青岛大学附属医院眼科，山东 青岛

收稿日期：2023年8月4日；录用日期：2023年9月1日；发布日期：2023年9月5日

摘要

目的：应用网络药理学方法研究白薇(Cynanchum atratum Bge, CA)和丁香(Syzygium aromaticum, SA)对治疗真菌性角膜炎(Fungal keratitis)的有效成分及其治疗机制。方法：通过中医药系统药理与分析平台(TCMSP)和BATMAN-TEM数据库收集CA/SA的主要有效成分和潜在靶点，应用GEO、OMIM、CTD、GenCLiP 3、DisGeNET、Malacards和Genecards数据库检索FK的治疗靶点。通过String和Cytoscape 3.7.2构建蛋白质–蛋白质相互作用(protein-protein interaction)网络，从而研究CA/SA潜在靶点与FK靶点之间的相互作用。此外，使用R软件、David和WebGestalt分析了基因本体论(Gene Ontology)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes)丰富信号通路。结果：共搜索到71个已分离鉴定的白薇化学成分及434个丁香化学成分，角膜炎相关靶点2031个，白薇和丁香治疗真菌性角膜炎的潜在靶点135个，包含20个直接作用靶点。构建出“成分–靶点–疾病”网络后发现白薇和丁香对治疗真菌性角膜炎与32个靶基因密切相关，GO功能富集分析与KEGG通路富集分析结果显示白薇和丁香对治疗真菌性角膜炎可能涉及的GO功能134个，信号通路主要包括肿瘤坏死因子信号通路、IL-17通路、Toll受体信号通路、Th17细胞分化通路、HIF-1信号通路等，绘制“CA/SA关键靶点–主要通路–FK”可视化网络图，显示出白薇、丁香和真菌性角膜炎与77个共同关键靶点、20条关键靶点作用的通路密切相关。结论：本研究预测了白薇和丁香的活性成分及潜在靶点，对于白薇和丁香对真菌性角膜炎的潜在作用及机制进行了初步探索，为阐明白薇和丁香对真菌性角膜炎的机制提供了科学依据和参考。

关键词

白薇，丁香，真菌性角膜炎，网络药理学，作用机制

To Explore the Mechanism of Action of Cynanchum atratum Bge and Syzygium aromaticum for Fungal Keratitis Based on Network Pharmacology

Weichen Liu, Fan Cong, Cui Li^*

Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao Shandong

Received: Aug. 4^th, 2023; accepted: Sep. 1^st, 2023; published: Sep. 5^th, 2023

ABSTRACT

Objective: To investigate the active ingredients and the therapeutic mechanisms of Cynanchum atratum Bge (CA) and Syzygium aromaticum (SA) on fungal keratitis (FK) by using a network pharmacology approach. Methods: In this study, the main active ingredients and potential targets of CA/SA were collected through the Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) and BATMAN-TCM databases. Therapeutic targets of FK were retrieved by using the GEO, OMIM, CTD, GenCLiP 3, DisGeNET, Malacards and Genecards databases. Protein- protein interaction (PPI) network was constructed to concern the interactions of potential targets of CA/SA with targets of FK through the String and Cytoscape 3.7.2. Furthermore, R software, David and WebGestalt were used to analyze gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) signaling pathway enrichment. Results: A total of 71 isolated and identified chemical components of CA and 434 chemical components of SA, 2031 targets related to keratitis, 135 potential targets of CA and SA in the treatment of fungal keratitis were searched, including 20 direct targets. After constructing the “component-target-disease” network, it was found that CA and SA were closely related to 32 target genes in the treatment of fungal keratitis. The results of GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis showed that CA and SA might be involved in 134 GO functions for the treatment of fungal keratitis. The signal pathways mainly include tumor necrosis factors signaling pathway, IL-17 signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, Th17 cell differentiation signaling pathway, HIF-1 signaling pathway and so on. The visual network map of “CA/SA key target-main pathway-FK” was drawn. The results showed that CA/SA and fungal keratitis were closely related to 77 common key targets and 20 key targets. Conclusion: This study predicted the active components and potential targets of CA and SA, and explored the potential effect and mechanism of CA and SA on fungal keratitis, which provided scientific basis and reference for elucidating the mechanism of CA and SA on fungal keratitis.

