Hans Journal of Chemical Engineering and Technology 化学工程与技术, 2011, 1, 17-21 http://dx.doi.org/10.12677/hjcet.2011.12004 Published Online October 2011 (http://www.hanspub.org/journal/hjcet) Copyright © 2011 Hanspub HJCET Resonance Rayleigh Scattering Method for Determining Patassium Dehydroandrographolide Succinate with Some Acid Dyes Yi Jian1, Lianhui Chen2* 1Department of Physics, North Sichuan Medical College, Nanchong 2Department of Chemistry, North Sichuan Medical College, Nanchong Email: clh-51@163.com Received: Aug. 24th, 2011; revised Sep. 28th, 2011; accepted Sep. 29th, 2011. Abstract: In pH 4.5 butter solution, some acid dyes like Evens blue (EB), pontamine blue (PB) and methyl violet (MV) react rapidly with patassium dehydroandrographolide succinate (PDS) to form complexes, which result in great enhancement of resonance Rayleigh scattering(RRS) and a new RRS spectrum. The maximum RRS peak is near 720 nm. RRS intensities are proportional to the concentration of PDS in the range of 25 mg· L –1 - 900 mg·L–1, 35 mg·L–1 - 950 mg·L–1 and 2 mg·L–1 - 52 mg·L–1 separately. The method has high sensitivity and the detect limit for PRS are 18.5 ng·L–1, 32.1 ng·L–1 and 28.9 ng·L–1 separately. The method has been used for the determination of total amounts of PRS in samples with satisfactory results. Keywords: Resonance Rayleigh Scattering Method; Potassium Dehydroandrographolide Succinate; Determination; Dye 几种酸性染料共振瑞利散射法测定穿琥宁 简 易1,陈莲惠 2* 1川北医学院物理教研室,南充 2川北医学院化学教研室,南充 Email: clh-51@163.com 收稿日期:2011 年8月24 日;修回日期:2011 年9月28日;录用日期:2011年9月29日 摘 要:在pH 4.5 的酸性溶液中,穿琥宁和伊文思蓝、滂胺天蓝、甲基紫等酸性染料结合,导致RRS 增强,并产生新的RRS 光谱,其最大峰位于 720 nm附近。在 25 mg·L–1~900 mg·L–1、35 mg·L–1~950 mg· L –1、2 mg·L–1~52 mg·L–1 浓度范围内,RRS增强与穿琥宁的浓度成正比。方法具有高灵敏度,其检 出限分别为 18.5 ng·L–1、32.1 ng·L–1 和28.9 ng·mL–1。将该方法用于穿琥宁注射液中穿琥宁含量的测定, 结果较满意。 关键词:共振瑞利散射法;穿琥宁;测定;染料 1. 引言 穿琥宁(potassium dehydroandrographolide succinate, PDS)是临床上治疗感冒及病毒引起的急性上呼吸道 炎、流感与流感病毒引起的急性上呼吸道感染、急性 支气管炎、小儿支气管肺炎的常用药物。目前测定PDS 的常用方法有比色法[1]、紫外分光光度法[2]、高效液相 色谱法、反相高效液相色谱法和薄层色谱法[3]。但由 于PDS 为酯类结构,在水中易水解、氧化、异构化和 树脂化,且降解物均有紫外吸收,多种降解物在 251 nm 波长处有吸收而干扰,影响了比色法和紫外分光光 度法的应用;而高效液相色谱法或反相高效液相色谱 法所使用的仪器较昂贵;薄层色谱法灵敏度较低。 近年来,共振瑞利散射法(resonance Rayleigh scattering,RRS)作为一种新的分析技术得到了迅速发 *:通讯作者。 