¹青岛大学第十一临床学院神经内科，山东 青岛

²临沂市人民医院神经内科，山东 临沂

³锦州医科大学，辽宁 锦州

收稿日期：2022年9月16日；录用日期：2022年10月5日；发布日期：2022年10月13日

摘要

背景：卒中后痴呆是脑卒中后最常见的心理行为障碍并发症，其增加了死亡率，极大降低了卒中患者的生活质量。目前的研究认为，血清微小RNA、氧化应激因子、血清代谢物等生物学标志物等危险因素均可作为PSCI的预警因子，但尚无统一定论。因此亟须寻找新的诊断标志物和诊断方法以提升PSCI患者等的早期检出率。目的：探讨miR-124、miR-132、miR-134对卒中后认知障碍(post-stroke cognitive impairment, PSCI)的预测效能。方法：选取2021年5月至2022年10月本院收治的67例脑梗死患者，根据6个月内是否发生卒中后认知障碍分为PSCI组(n = 33)、卒中后认知正常(post-stroke cognitive normality, PSCN)组(n = 34)，同时收集36例健康对照组的样本。采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法检测miR-124、miR-132与miR-134的表达。ANOVA检验比较三组基线资料和miR-124、miR-132、miR-134与简易智力状态检查量表(MMSE)评分，采用Pearson及偏相关性分析miR-124、miR-132、miR-134与MMSE评分相关性，受试者工作特征曲线(ROC)分析miR-124、miR-132、miR-134预测PSCN的价值。结果：miR-124、miR-132、miR-134均在PSCI组的表达最高，其次是PSCN组和健康对照组；PSCI组的MMSE评分最低，其次是PSCN组和AMC组，差异有统计学意义(P < 0.05)；miR-124、miR-132、miR-134与MMSE评分呈负相关(P < 0.05)；miR-124、miR-132、miR-134预测PSCI的AUC为0.902，大于单一指标预测(P < 0.05)。结论：miR-124、miR-132、miR-134可作为临床评估脑梗死后PSCI发生风险的非侵入性指标，有助于临床早期识别、干预，以改善患者预后。

关键词

卒中后认知障碍，miR-124，miR-132，miR-134，急性缺血性脑卒中，神经缺损，ROC

Prediction of Post-Stroke Cognitive Impairment by Serum miR-124, miR-132, miR-134

Li Li¹, Qi Su², Zhongxiang Xie², Wanqi Liu³, Fengyuan Che^2*

¹Department of Neurology, The 11th Clinical College of Qingdao University, Qingdao Shandong

²Department of Neurology, Linyi People’s Hospital, Linyi Shandong

³Jinzhou Medical University, Jinzhou Liaoning

Received: Sep. 16^th, 2022; accepted: Oct. 5^th, 2022; published: Oct. 13^th, 2022

ABSTRACT

Background: Post-stroke dementia is the most common complication of psychological and behavioral disorders after stroke, which increases mortality and greatly reduces the quality of life of stroke patients. According to the current research, serum micro-RNA, oxidative stress factors, serum metabolites and other risk factors can be used as early warning factors of PSCI, but there is no unified conclusion. Therefore, there is an urgent need to find new diagnostic markers and diagnostic methods to improve the early detection rate of PSCI patients. Objective: To explore the predictive efficacy of miR-124, miR-132 and miR-134 in post-stroke cognitive impairment (PSCI). Methods: Sixty-seven patients with cerebral infarction treated in our hospital from May 2021 to October 2022 were divided into PSCI group (n = 33) and post-stroke cognitive normality group (n = 34) according to the occurrence of post-stroke cognitive impairment within 6 months. At the same time, 36 healthy controls were collected. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of miR-124, miR-132 and miR-134. The baseline data of the three groups and the scores of miR-124, miR-132, miR-134 and mini-mental state examination (MMSE) were compared by ANOVA test. Pearson and partial correlation were used to analyze the correlation between miR-124, miR-132, miR-134 and MMSE scores. The value of miR-124, miR-132 and miR-134 in predicting PSCN was analyzed by receiver working characteristic curve (ROC). Results: The scores of miR-124, miR-132 and miR-134 were the highest in PSCI group, followed by PSCN group and healthy control group, the MMSE score of PSCI group was the lowest, followed by PSCN group and AMC group, the difference was statistically significant (P < 0.05), miR-124, miR-132, miR-134 were negatively correlated with MMSE score (P < 0.05), and the AUC of PSCI predicted by miR-124, miR-132 and miR-134 was 0.902, which was higher than that predicted by single index (P < 0.05). Conclusion: miR-124, miR-132 and miR-134 can be used as non-invasive indexes to evaluate the risk of PSCI after cerebral infarction, which is helpful for early clinical identification and intervention to improve the prognosis of patients.