Keywords:Cynanchum atratum Bge, Syzygium aromaticum, Fungal Keratitis, Network Pharmacology, Mechanism

Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

本文提出了一种基于网络药理学方法，以阐明白薇、丁香治疗真菌性角膜炎的多组分、多靶点和多途径的潜在作用模式。真菌性角膜炎在发展中国家是最常见的致盲眼病 ‎[1] ，其中最常见的致病菌包括镰刀菌属、曲霉菌属、念珠菌属，治疗不当可能会发展成眼内炎、角膜穿孔，威胁患者视力，因此真菌性角膜炎的研究机制是十分必要的，白薇和丁香是治疗真菌感染的著名中药 ‎[2] 。白薇(Cynanchum atratum Bge, CA)为萝藦科鹅绒藤属植物，白薇性寒，味苦、咸，具有清热凉血、利尿通淋、解毒疗疮等多种功效，白薇具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、改善记忆、免疫抑制、退热、皮肤美白和肝脏保护等多种药理作用 ‎[3] 。国内外对白薇的研究报道还是相对较少，并且大多集中于研究白薇中甾体皂苷类的化学成分和药理作用，对其他成分的研究报道较少 ‎[4] 。丁香(Syzygium aromaticum, SA)，为桃金娘科植物丁香Eugenia caryophμllata Thunb的干燥花蕾，主产于桑给巴尔、马达加斯加等地，丁香具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗心肌缺血、抗肿瘤等多种作用 ‎[5] 。本研究应用生物信息学数据库和在线分析软件，获得及分析白薇和丁香的活性成分、靶点、真菌性角膜炎等信息，预测潜在作用靶点，利用“白薇丁香–靶点–真菌性角膜炎”网络关系，研究白薇和丁香可能治疗角膜炎的作用机制，提供了科学依据和信息参考。研究实验步骤的流程图如图1。

图1. 基于网络药理学探讨白薇和丁香对真菌性角膜炎的作用机制流程图

2. 材料与方法

2.1. 数据准备

2.1.1. 有效成分及相关靶标筛选

我们使用了TCMSP (http://tcmspw.com/tcmsp.php)和BATMAN-TEM ‎[6] (http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)专为中药设计的在线分析平台数据库，搜索关键词“baiwei”、“dingxiang”，收集这两种中药中的有效候选成分和相关靶点。口服生物利用度(Oral bioavailability, OB)和类药物度(Drug like, DL)是药物筛选中的两个主要药代动力学参数。在TCMSP中，我们选择了OB≥为30%，DL≥为0.18 (DrugBank数据库的平均值)的成分作为CA和SA的潜在有效成分 ‎[7] 。在这项工作中，根据这些筛选标准，最初省略了包括丁香酚及其衍生物在内的几种化学成分。然而，由于它们广泛的药理活性，它们仍然被列入候选成分进行进一步分析 ‎[8] 。我们搜索了CA和SA的相关靶点。然后，使用UniProt数据库将靶标转换为人类相关基因符号 ‎[9] 。在本研究中，还利用BATMAN-TEM数据库补充了CA和SA的有效成分和靶点(靶点预测分数：20；调整后的P值：0.05)。

2.1.2. FK相关靶点的收集

FK相关靶点从以下六个数据库中收集：Genecards数据库(https://www.genecards.org/)；Malacards数据库(https://www.malacards.org)；DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/)；OMIM数据库 (https://omim.org)；GenCLiP3数据库(http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php)；CTD数据库 (http://ctdbase.org/)。计算机检索“真菌角膜炎”、“烟曲霉菌角膜炎”、“镰刀菌角膜炎”、“白色念珠菌角膜炎”等关键词，仅检索“人类”相关基因/蛋白。

从NCBI-GEO数据库(GSE58291)获取与FK相关的数据集，以确定非感染性角膜(NC, n = 12)和真菌性角膜炎(n = 8)之间表达基因(DEG)的差异。以|LogFC| > 1为标准，用R软件3.6.2 (pheatmap, limma bioconductor)检测NC与FK之间的差值，并调整P值 < 0.05。因此，从上述包括GEO数据库在内的七个数据库中获得了与FK相关的目标。然后，剔除与FK相关的重复目标，共选择2031个目标。此外，通过R软件3.6.2和生物信息学及进化基因组数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将CA/SA相关靶点与FK相关靶点进行比较，选择重叠的靶点作为CA/SA治疗FK的潜在靶点。

2.2. 网络构建

2.2.1. 成分–靶点–疾病网络构建

本研究利用成分–靶点–疾病网络研究中药成分(CA或SA)、FK和靶点之间的复杂关系。将以上收集的所有结果整合在一起，通过Cytoscape软件(3.7.2版)建立图形网络。在这个网络中，节点代表生物成分(中药活性成分、靶标)或FK，边代表分子间相互作用(成分–靶点或靶点–FK)。然后，从NCBI-PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)或ChemSpider数据库(https://www.chemspider.com/)中检索该网络中活性成分的2D化学结构。

