ABSTRACT

Based on the study of assisted treatment of canine distemper with heat clearing Chinese medicine, In this study, 186 sickness dogs infected with CDV from 3 pet hospitals in Shanghai from 2014-2016 were randomly allocated to two groups. The first group 96 was cured by western medicine. The second group 90 was treated by Traditional Chinese Medicine (TCM) adjuvant treatment based on conventional western medicine. Randomly selecting 64 sickness dogs (32 in each group), the CDV antigens in peripheral blood serum before treatment and 7 days of post-treatment were detected by ELISA. The results showed that before treatment, the average viral content in the TCM adjuvant treatment group was higher than western medicine group. But after the t test, P > 0.05, the difference was not significant. The average virus content of 7 days of post-treatment in the TCM adjuvant treatment group was significantly lower than single use of western medicine group. By t test, P < 0.01, the difference was very significant. It showed that Chinese medicine assisted treatment can kill CDV effectively.

Keywords:ELISA, Chinese Medicine Assisted Therapy, Canine Distemper Virus

ELISA技术检测犬瘟热病的中药辅助治疗临床效果的研究

张永霞，王金福

上海农林职业技术学院，上海

收稿日期：2018年1月2日；录用日期：2018年1月16日；发布日期：2018年1月23日

摘 要

在前期应用中药胶囊辅助治疗犬瘟热研究的基础之上，本研究将上海三家宠物医院2014~2016年就诊的186只犬瘟热病犬随机分成两组，第一组96只，仅用西药治疗。第二组90只，在西药治疗的基础上用课题组研发的中药胶囊进行辅助治疗。后随机选取64只(每组32只)，采集治疗前和治疗7天后的外周血血清中的犬瘟热病毒抗原进行ELISA检测。结果显示：用药前中药辅助治疗组的平均病毒含量高于单用西药组，但经t检验后，P > 0.05，差异不显著；用药7天后中药辅助治疗组的平均病毒含量显著低于单用西药组，经t检验，P < 0.01，差异极显著，表明中药辅助治疗能有效地杀灭犬瘟热病毒。

关键词 :ELISA，中药辅助治疗，犬瘟热病毒

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1. 引言

犬瘟热(canine distemper, CD)也称Carre氏病，是由犬瘟热病毒感染犬和肉食目中许多动物的一种高度接触、致死性、传染性疾病。患病犬早期表现为双相热、急性鼻卡他，后以严重的胃肠炎、支气管炎、肺炎及抽搐等神经症状为特征。个别病例可出现鼻和足垫的重度角化。该病的病死率可达80% [1] ，对宠物行业的影响巨大。犬瘟热的治疗情况一直不够理想，临床上，主要采用注射大剂量高免血清或犬瘟热病毒单克隆抗体，如继发细菌感染，可用阿奇霉素等抗生素治疗，结合用强心、补液、解毒、退热等对症治疗的措施 [2] 。此前，犬瘟热课题组已研发出治疗犬瘟热的清热类中药制剂的成方并制成中药胶囊，而且进行了为期一年的宠物医院临床用药病例记录及统计，最终研究发现，课题组研发的清热类中药胶囊对犬瘟热患病犬有较好的辅助治疗效果。本研究通过ELISA技术对比应用中药治疗和不用中药辅助治疗的患病犬的外周血血清中CDV含量的检测，初步探索出中药对犬瘟热患犬辅助治疗有一定效果的机理，为课题组研发出的中药胶囊大量应用于临床奠定理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 药品

中药胶囊中的中药生石膏、黄芩、黄连等均从上海余天成药店购买；犬六联高免血清产自军需大学兽医学院生物制品研究中心；犬瘟热单克隆抗体生产于北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；诊断试纸为韩国瑞必诊犬瘟快速诊断试纸。

2.1.2. 试剂

犬瘟热病毒(CDV)ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。

2.1.3. 仪器

北京普朗DNM-9606酶标分析仪。

2.1.4. 试验用犬

来自于上海三家宠物医院2014~2016年期间就诊的186只年龄在3个月至12个月的犬瘟热病犬。

2.2. 方法

2.2.1. 犬瘟热病的诊断

用犬瘟快速诊断试纸检测为阳性，并结合出现发热、腹泻、流水样分泌性鼻液等一系列症状来确诊。

2.2.2. 病犬分组

将临床病例分为2组。第一组仅用西药治疗，共96只，即采用注射高免血清、免疫球蛋白、单克隆抗体和干扰素，出现炎症加林可霉素等抗生素，呕吐病例添加东莨菪碱。第二组是在第一组治疗的基础上，用前期课题组研发的中药胶囊进行辅助治疗，共90只。