Keywords:Post-Stroke Cognitive Impairment, miR-124, miR-132, miR-134, Acute Ischemic Stroke, Neurological Deficit, ROC

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1. 前言

卒中是严重危害中国国民健康的重大慢性非传染性疾病，是我国成人致死、致残的首位病因，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率、高经济负担五大特点 [1]。卒中引起的血管性损伤可造成不同程度的卒中后认知障碍 [2]。卒中患者在卒中发生后6个月内，出现记忆力、执行功能、注意力、语言能力、视空间能力受损等认知障碍表现为主的综合征，称为卒中后认知障碍 [3]。其总体发病率高达80.97% [4]。相关研究已证实，卒中可导致关键部位病变，如海马或脑白质病变、微出血等，造成皮质–皮质下环路结构和功能破坏 [5]，且此过程中某些生化指标的变化常早于临床症状变化，或可为临床评价脑梗死后PSCI风险提供参考。微小RNA (microRNA, miRNA)是具有调控基因表达作用的一种非编码小分子，由20~25个核苷酸组成 [6]，能在血清中稳定存在 [7]，近年相继有研究显示，微小RNA (miRNA)作为缺血性脑卒中炎症反应中重要的调控因子，参与缺血神经组织炎症反应的发生和调控，可能对缺血性脑卒中的神经保护具有潜在价值 [8]。本研究探讨miR-124、miR-132、miR-134对PSCI的预测效能。

2. 资料与方法

2.1. 一般资料

选取2021年5月至2022年11月本院收治的67例卒中患者，根据6个月内是否发生PSCI分为PSCI组(n = 33)、PSCN组(n = 34)。同时收集36例健康对照组的样本。所有受试者年龄在45岁到80岁之间。

PSCI的纳入标准是：1) 研究对象有卒中病史和/或神经影像(CT或MRI)提供脑血管疾病的证据；2) 认知障碍被判断为有血管原因，并且MMSE评分 < 27 (对于受教育不超过12年的人，进行1分校正)；3) 引发认知障碍的卒中是患者第一次罹患卒中，发生时间不超过研究前1年；4) 患者意识清楚，无明显智力障碍和语言理解障碍，视力及听力良好，能配合完成各种量表的测评。5) 未曾服用影响认知的药物。6) 征得参加本研究患者或家属的知情同意。

PSCN纳入标准与PSCI患者相同，但MMSE评分大于26分。

健康对照组纳入标准包括：1) 没有认知功能损害的主诉；2) MMSE评分大于26。

卒中组的排除标准是：1) 患有涉及脑器质性病变的神经系统疾病或全身系统疾病，包括Wemick脑病、癫痫、颅脑外伤、中枢神经系统感染、系统性红斑狼疮、癌症等；2) 伴有严重祌经功能缺损(NIHSS评分大于10分)以及影响量表评估和不能配合研究的患者；3) 患有精神疾病，如焦虑(HAMA量表评分大于等7分)、抑郁(HAMD量表大于等于7分)；4) 有重度痴呆病史(临床诊断或治疗)；5) 对首次脑梗死的患者六个月后进行随访，排除复发性脑卒中；6) 患者或家属拒绝配合全部研究过程。