2.2.2. 蛋白质–蛋白质相互作用(PPI)数据

识别的靶点由STRING数据库(http://string-db.org/)处理，以获得有关蛋白质相互作用的信息。在本研究中，通过软件，设置置信度为≥0.95，构建了PPI网络。然后，利用Cytoscape 3.7.2中的CytoHubba插件和R软件分析了这个PPI网络的前20个核心基因。在PPI网络中，核心基因由与其相连的边数来表示。然后，我们从PPI网络中选择了前30个核心基因(≥4个边)，利用Cytoscape中的BisGenet插件构建了一个相互作用网络。利用CytoNCA插件评估节点的网络拓扑属性，包括度中心度(Degree centrality, DC)、介数中心度(Betweenness centrality, BC)、贴近度中心度(Closeness centrality, CC)、特征向量中心度(Eigenvector centrality, EC)、网络中心度(Network centrality, NC)和局部平均连通度(Local average connectivity, LAC) 6个参数。这六个参数代表了网络中每个节点的拓扑重要性。节点的六个量化值越高，该节点在该网络中的重要性就越大。

2.2.3. 靶点的GO和KEGG富集度分析

此外，重叠靶点的GO和KEGG途径的富集度均通过Cytosscape和R 3.6.2 (ClusterProfiler、Rich Plot、Date、Colorspace、Strigi、Gggploy Package)进行可视化，P值为≤0.05。这些数据也被上传到WebGestalt数据库(http://www.webgestalt.org/)，用于制作KEGG路径的火山图。同时，在David数据库 (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)和WebGestalt数据库中搜索潜在的靶基因，以更深入地了解GO的三类富集物：生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞定位(CC)。

3. 结果

3.1. 真菌性角膜炎差异表达基因的鉴定

共分析出12个正常非感染性角膜和8个FK组织，病原菌分别为镰刀菌属(n = 5)、曲霉菌属(n = 2、黄曲霉属和土曲霉属)和链球菌属(n = 1)。我们从GSE58291中提取了1366差异表达基因，在FK中有536个下调基因(logFC < 0)和830个上调基因(logFC > 0) (图2)。

图2. 真菌性角膜炎差异表达基因的鉴定

3.2. CA和SA治疗FK的潜在靶点

在本研究中，我们分别筛选出了CA、SA和FK的71、434和2031个靶点。通过R软件，有135个重合靶点在CA、SA和FK (图3(a))之间重叠。我们利用生物信息学和进化基因组学在线工具(图3(b))，根据CA、SA和FK目标的交叉点维恩图找到了18个重要目标。上述18个共同基因可能在FK的治疗中起重要作用。

图3. 显示CA、SA和FK的重叠目标的维恩图

3.3. 成分–靶点–疾病网络

根据我们对CA/SA化学活性成分–靶点和靶点–FK的预测，使用Cytoscape 3.7.2将两种预测结果合并成网络图。在这个网络中，我们分别从CA和SA中鉴定出14种和18种有效成分，成分和FK之间有135个重叠的目标。通过TCSMP和BATMAN-TEM数据库收集了32种成分。也就是说，这些成分是治疗FK的潜在化合物(图4)。

图4. 成分–靶点–疾病网络图

3.4. 蛋白质–蛋白质相互作用(PPI)数据

通过CytoHubba软件、R软件及BisGenet插件等构建相互作用网络(图5)。

图5. PPI网络流程图

3.5. CA/SA-FK共同靶点的GO生物功能富集分析

GO富集分析共有GO条目134个，通过R语言，根据FDR由小到大的顺序分别筛选出可能与CA/SA治疗FK的作用密切相关的前20个条目，潜在靶点富集于脂多糖反应、活性氧反应等生物过程，多数为膜区、囊泡腔等细胞定位，主要用于核受体活化、细胞因子活性等功能(图6)。

图6. CA/SA活性成分治疗真菌性角膜炎潜在靶点的GO功能富集分析

3.6. CA/SA-FK共同靶点的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析，以FDR < 0.05为筛选依据，按FDR值由小到大排序选出前20条代谢通路，绘制气泡图，由图可见，主要涉及肿瘤坏死因子信号通路、IL-17通路、Toll受体信号通路、Th17细胞分化通路、HIF-1信号通路等，以上信号通路可能与CA/SA治疗FK的作用密切相关(图7)。