2.2.3. 待测血清的制备

从上述1.2.2病犬中随机选取64只(每组中各选取32只)，取每只犬治疗前和治疗7天后犬的外周静脉血2 ml，1000 g离心20 min，取上清液即可。

2.2.4. ELISA检测CDV浓度

按照上海江莱生物科技有限公司的犬瘟热病毒(CDV)ELISA试剂盒说明书进行检测：从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出96孔板；设置标准品孔，标准品的浓度依次为0、10、20、40、80、160 ng/ml，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL；样品孔中加入待测样本50 μL，空白孔不加；除空白孔外，标准品孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的待测抗体100 μL，用封板摸封住反应孔，37℃恒温箱温育60 min；弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350 μL)，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；每孔加入A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到直线回归方程，将样品的OD值带入方程，计算出样品的浓度。

2.2.5. 统计分析

所有数据利用Excel软件对两组用药前，用药7天后的CDV浓度进行t检验。

3. 结果

3.1. ELISA检测结果

3.1.1. 第一组

常规西药治疗组犬血清CDV浓度ELISA测定结果：见表1。

3.1.2. 第二组

中药辅助治疗组犬血清CDV浓度ELISA检测结果：见表2。

3.1.3. 两组治疗前后CDV含量对比结果

以治疗情况为横坐标，以两组CDV浓度的平均值为纵坐标，绘制柱状图见图1。

从图中可见，两组治疗7天后的血清病毒含量与治疗前相比均有明显下降。通过统计分析得出用药前第一组的平均病毒含量是68.243，第二组的平均病毒含量是72.103，用药前中药辅助治疗组的平均病

表1. 常规西药治疗组犬血清CDV浓度ELISA测定结果

表2. 中药辅助治疗组犬血清CDV浓度ELISA检测结果

图1. 两组治疗前后CDV含量对比表

毒含量高于单用西药组，但经t检验后，P > 0.05，差异不显著；用药7天后第一组的平均病毒含量是15.339，第二组的平均病毒含量是7.119，经t检验后，P < 0.01，差异极显著，表明中药辅助治疗组的平均病毒含量显著低于单用西药组。

4. 讨论

1) 犬瘟热病的中药治疗方面只有高琳等少数人进行一定的研究 [3] [4] 。前期，课题组研制成治疗犬瘟热的中药胶囊，而且进行了为期一年的宠物医院临床用药情况的记录和统计，研究表明，课题组研发的治疗犬瘟热的中药胶囊对犬瘟热患犬有比较好的辅助治疗效果。本研究是通过ELISA技术检测对比应用中药治疗和未用中药辅助治疗的患犬的外周血血清中CDV含量，结果表明中药辅助治疗7天后，血清中CDV的含量明显低于单独使用西药组，这说明中药辅助治疗能够有效杀灭病犬体内的犬瘟热病毒，为在临床上大量应用此前课题组所研发的治疗犬瘟热的中药胶囊提供理论依据，同时为犬瘟热的中药治疗提供了一定的参考。

2) 中医理论认为鱼腥草、生石膏、黄芩、大黄均性寒，具有清热解毒的效果，主治温热性疾病，中医研究表明鱼腥草、黄芩、大黄等有明显的抗病毒作用 [5] [6] [7] ，犬瘟热病属于瘟热性疾病，课题组研发的中药胶囊中含有桔梗、葶苈、黄芩、炙麻黄、知母、大黄、鱼腥草、杏仁、生石膏、柴胡等中药，本项研究表明鱼腥草、黄芩、大黄等有一定的抵抗犬瘟热病毒的作用。

3) ELISA技术将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机的结合起来，具有灵敏度高、特异性强、对仪器设备要求不高、成本低、操作简便快捷、无放射性污染、自动化程度高、试剂保存时间长等优点，成为最具推广价值的诊断方法 [8] 。本研究采用的ELISA试剂盒，最低检测浓度为1.0 ng/ml，板内变异系数小于10%，板间变异系数小于15%，适用于大批量的检测工作。

4) 本研究是将确诊犬瘟热的186只病犬，分成两组：即仅用西药治疗组96只和添加中药辅助治疗组90只；后从中随机选取64只(每组中各选取32只)进行ELISA技术检测中药辅助治疗效果的研究，符合统计的随机原则。

5. 结论

本研究通过ELISA技术对比检测应用中药治疗和未用中药辅助治疗的犬瘟热患犬的外周血血清中CDV含量，结果表明中药辅助治疗7天后，血清中CDV的含量明显低于单独使用西药组，这说明中药辅助治疗能够有效杀灭病犬体内的犬瘟热病毒，研究表明课题组研发的中药胶囊中的鱼腥草、黄芩、大黄等有一定的抵抗犬瘟热病毒的作用。本研究为在临床上大量应用此前课题组所研发的治疗犬瘟热的中药胶囊提供理论依据。

基金项目

上海农林职业技术学院科研资助项目(KY1-0000-14-07)。

文章引用

张永霞,王金福. ELISA技术检测犬瘟热病的中药辅助治疗临床效果的研究
Study on Clinical Efficacy of Chinese Medicine Assisted Treatment of Canine Distemper by ELISA[J]. 亚洲兽医病例研究, 2018, 07(01): 14-20. http://dx.doi.org/10.12677/ACRPVM.2018.71003

参考文献 (References)