.2012.23017 Published Online September 2012 (http://www.hanspub.org/journal/bp.html) Analysis of Endophytic Fungal Community from Roots of Tw o Transgenic Rice* Yuelian Liu1, Jianfu Guo1#, HongxuYuan2, Yuer en Li3, Wei Li1, Yongxiang Huan g1 1Agricultural Institute of Guangdong Ocean University, Zhanjiang 2Life Science and Technology School, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 3Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou Email: #gjf6292@126.com Received: Jun. 18th, 2012; revised: Jul. 3rd, 2012; accepted: Jul. 12th, 2012 Abstract: Endophytic fungal community in roots of two transgenic rice (antifungal genes) was studied by isolation and staining observation. Compared with non-transgenic rice, the isolation frequency and diversity of the endophytic fungi from two transgenic rice in different growth stages exhibited no significant differences in contrast with the control. Gaeumannomyces was the dominant population of endophytic fungi in the roots of rice with the dominance of 23.23%, and could be isolated in either the two transgenic rice or the control, and any growth stages. By staining observation, the infection rates of endophytic fungi in seedlings of transgenic rice were significantly lower than the control by 21.25% and 26.56% respectively, but there were no significant differences in tillering and maturity. Therefore, it is inferred that the transgenic rice had no significant effect on fungal communities in rice roots. Keywords: Transgenic Rice; Antifungal Genes; Endophytic Fungi 两个转抗真菌基因水稻根部内生真菌群落变化的分析* 刘月廉 1,郭建夫 1#,袁红旭 2,李玥仁3,李 伟1,黄永相 1 1广东海洋大学农学院,湛江 2湛江师范学院生命科学与技术学院,湛江 3福建省农业科学院,福州 Email: #gjf6292@126.com 收稿日期:2012 年6月18 日;修回日期:2012年7月3日;录用日期:2012 年7月12 日 摘 要:本文采用真菌分离培养法和直接染色观测法分析了两个转基因根内真菌群落变化。分离培养法表明, 与非转基因水稻相比,不同生长期两个转基因水稻的内生真菌分离频率和多样性与对照无显著差异。 Gaeumannomyces 为水稻根部内生真菌优势种群,优势度达 23.23%,在转基因的两个品种和对照均可分离到, 在不同的生长期也分离到。染色观测法表明,转基因水稻的内生真菌侵染率在秧苗期与对照有显著性差异,表 现在它们的侵染率分别低于对照 21.25%和26.56%,但在分蘖期和成熟期均无显著性差异。因此推论,水稻转该 基因后,对水稻根生内真菌群落无显著影响。 关键词:转基因水稻;抗真菌基因;内生真菌 1. 引言 水稻纹枯病遍及全球,是水稻三大病害之一。该 病害成为制约水稻生产的重要障碍。纹枯病菌及大多 数真菌细胞壁的主要成分是几丁质,采用基因枪法将 抗真菌基因如水稻酸性几丁质酶基因(RAC22)、水稻 *本研究得到中国农业部转基因生物新品种培育重大专项资助 (2009zx08011029B)资助。 #通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 105 两个转抗真菌基因水稻根部内生真菌群落变化的分析 碱性几丁质酶基因(RCH10)导入水稻优良恢复系 E32 获得的 T6 代稳定遗传株系[1,2]进而培育出“转 1”、“转 8”等一些转基因抗病水稻品系,这些品系具有良好 的应用前景[3]。由于水稻体内也存在内生真菌及真菌, 并与水稻协同进化,在演化过程中二者形成了互惠关 系[4]。内生真菌可以通过增强植物吸收 N、P等营养 元素或产生促进植物生长的物质等作用促进植物生 长[5]。内生真菌可以提高宿主植物的抗病性[6]。而转 基因水稻在转入抗真菌基因而获得抗病性的同时,也 存在导致水稻内生微生物群落变化特别是内生真菌 群落发生重大变化的可能,这种变化有可能导致新的 生态风险。转基因水稻体内微生物群落变化的研究是 转基因水稻安全性评价的内容之一[3,7],可为转基因水 稻的安全应用提供参。 2. 材料与方法 2.1. 材料 2.1.1. 供试水稻材料 供试转基因水稻转 1、转 8及其对照非转基因亲 本E32 由中山大学提供。是由中山大学用基因枪法将 广谱抗真菌基因:水稻酸性几丁质酶基因(RAC22) 、 水稻碱性几丁质酶基因(RCH10)导入水稻优良恢复系 E32 获得的 T6 代稳定遗传株系。 试验分别于 2009 年晚季,2010 年早季和 2010 年 晚季在广东海洋大学试验田进行(农业转基因生物安 全审批书为农基安办字2009 -T072)。 2.1.2. 水稻根内生真菌分离及观察培养基 分离培养基:PDA培养基 + 链霉素 80 μg/ml。 观察培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。 2.1.3. 水稻真菌侵染率的检测试剂 甲醛、醋酸、95%酒精、KOH、NH4OH、30% H2O2、 HCL、酸性复红、乳酸、甘油。 2.2. 方法 水稻的种植:转基因水稻株系及亲本于 3月中旬 移植于中等肥力试验田(为隔离区),每个株系(品种) 为1小区,种植 5行,每行 10株,行株距为 25 cm × 15 cm,周围设 0.5 m 保护行,小区随机排列。试验地 为广东海洋大学试验农场。 2.2.1. 采样 采样分别在水稻秧苗期、分蘖期和成熟期,每个 品种采用 5点取样法,每个点采集 5株。当天取回新 鲜的水稻根系,冲洗干净,除去表面附着的泥沙,自 然晾干。用 75%酒精漂洗后,用 0.1%升汞处理 1.5 min, 然后用无菌水清洗 4次。 2.2.2. 内生真菌分离纯化与保存 材料表面消毒后,用无菌解剖刀将根切成约 0.5 cm 长度的组织块,然后将以上组织块分别 贴放于 分 离培养基平板上(每个培养皿放 4块,每个品种各 20 块),重复 4次。置于28℃~30℃恒温箱中培养 5~20 d, 待培养基上根组织周围长出菌丝后,采用尖端菌丝挑 取法进行纯化及编号并转接斜面保存[8]。 2.2.3. 内生真菌的鉴定 将菌株接于马铃薯琼脂平板上,28℃恒温培养 48 h后,开始观察菌落、产孢结构和分生孢子等形态与 大小色泽等特征,根据形态特征初步鉴定到属,真菌 分类鉴定参考文献有《Compendium of Soil Fungi》 [9], 《真菌鉴定手册》[10]等。真菌学名的使用参考《Dic- tionary of the Fungi》[11]。 对不能产孢的菌株进行rDNA ITS 测序。 基因组 DNA 提取参考 White(1997)[12]等使用的方 法,用于ITS 序列扩增的引物为通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),PCR 反应 体系(25 μL)包括:10 × PCR Buffer(含Mg2+)2.5 μL、 dNTP(2.5 mmol/L)1 μL、模板 DNA(约30 ng)1 μL、引 物ITS1(5 μmol/L)和ITS4(5 μmol/L)各1 μL、Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL、ddH2O 18 μL。PCR 扩增程序 为:94℃预变性 2 min,94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min,35 个循环,72℃ 10 min,4℃保存。PCR 产物 测序。 2.2.4. 真菌多样性分析 参考唐启义等(2006)[13]对真菌多样性进行分析 比 较。主要分析指标有 Shannon-Wiener 多样性指数(H′), Pielou 均匀度指数(J),丰度指数(DMC)和优势度(Y)。 