图7. 显示KEGG富集结果气泡图(前20)

3.7. CA/SA关键靶点–主要通路–FK网络的构建

图8. 显示CA/SA关键靶点–主要通路–FK的网络分析

运用Cytoscape软件绘制“CA/SA关键靶点–主要通路–FK”可视化网络图，结果如图所示，网络图展示了与CA/SA和FK相关联的77个共同关键靶点、20条关键靶点作用的通路。结果充分体现了CA/SA通过作用于多个靶点、再交叉作用于多个通路而发挥治疗FK的作用特点(图8)。

4. 讨论

本研究运用网络药理学对白薇和丁香治疗真菌性角膜炎的活性成分、治疗靶点及分子机制进行分析及预测。其中从白薇分离鉴定的14个有效成分，包括β-谷甾醇、木犀草苷、直立白薇根含白薇素、白薇苷F、G、对羟基苯乙酮、3’,4’-二羟基苯乙酮、罗布麻宁等，丁香中分离鉴定的18个有效成分，包括山奈酚、异长春花苷内酰胺、槲皮素、齐墩果酸、丁香酚、阿魏醇、B-石竹烯、丁香酮等，它们可能是治疗真菌性角膜炎的活性成分。贾奕奕等人 ‎[10] 研究证实山奈酚能够减少真菌负荷、减轻炎症细胞聚集以及减少炎症相关介质IL-1β、TNF-α、MIP-2的表达，其机制是通过发挥对模式识别受体Dectin-1和促炎通路p38 MAPK的抑制作用。Yin J等人 ‎[11] 证实槲皮素能减轻炎症过程中中性粒细胞募集和浸润，通过下调TLR-4、TLR-2、TNF-α、IL-1β和HMGB1的产生治疗真菌性角膜炎，槲皮素具有明显抗炎和抗真菌的作用。

另外，白薇–丁香治疗真菌性角膜炎涉及18个核心基因，包括MAOA、BCL2、Ptgs2、ESR1、IKBKB、NCOA1、CASP9、ALOX5、DPP4、KCNH2、NR3C1、Chuk、ADRB2、CASP3、PTGS1、Jun、Bax、PRKCA；经GO分析，潜在靶点富集于脂多糖反应、活性氧反应、类固醇激素反应、氧化应激反应等生物过程，多数为膜区、转录因子复合体、囊泡腔等细胞定位，主要用于核受体活化、细胞因子活性、转录因子活性，配体调节特异的DNA结合等分子功能；KEGG结果表明白薇–丁香治疗真菌性角膜炎涉及的信号通路主要包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体切应力和动脉粥样硬化信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、人巨细胞病毒感染通路、肿瘤坏死因子信号通路、乙型肝炎信号通路、麻疹信号通路、甲型流感信号通路、松弛素信号通路、丙型肝炎信号通路、IL-17通路 ‎[12] 、前列腺癌信号通路、查加斯病(美国锥虫)信号通路、胰腺癌信号通路、Toll受体信号通路、Th17细胞分化通路、HIF-1信号通路、弓形虫病信号通路、化学致癌信号通路、癌信号通路。目前关于真菌性角膜炎主要涉及TLR4/MyD88/NF-κB通路、Nrf2/HO-1信号通路等，于冰等人 ‎[13] 研究证实丁香酚在烟曲霉菌性角膜炎中发挥抗炎和抗真菌作用。丁香酚通过激活Nrf2/HO-1信号通路，抑制炎症介质的表达。此外，丁香酚起到减轻孢子黏附，破坏真菌生物膜的作用。

综上所述，白薇–丁香治疗真菌性角膜炎具有多系统、多成分、多靶点的调控作用，通过网络药理学对其分子学机制分析，阐释了白薇–丁香活性成分可能作用于MAPK1、AKT1、CASP9、IL-1β等靶点(图7)，通过HIF-1信号通路、Toll受体信号通路、肿瘤坏死因子等信号通路发挥抗炎、抑菌等活性作用。真菌性角膜炎的复杂机制尚未清楚，因此，通过网络药理学所体现的多途径通路为临床应用提供科学依据，也奠定了进一步开展实验研究的基础。

文章引用

刘韦辰,丛 凡,李 翠. 基于网络药理学探讨白薇和丁香对真菌性角膜炎的作用机制
To Explore the Mechanism of Action of Cynanchum atratum Bge and Syzygium aromaticum for Fungal Keratitis Based on Network Pharmacology[J]. 临床医学进展, 2023, 13(09): 13989-13998. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.1391956

参考文献