健康对照组排除标准包括6个条件：1) 痴呆症、脑血管疾病和其他可导致认知障碍的中枢神经系统疾病；2) 符合卒中组的后5个条件。

2.2. 主要试剂与仪器

主要试剂与仪器Trizol试剂盒、反转录试剂盒(PrimeSeriptTM RT reagent Kit)、SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒(2 × SYBR Premix Ex TaqTM II)为日本Takara公司产品。氯仿、异丙醇及75%乙醇等均为国产分析纯试剂。氯化三苯基四氮唑(TTC)购自美国Amresco公司。梯度PCR仪(Biorad公司，美国)。实时定量(Real time) PCR仪(ABI 7500，美国)。超低温冰箱(Thermo公司，美国)。低温高速离心机(Heraeus，德国)。

2.3. 研究方法

2.3.1. 简易智力状态检查量表(MMSE)评分

MMSE量表是诊断PSCI患者的痴呆程度常用的评分量表和最常使用的反映PSCI患者痴呆程度的评价量表 [9]。包括时间定向力、地点定向力、即刻回忆、注意力及计算力等，最高分为30分，得分越高认知功能越高。

2.3.2. 抽血及miRNA的提取

抽血及miRNA的提取对每一位研究对象抽取3 mL外周血；取0.3 mL，3000 r/min离心分离血浆，置于－80℃冰箱保存待测。采用TRlzol法，利用mirVanaPAIS miRNA提取试剂盒进行miRNA提取，进行反转录则使用TaqManmiRNA反转录试剂盒进行，最后使用TaqManmiRNA检测试剂盒，采用RT-PCR检测miR-124、miR-132、miR-134的表达。以miR16-5p为内参，用对数变换的2^−ΔCt方法(Log₁₀2^−ΔCt)计算miR的相对表达 [10]。循环miR-16是一种在人类血液中发现的内源性和丰富的miRNA，由于其稳定性，经常被用作内部对照。−ΔCt是通过从miR-16中减去目的miRNA的Ct值来计算的(−ΔCt = CtmiR16 − CtmiRNA)。每个反应重复3次。

2.4. 观察指标

1)收集研究对象临床资料，包括性别、年龄、受教育年限、糖尿病病史、高血压病史、吸烟史、房颤病史、高脂血症史等。2) 对比PSCI组、PSCN组，健康对照组患者血清miR-124、miR-132、miR-134水平。3) 采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清miR-124、miR-132、miR-134诊断脑梗死后PSCI的价值。4) 采用Spearman线性相关性分析血清miR-124、miR-132、miR-134相对表达水平与MMSE评分的相关性。5) 应用Logistic二元回归拟合分析各指标联合的ROC。

2.5. 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件处理研究数据。计数资料用例(%)表示，组间比较采用x²检验；计量资料用均数 ± 标准差(x ± s)表示，组间比较采用成组ANOVA检验与独立样本t检验。计算Spearman相关系数以估计miR-132水平与MMSE评分之间的相关性。通过绘制ROC曲线来评价血清miR-124、miR-132、miR-134相对表达水平的诊断效能。用最高的特异度和敏感度之和来确定最佳的诊断界点。当P < 0.05，表示差异具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 各miRNAs的人口学资料、生化指标和Ct值