计算公式如下: 1 ln k i H pi pi (1) Copyright © 2012 Hanspub 106 两个转抗真菌基因水稻根部内生真菌群落变化的分析 其中 pini N即第 i种占总个体数 N的比例; maxJHH ,其中 max ln H S其中 S为物 种数; 1 S I N ni N N DMC (2) 其中 ni 为第 i种的个体数,S是物种数,N是菌株数; . ni Y N fi (3) 其中 ni 为第 i种的个体数,N为该种在所有样品中的 总个体数,fi 为该种在各个水稻品种中出现的频率[14]。 利用 DPS v7.5 软件进行计算。 2.2.5. 水稻根内真菌侵染率的直接观测 采用酸性品红染色法[15]进行测定。将处理过的根 样整齐、竖向摆放于载玻片上,每片载玻片约摆放20 条粗细一致的根样,共80 条。加甘油为浮载剂,置 于NICON 显微镜下观察(放大倍数为×100、×200 、 ×400 和×1000)。重复 4次。 2.2.6. 统计 侵染率(%) = 有感染的根段数/检查根段总数 × 100[16] (4) 侵染指数 = [Σ (各级侵染数 × 各级代表数值)] ÷ (样本总数 × 最高级代表数值) × 100% (5) 侵染级别:每段根内 AM 菌数量 0个为 0级;1~3 个为 1级;4~6 个为2级;8~10 个为 3级;10 个以上 为4级。 3. 结果与分析 3.1. 水稻根部内生真菌分离结果分析 2009 年及 2010 年两个转基因水稻及其对照的根 部内生真菌分离结果表明,各个样本均可分离到内生 真菌,共分离到 97 个真菌菌株。对得到的菌株进行 编号及计数(见表 1)。 3.1.1. 水稻根部内生真菌分离频率比较 分离结果表明,2009 年两个转基因水稻品种与对 照相比较,不论是分蘖期还是成熟期,它们根部内生 真菌分离频率没有显著性差异(见表 2)。2010 年在水 稻生长的三个不同时期所分离的根部内生真菌,表现 Table 1. Endophytic fungi strains and number isolated form the roots of transgenic rice in 2009 and 2010 表1. 2009年及2010 年两个转基因水稻根部内生真菌分离的菌株 年份 品种 生长期 菌株编号 分蘖期 091T 091T1-091T8 转品 1 成熟期 091M 091M1-091M7 分蘖期 098T 098T1-098T3 转品 8 成熟期 098M 098M1-098M9 分蘖期 09CT 09CT1-09CT8 2009 CK 成熟期 09CM 09CM1-09CM4 秧苗期 101S 101S1-101S4 分蘖期 101T 101T1-101T7 转品 1 成熟期 101M 101M1-101M5 秧苗期 108S 108S1-108S3 分蘖期 108T 108T1-108T8 转品 8 成熟期 108M 108M1-108M7 秧苗期 10CS 10CS1-10CS6 分蘖期 10CT 10CT1-10CT10 2010 CK 成熟期 10CM 10CM1-10CM8 Table 2. Isolation frequency of endophytic fungi from roots of 2 transgenic rice in different stages 表2. 2个转基因水稻不同时期根部内生真菌的分离频率的比较 处理 平均分离频率(%) 处理 平均分离频率(%) - - 101S 5.00 ± 2.04 a - - 108S 3.75 ± 1.25 a - - 10CS 7.50 ± 1.44 a 091T 10.00 ± 3.54 a 101T 8.75 ± 2.39 a 098T 3.75 ± 2.39 a 108T 11.25 ± 4.73 a 09CT 10.00 ± 2.04 a 10CT 12.50 ± 1.44 a 091M 6.25 ± 2.39 a 101M 6.25 ± 2.39 a 098M 11.25 ± 2.39 a 108M 8.75 ± 1.25 a 09CM 5.00 ± 2.04 a 10CM 10.00 ± 2.04 a 注:Means in a column followed by the different small letters represent signifi- cant difference at 5% level(同一栏中数据后小写字母不相同者表示处理间差 异在 5%水平显著)。 出不同品种和不同生长期它们的分离频率都差异不 显著(见表 2)。说明转 RAC22 基因和转 RCH10 基因的 两个水稻品种对水稻根内的真菌群落不产生显著性 的影响。 Copyright © 2012 Hanspub 107 两个转抗真菌基因水稻根部内生真菌群落变化的分析 Copyright © 2012 Hanspub 108 3.1.2. 内生真菌种类多样性比较 97 个真菌菌株中,有 95个菌株鉴定到属,共有 17 个属;有 2个菌株表现形态特征与 ITS 序列特征不 一致,为未确定菌株(见表 3)。经统计分析表明,Gaeu- mannomyces 的优势度最高,达23.23%;Rhizopycnis 和Fusarium 为其次,优势度分别为8.04%和7.56%; 其余的优势度较低。