简易等几种酸性染料共振瑞利散射法测定穿琥宁 18 展,它具有很高的灵敏度,比发展较为成熟的紫外分 光光度法高出约3个数量级,检出限可达到ng/mL, 并具有较高的选择性;RRS法可以使用普通光源,用 一般的荧光光度计可获得完整的 RRS 光谱;相对 HPLC 等仪器更经济;不同种类、不同结构的物质经 化学修饰后可以得到不同的RRS光谱,因而可以为研 究药物分子结构、存在形态和反应特性提供更丰富的 信息。这些优点使这一技术在国内国外的研究和应用 得到迅速的发展,在核酸、蛋白质、多糖和某些药物 的研究上已取得明显成效。国外侧重研究生色团聚集 作用导致RRS 增加,并用于核酸、蛋白质等生物大分 子的表征与测定[4],我国与国外几乎同时进行这一领 域的研究[5,6]。RRS 在药物分析中的应用也日益受到关 注[7-9]。本文将RRS技术用于PDS 的定量分析,重点 研究了在酸性介质中,依文思蓝等染料与穿琥宁反应 产物的 RRS 光谱特征、影响因素、适宜的反应条件及 分析特性;并用 RRS技术法测定注射用穿琥宁中的穿 琥宁,获得了较为满意的结果。 2. 实验部分 2.1. 仪器与试剂 Hitachi F-2500 型荧光分光光度计,测定参数:狭 缝宽度 10 nm,光电倍增管(PMT)负电压为 400 V; PHS-4C+酸度计(成都市方舟科技开发公司)。 伊文思蓝(EB,中国上海标本模型厂)水溶液: 0.01%,甲基紫(MV,Fluka进口分装)水溶液:0.01%, 滂胺天蓝(PB,中国上海标本模型厂)水溶液:0.01%, 穿琥宁注射液(成都天台山制药有限公司),嘉比妥因 [注射用穿琥宁,巴里莫尔制药(通化)有限公司],脱 水 穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品(成都天台山制药有限 公司提供,经峰面积归一化法测得含量为 99.63%): 冰箱保存,在使用时稀释到160 ng·mL–1;HAc-NaAc 缓冲溶液(pH = 4.5)。所用试剂均为分析纯,实验用水 为二次蒸馏水。 2.2. 实验方法 于10 mL比色管中依次准确加入 2.0 mL pH 4.5 的Britton-Robinson 缓冲溶液、适量对照品溶液和1.0 mL 0.01%的EB(或PB、MV)溶液,以二次蒸馏水稀释 到刻度并摇匀;放置 15 min 后,将溶液于荧光光度计 上以 λem = λex 方式进行同步扫描,可得共振瑞利散射 光谱,然后于峰值处测定产物溶液的散射光强度 IRRS 和试剂空白的散射强度 0 RRS I ,0 RRSRRS RRS I II 。 3. 结果与讨论 3.1. 共振瑞利散射光谱 分别对 PDS、PDS 和EB 的结合产物进行同步扫 描,得到RRS 光谱,见图 1。 从图 1我们可以看出:EB和PDS 本身的RRS都 比较微弱;当EB 与PDS 发生反应生产缔合物时,引 起了溶液RRS 发生剧烈变化,在 650~760 nm这一范 围内溶液的 RRS 急剧提高,最大 RRS峰位于717 nm, 在690 nm 处还有一肩峰,但由于 717 nm处的峰强度 最大,相比空白值较小,故选择 717 nm 处的散射峰作 为测定峰。同样,对PDS 、PDS 和PB 的结合产物进 行同步扫描,得到RRS 光谱,图谱显示与 EB 和PDS 反应结果惊人的相似:PB本身的 RRS也很微弱,但 当PB 与穿琥宁发生反应生产缔合物时,引起了溶液 RRS 发生剧烈变化,在650~760 nm这一范围内溶液 的RRS急剧提高,最大 RRS峰位于 717.5 nm,在 686 nm 处有一肩峰,但由于 717.5 nm处的峰强度最大, 相比空白值较小,故选择 717.5 nm 处的散射峰作为测 定峰。只是 EB和PB 与PDS 反应后,RRS 强度稍微 有些不同,但它们的RRS 最高峰、肩峰都很相似,且 出现在很相似的波长范围。 1:EB 溶液:1.23 × 10–5 mmol/mL 2:PDS 溶液:8.14 × 10–5 mmol/mL 3~5: EB-PDS 溶液:cPDS分别是 8.14,10.8,13.6 × 10–5 mmol/mL Figure 1. RRS spectra of EB-PDS system 图1. RRS光谱(pH 4.5) Copyright © 2011 Hanspub HJCET 简易等几种酸性染料共振瑞利散射法测定穿琥宁 19 图2是MV 和PDS 反应前后的 RRS 光谱图,从 图上可以看出,无论是峰形、峰值,还是最高峰出现 的波长,都有很大的区别。MV 与PDS 发生反应生产 缔合物时,在 618~768 nm这一较宽范围内溶液的RRS 急剧提高,最大 RRS 峰位于 650 nm,MV-PDS 宁体 系在 718 nm处有一个强度稍弱的散射峰。 EB 和PB与穿琥宁反应后,它们的最大峰和次级 峰峰形和位置相似,可以从图3和图4的结构式得到 解释:EB 和PB 的结构式相当接近,只相差了 2个氧 原子,它们的主要基团都相同,属于双偶氮的萘二磺 酸四钠盐染料,而且基团之间的连接方式也很相似, 所以当它们和穿琥宁反应时,反应条件和反应部位相 似,反应产物的结构也很相似,在荧光光度计上同步 扫描得到的RRS 谱图的相似度自然就高。但MV 的结 构(图5)和前述 2个染料有很大区别,因此几种染料阴 离子和穿琥宁反应得到的缔合物所产生的 RRS 谱图 有较大差异。 3.2. 