各组的人口学资料、生化指标和miRNAs相对表达量如表1所示。健康对照组、PSCN组和PSCI组之间在性别、年龄、受教育年限、吸烟史、糖尿病史、高脂血症及房颤史等方面上差异无统计学意义(P > 0.05)。即健康对照组可看作年龄、性别、文化程度匹配的对照组(age-matched controls, AMC)。AMC组、PSCN组和PSCI组之间的MMSE评分有显著差异(P < 0.05)。MMSE评分受性别、年龄和教育程度的影响。在本研究中，患者的性别、年龄和受教育程度没有显著差异，表明目前的结果不受上述因素的影响。以miR-16为内对照，标准化血清miR-124、miR-132与miR-134水平(Log₁₀2^−ΔCt)。3组间miR-124、miR-132与miR-134表达水平的差异有统计学意义(ANOVA检验，P值 < 0.001)。在PSCI组和PSCN组之间、PSCI组和AMC组之间以及PSCN组和AMC组的配对比较中，血清miR-124、miR-132与miR-134的表达水平有显著差异(独立样本t检验，P < 0.001)。miR-124、miR-132、miR-134均在PSCI组的表达最高，其次是PSCN组和AMC组。这些结果表明，与其他两组相比，PSCI患者血清中miR-124、miR-132、miR-134的相对表达显著上调(P < 0.001)。

3.2. 认知功能与miR-132水平的相关性

分析MMSE评分与血清miR-124、miR-132、miR-134水平的相关性。Spearman相关分析结果显示，miR-124的相对表达与MMSE评分呈负相关(r = −0.394, P < 0.001)，miR-132的相对表达与MMSE评分呈负相关(r = −0.494, P < 0.001)，miR-134的相对表达与MMSE评分呈负相关(r = −0.517, P < 0.001)，见图1。

3.3. 对血管性痴呆患者进行治疗后预后ROC曲线

绘制各指标预测PSCI的ROC，结果显示，血清miR-124、miR-132、miR-134相对表达水平预测PSCI的AUC分别为0.851、0.895、0.831 (P < 0.001)。应用Logistic二元回归拟合分析各指标联合的ROC，结果显示，miR-124 + miR-132 + miR-134预测PSCI的AUC为0.902，大于单一指标预测(P < 0.001)。高血压 + miR-124 + miR-132 + miR-134预测PSCI的AUC为0.902，与miR-124 + miR-132 + miR-134指标预测没有统计学差异。同型半胱氨酸(Hcy) + miR-124 + miR-132 + miR-134预测PSCI的AUC为0.902，与miR-124 + miR-132 + miR-134指标预测没有统计学差异。见表2、图2。

表1. AMC、PSCN和PSCI组患者的一般资料和血清miR的相对表达量的比较

图1. MMSE评分与血清miR-124、miR-132、miR-134水平的相关性

表2. 血清miR-124、miR-132、miR-134相对表达水平预测血管性痴呆患者治疗后预后效果

图2. 卒中后认知障碍患者治疗后预后ROC曲线

4. 讨论

我国卒中后认知障碍非痴呆患者1.5年的病死率为8%，而一旦发展为晚期的卒中后痴呆，其1.5年的病死率升高至50% [8]。因此，在早期识别PSCI患者并进行有效干预是改善患者预后的有力的措施。

miRNA广泛存在于真核生物中，能够参与早期胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡及造血调控等生理过程，是机体内重要的基因表达调控因子。miRNAs在神经系统中大量表达，与脑神经的发育、脑细胞的发育及突触的功能有极大的关系 [11]。且人们普遍认为，循环中的miRNAs与大脑miRNA有关 [12]。

本研究中，PSCI组miR-124、miR-132、miR-134的相对表达水平高于PSCN组。且差异有统计学意义(P < 0.001)，提示PSCI组的miR-124、miR-132及miR-134水平更高。由此可见，PSCI的发生与患者外周血miR-124、miR-132、miR-134的相对表达水平升高有关。ROC曲线分析发现，在预测卒中后血管性痴呆的发生时，血清miR-124相对表达水平敏感度为75.8%，特异性为91.2%；血清miR-132相对表达水平敏感度为81.8%，特异性为82.4%；血清miR-134相对表达水平敏感度为72.7%，特异性为88.2%。由此可见，PSCI患者血清miR-124、miR-132、miR-134可作为PSCI的独立危险因素并预测PSCI的发生。