由此可见 Gaeumannomyces 为水 稻根部内生真菌的优势种群。分析结果表明,转基因 的两个品种,不同年份,不同生长期,都可分离到 Gaeumann omyces( 见表 3);同时 Rhizopycnis 和Fu- sarium也以较高的几率出现,因此可以推测,转 RAC22 基因对水稻根内的真菌优势种群不产生明显的影响。 但是以优势度为 2.89%的Westerdykella种群,对照组 出现的频率较高,而两个转基因组的频率较低(见表 4)。因此,有可能转基因对个别种群有一定的抑制作 用。 进一步对内生真菌多样性分析,结果表明,与对 照相比,2009 年的转品 1的SHANNON 指数略低, 转品 8的略高,但它们的差异均不显著(P > 0.05)。其 物种的均匀度及丰度与对照也差异不显著。2010 年的 转品 1和转品 8的SHANNON 指数都低于对照,但它 们的差异均不显著(P > 0.05)。其物种的均匀度及丰度 也相似(见表 3)。 3.2. 根内生真菌侵染率的显微镜观测 根内真菌侵染率及侵染指数的分析。 通过观测结果表明,2009 年两个转基因水稻秧苗 期的内生真菌的侵染率分别低于对照 21.25%和 26.56%,差异显著;而到了分蘖期及成熟期,两个转 基因水稻的内生真菌的侵染率与对照无显著性差异, Table 3. Dominance and identification of endophytic fungi form rice roots 表3. 水稻根部内生真菌的鉴定及其类群优势度 种属 鉴定依据 鉴定菌株 优势度% Acremonium 产孢,形态典型 108S1、108M3、10CS3、10CT5 1.10 Aspergillus 产孢,形态典型 09CT2、10CT2、101S1 0.62 Chaetomium 产孢,形态典型 091T1、091M2、098T3、098M1、101M2、108T7、108T8、108M1 3.85 Cladosporium 产孢,形态典型 10CM2 0.06 Curvularia 产孢,形态典型 098T1、108T1 0.27 Dokmaia 无孢,最高同源序列为 DQ780454.1 09CT5 0.06 Fusarium 产孢,形态典型 091M1、098M7、09CT1、09 CM2、101T1、108T6、108M4、10CS5、 10CS6、10CT6、10CM3 7.56 Gaeumannomyces 无孢,最高同源序列为FJ430719.1 091T5、091T6、091M4、091M6、091M7、098M2、09CT3、09CT4、 09CT8、101S2、101S3、101T2、101T3、101M3、101M4、108S2、 108T3、108T5、108M2、10CS1、10CS2、10CT8、10CT9、10CT10、 10CM4、10CM8 23.23 Rhizopycnis 无孢,最高同源序列为 HQ610505.1 091T2、091T3、091T4、091M3、091M5、098M5、098M8、09CT7、 101T7、101M1、108T4、10CT7、10CM7 8.04 Paraphaeosphaeria 无孢,最高同源序列为 09CM4 0.06 Penicillium 产孢,形态典型 098M6、101T4、101T5、108S3、108M5、10CM1 2.06 Pleosporales 无孢,最高同源序列为 EU041792.1 108T2 0.06 Ramichloridium 产孢,形态典型 09CT6、10CT1 0.27 Sarocladium 产孢,形态典型 098M3、09CM1、10CM5 0.62 Trichocladium 产孢,形态典型 091T7、101T6 0.27 Verticillium 产孢,形态典型 098M4 0.06 Westerdykella 无孢,最高同源序列为 FJ624258.1 09CM3、101S4、101M5、10CS4、10CT3、10CT4、10CM6 2.89 未确定属 形态属的特征与 ITS 序列属的特征不一致 098T2、098M9 两个转抗真菌基因水稻根部内生真菌群落变化的分析 Table 4. Diversity of endophytic fungi form rice roots 表4. 水稻根部内生真菌种类多样性 品种 属数* 菌株数 SHANNON(H′) 均匀度(J) 丰度(DMC) 091 9 15 3.0062 0.9238 0.8477 098 11 12 3.4183 0.9849 0.9675 09C 10 12 3.1887 0.9546 0.9088 101 12 18 3.4613 0.9543 0.8972 108 14 16 3.7500 0.9833 0.9607 10C 18 24 4.0535 0.9746 0.9338 *:有 2个未确定菌株未参加统计。 