试验条件选择 分别测定了酸度、增溶剂、PDS浓度和共存物质 等对三种反应体系的RRS 强度的影响,测定结果显示 都很相似:在一定波长范围内穿琥宁溶液本身的 IRRS 十分微弱,且受溶液酸度影响较小,但混合溶液体系 受酸度影响较大;而且当溶液酸度大致 pH 3.0~6.0 时,体系的散射值达到最大且稳定。故本文对各体系 1: MV 溶液:1.23 × 10–5 mmol/mL, 2: PDS 溶液:1.36 × 10–5 mmol/mL, 3~6: MV-PDS 溶液:cPDS 分别是 5.42, 8.14, 10.8, 13.6 × 10–5 mmol/mL Figure 2. RRS spectra of MV-PDS system 图2. RRS光谱( pH 4.5) Figure 3. The structure of EB 图3. EB的结构式 Figure 4. The structure of PB 图4. PB的结构式 Figure 5. The structure of MV 图5. MV的结构式 采用的酸度条件为 pH 4.5,体系适宜的缓冲用量在0.9 ~2.8 mL,本实验采用 2.0 mL;Triton X-100、OP 和 PVA 等增溶剂的加入对体系几乎没有影响,所以本实 验不加入任何增溶剂或表面活性剂;PDS的浓度对体 系的 RRS 光谱轮廓几乎无影响,当穿琥宁在(19.6~782) × 10–6 mol·L–1 时,体系的 ΔIRRS 值较大而且呈线性; 按实验方法考察了一些常见离子、糖类和氨基酸等共 存物质对 EB-PDS 体系RRS 的影响,结果表明:在 PDS 浓度为 5.42 × 10–5 mmol/mL,测定误差小于±5% 时,干扰物质的允许浓度如表1所示。从列表可知: Copyright © 2011 Hanspub HJCET 简易 等 几种酸性染料共振瑞利散射法测定穿琥宁 Copyright © 2011 Hanspub HJCET 20 较大浓度的 4 NH,Cl–、K+、Br–、K+、3 HCO 等大多 数无机离子 定量的氨基酸、糖类均不干扰,而 Bi3+、Re3+、2 4 HPO 和强力霉素等有一定干扰。可见, 该法具有较好 性,可用于实际样品的测定。 3.3. 标准曲线 和一 酯琥珀酸半酯对照品在测定中不稳定,需要转换成单 钾盐,处理后体系RRS 强度至少可以稳定 1.5 h。 的选择 精密吸取脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯对照品溶液 1 mL PB 和MV三种染料与穿琥宁反应 的离 Table 1. Interference of foreign substances(cPDS is 5.42 × 10–5 mmol/mL) 2 干扰物质 允许浓度/×10–5mol·L–1 干扰物质 允许浓度/×10 mol·L–1 干扰物质 允许浓度/×10–5 mol·L–1 3.4.2. 精密度试验 以EB-穿琥宁体系为例,精密吸取对照品溶液 3 mL,按照实验方法于 717 nm处连续测定 6次,其Δ IRRS 值的RSD为0.69%。 3.4.3. 重复性试验 ,2 mL,3 mL,4 mL,5 mL,按照实验方法, 研究了 EB、PB、MV与对照品的反应,于最大散射 波长处测定ΔIRRS 值,以ΔIRRS 为纵坐标,对照品浓度 c( mg·L–1)为横坐标进行线性回归,得回归方程和相关 参数,列于表2。 3.4. 系列试验 取标示量为1.50 mg的同一批样品 5份,以EB- PDS 体系为例,按实验方法平行操作,测定每份样品 中穿琥宁的含量,测得样品的平均含量为1.49 mg,其 RSD = 1.6%。 3.4.4. 回收率试验 以EB-穿琥宁体系为例,精密吸取已知含量的同 批样品 5份,精密加入一定量脱水穿心莲内酯琥珀酸 半酯对照品,按本文方法进行测定,平均回收率为 97.3%,RSD为2.8%。 3.4.1. 稳定性试验 室温下,EB、 子缔合物在10 min 后可完全形成,脱水穿心莲内 表1. 共存物质的影响(PDS 浓度为 5.4 × 10–5 mmol/mL) –5 4 NH,Cl– 1800 强力霉素 0.6 L-组氨酸 150 K+,Br– 1540 Fe3+,2 4 SO 1 D ,L-半胱氨酸 144 Ca2+,Cl– 1300 Na+,2 23 SO 3.1 L-白氨酸 98 3 HCO 300 葡萄糖 SDS 肝P 32 L-酪氨酸 61 2.85 Ni2+,Cl– 12 D-苏氨酸 67 素钠 6 d2+,3 NO 抗 3+ 11 D,L- 酸 7.1 肌醇 12 坏血酸 138 Sb尿素 24 Bi3+ 0.4 天冬氨 60 Mn2+ 9.3 Re3+ 0.2 C-色氨酸 120 2 CO3 668 四K+ 环素 0.5 L-苏氨酸 110 ,HPO2 4 0.15 Table 2. Ralated parameters of the calibration graphs 染料 测定波长( nm) 线性范围(mg/L) 回归方程(n = 6)c/mg/L 检出限(ng/mL) 相关系数(n = 6) 表2. 