miR-124属于中枢神经系统中具特异性的miRNA [13]，能够促进小胶质细胞、巨噬细胞转化为M2表型，从而避免神经元损伤 [14]，在脑部的发育及神经的调控中发挥着重要作用。王小林 [15] 等人发现，血管性痴呆的发生与患者外周血miR-124的相对表达水平升高有关。谢民 [16] 等人的研究显示，miR-124大量表达时，能够通过靶向抑制STAT3消除氧化低密度脂蛋白诱导的人主动脉内皮细胞凋亡，对脑神经与脑细胞的血液灌注进行改善。张敬炟 [17] 等人发现MicroRNA-124通过下调下游靶基因PTEN促进脑缺血损伤小鼠神经轴突生长和运动功能恢复。因此，我们可以猜测，当患者出现PSCI时，miR-124表达水平的升高，可能是机体对于大脑的一种保护。对此，在治疗的过程中，可根据PSCI患者miR-124表达水平的测定结果，及时更改治疗方式，及时控制患者治疗过程不良因素的发生，提高其治疗效果。

miR-132是从非编码RNA的内含子转录而来的，已经被证明可以改变神经元的形态和突触的生理功能。Huang [10] 等发现在PSCI患者中血清miR-132明显升高，且患者的MMSE评分与血清miR-132水平呈负相关。Xie [18] 等使用定量实时PCR法检测血清中与阿尔茨海默病相关的7种循环miRNA发现，miR-132在轻度认知障碍患者血清中显著升高。在阿尔茨海默病患者中，miR-132在患者的大脑和脑脊液中下调，而在他们的血清和血浆中上调 [19]。虽然血清miRNAs的来源和控制血清miRNAs生物发生的机制仍有待探索，但miRNAs可能通过受疾病影响的血细胞或组织/细胞的活跃分泌进入循环 [20]。因此可推测PSCI患者血清miR-132表达上调可能与脑和脑脊液miR-132表达下调有关，这可能影响卒中后的认知功能。

MiR-132和miR-134是在学习和记忆背景下研究最多的两个miRNAs [21]。最近的一项miRNA图谱研究显示，miR-134在PSCI患者样本中表达上调 [22]。在海马神经元中过表达miR-134导致树突大小减少，而且miR-134也被证明参与体内树突的发生，促进其在突触发育和可塑性中的作用。此外，miR-134被证明通过Sirtuin1-CREB-BDNF通路在海马中介导LTP和突触可塑性。Jun Gao [23] 等人的研究表明，在脑特异性缺乏基因SIRT1催化活性的突变小鼠中观察到的记忆和突触可塑性的损害至少部分是通过miR-134的上调以及由此导致的miR-134靶基因的翻译抑制来介导的。因此可推测PSCI患者血清miR-134表达上调可能是机体对于大脑的一种保护。

综上所述，miR-124、miR-132、miR-134在PSCI患者血清中明显上调，提示其可能与卒中后认知障碍疾病的发生和病情发展有关。而且miR-124、miR-132、miR-134的表达与卒中后认知功能有很大的相关性，miR-124、miR-132、miR-134可能是PSCI的危险标志物。然而，本研究仅初步探究miR-124、miR-132与miR-134在PSCI患者血清中的表达关系，具体生物学机制仍需继续深入研究。另外，本研究样本例数较少，需扩大样本容量以进行深入研究，以期为PSCI患者的临床治疗提供进一步参考依据。

利益冲突

本文无利益冲突。

作者贡献

李丽进行研究的实施与可行性分析、数据收集、统计学处理、结果的分析与解释，撰写论文；苏琪进行论文的修订；解忠祥负责文章的质量控制及审校；刘婉琪进行数据整理；车峰远进行文章的构思与设计，对文章整体负责，监督管理。

文章引用

李 丽,苏 琪,解忠祥,刘婉琪,车峰远. 血清miR-124、miR-132、miR-134对卒中后认知障碍的预测作用
Prediction of Post-Stroke Cognitive Impairment by Serum miR-124, miR-132, miR-134[J]. 临床医学进展, 2022, 12(10): 9050-9058. https://doi.org/10.12677/ACM.2022.12101309

参考文献