它们的侵染率达到 90.31%~100%(见图1)。说明转基 因对水稻内生真菌的侵染不产生明显的影响。进一步 对其侵染指数统计分析表明,秧苗期和分蘖期两个转 基因品种的内生真菌侵染指数与对照无显著性差异, 而成熟期转品 1也与对照无显著差异;但 8显著性地 低于对照(见图 2),这种现象有待于进一步分析及研 究。总体来说,通过侵染指数进一步证明了转基因对 水稻基本上不产生显著性影响。 2010 年的重复试验表明,秧苗期,转品 8的内生 真菌侵染率显著地高于对照,而加转品 1与对无显著 性差异。分蘖期及成熟期两个转基因品种与对照无显 著差异(见图 3)。进一步的侵染指数分析表明,秧苗期 的两个转基因品种显著性地高于对照,分蘖期及成熟 期转品 1与对照无显著差异,而转品 8显著性地高于 对照(见图 4)。因此说明水稻转基因作用对水稻根内正 常菌群不产生明显的抑制作用。普遍表现秧苗期不稳 定,但到分蘖期及成熟期趋于平稳。本试验中,转品 8表现个别不正常现象,有待于进行的研究。 4. 结论与讨论 通过对转基因水稻根部内生真菌的研究分析,结 果表明,2009 年和 2010 年的研究结果表现基本一致。 转基因水稻根部内生真菌的分离频率和种类多样性 与对照无显著性差异;根内真菌的侵染率及侵染指数 与对照也无显著性差异。据此可以推论,转 RAC22 基因和转 RCH10 基因的水稻,对水稻根部内生真菌 不产生显著性作用。 近年来,人们对转基因水稻的安全性评价可归纳 为受体植物安全,外源基因,转基因产品,环境安全 4个方面[17]。而受体植物安全性评价主要在表型、农 Figure 1. Colonization rate of endophytic fungi from the roots in different stages of the transgenic rice in 2009 图1. 2009年转基因水稻不同时期根部内生真菌的侵染率 Figure 2. Infecti on index o f endophytic fungi from the ro o ts in different stages of the transgenic rice in 2009 图2. 2009年转基因水稻不同时期根部内生真菌的侵染指数 Figure 3. Colonization rate of endophytic fungi from the roots in different stages of the transgenic rice in 2010 图3. 2010年转基因水稻不同时期根部内生真菌的侵染率 Figure 4. Infecti on index o f endophytic fungi from the ro o ts in different stages of the transgenic rice in 2010 图4. 2010年转基因水稻不同时期根部内生真菌的侵染指数 艺性状、组成成分实质等同性分析、动物营养学评价、 体内及体外毒理学评价、致敏性评价等方面进行[18]。 转基因水稻对微生物群落的影响主要在环境安全性 Copyright © 2012 Hanspub 109 两个转抗真菌基因水稻根部内生真菌群落变化的分析 评价方面来进行[19,20]。而本研究的目标是受体水稻体 内的真菌群落,这些体内真菌与病原菌一样是直接接 受转几丁质酶基因影响的。因此通过对水稻体内的真 菌群落的调查研究,能够从更为直接的角度来反映其 安全性。本研究表明,转RAC22 基因和转 RCH10基 因水稻,对其根部内生真菌不产生显著性影响,但与 对照有差异,这些差异是否会积累或者会减少,有待 于进一步的研究。本文只报道了转基因对水稻根内真 菌群落的影响,对水稻地上部位的影响将展开研究。 5. 致谢 本研究得到中国农业部转基因生物新品种培育 重大专项资助(2009zx08011029B),同时得到广东海洋 大学农学院陈俊呈,叶成峰,黄敏浩和黄陆浩等同学 的帮助,谨此致谢! 参考文献 (References) [1] 李宝健, 朱华晨. 论应用多基因转化策略综合改良生物体遗 传性研究方向的前景Ⅱ. 多基因转化策略中的规律、前景和 问题[J]. 中山大学学报(自然科学版), 2005, 44: 79-83. [2] Z. Jiao, X. Si, G. Li, Z. Zhang and X. Xu. Unintended composi- tional changes in transgenic rice seeds (Oryza sativa L.) studied by spectral and chromatographic analysis coupled with chemo- metrics methods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58: 1746-1754. 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