标准曲线及相关参数 EB 717 25~90△IRRS = 57.9 18.5 0.9992 0 c – 1.8 × 103 PB 717.5 35~950 △RRS M△RRS I = 70.7c – 3.3 × 103 32.1 0.9984 V 650 2~52 I = 728c + 2.4 × 103 28.9 0.9988 简易等几种酸性染料共振瑞利散射法测定穿琥宁 21 Table 3. Determination re sults on = 5) 表3. 样品含量 编号 标示量/mg·mL 平均值/mg·mL–1 RSD/% f PDS in samples ( 测定结果(n = 5) –1 测得量/mg·mL–1 1 20.0 20.1,.0 20.2,19.5,19.8,2019.9 0.28 2 20.0 18.8,18.9,19.7,18.5,16.8 18.5 1.12 3 20.0 19.9,16.7,18.5,19.3,19.5 18.8 1.27 4 20.0 19.6,19.5,19.6,19.4,19.8 19.8 0.58 5 20.0 18.8,19.7,19.8,19.4,19.5 19.4 0.39 6 20.0 20.7,19.9,21.1,19.8,17.3 19.8 1.48 Table 4pare determinRRS with HPethods 表4. RRS法和 HPLC法测定结果比较 高效液相色谱法 . Comation results of PDS by LC m RRS 法 样品 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 1 98.6 2.5 99.7 2.1 2 92.1 3.3 101.3 3.2 3 99.7 3.9 98.5 2.9 4. 应用研究 体系为例,分别精密吸取对照品溶液、 穿琥宁注 以EB-穿琥宁体系为例, 按照实验 谢恩师刘绍璞先生传授给我 RRS 研究思 想!感谢 参考文献 (References) 二部: 452. 法测定穿琥宁注射液的含量 nce light scattering: A gregation. Science, [1] 中华人民共和国药典[Z]. 2005, [2] 汪海波, 褚定侃. 紫外分光光度 以EB-PDS 射液(成都天台山制药有限公司)和嘉比妥因 [注射用穿琥宁,巴里莫尔制药(通化)有限公司]各2 份,在确定的最佳条件下,按照实验方法对其含量平 行测定 5次,结果见表3。 在确定的最佳条件下, 方法,对 PDS 注射液(成都天台山制药有限 公司)和嘉比妥因(注射用穿琥宁,巴里莫尔制药(通化) 有限公司)进行加入一定量(每100 mL 注射液中加入 160 ng·mL–1 的标准品溶液3 mL)的标准穿琥宁溶液做 回收实验,结果如表 4所示。与药典高效液相色谱法 测定该样品所测得的结果基本一致。 5. 致谢 特别感 川北医学院各位领导和同仁提供的帮助。 [J]. 光谱实验室, 2003, 20(5): 747-748. [3] 中华人民共和国药典[Z]. 2000, 一部: 220. [4] R. F. Pasternack, P. J. Collings. Resona new technique for studying chromophore ag 1995, 269(5226): 935-939. [5] 王亚婷, 赵凤林, 李克安等. 有机染料作为光散射探针在分 析应用中的研究进展[J]. 高等学校化学学报, 2000, 21(10): 1491-1497. [6] S. P. Liu, Z. F. Liu. Studies on the resonant luminescence spectra of rhodamine dyes and their ion-association complexes. Spectro- chimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 1995, 51(9): 1497-1500. [7] 胡春梅, 王驰, 朱莉, 赵俊义, 陆巍. 共振 瑞利散射 法测定多 柔比星脂质体中游离多柔比星的含量[J]. 药物分析杂志, 2008, 28(5): 718-722. [8] L. H. Chen, Y. Jian, H. Q. Luo, S. P. Liu and X. L. Hu. Deter- mination of sodium hyaluronate with basic bisphenylnapgthyl- methane dyes by resonance Rayleigh scattering method. Chinese Chemical Letters, 2007, 18(9): 1099-1102. [9] L. Kong, Z. F. Liu, X. L. Hu and S. P. Liu. Absorption, fluorescence and resonance rayleigh scattering spectra of inter- action of papain with calf thymus DNA. Chinese Journal of Chemistry, 2011, 29(4): 822-828. Copyright © 2011 Hanspub HJCET |