ABSTRACT

Objective: To explore the effect of HIPK2 on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. Methods: A mouse model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis was successfully constructed, and a stable overexpressing HIPK2 adenovirus vector was constructed. 15 mice were divided into Mock group, Ad-Control group, and Ad-HIPK2 group. HE Masson staining was performed on the lung tissue. The expression of mRNA and protein of HIPK2 and α-SMA were used RT-PCR, Western Blot method. Results: The expression of HIPK2 in Bleomycin-induced pulmonary fibrosis mouse was down-regulated (P < 0.05), α-SMA expression up-regulated (P < 0.05), and the degree of fibrosis increased; overexpression of HIPK2 can inhibit fibroblast activation, down-regulate the expression of α-SMA (P < 0.05), and the degree of pulmonary fibrosis was reduced. Conclusion: HIPK2 deficiency plays an important role in the mechanism of pulmonary fibrosis. HIPK2 can inhibit the activation of fibroblasts and reduce pulmonary fibrosis.

Keywords:HIPK2, Pulmonary Fibrosis, Bleomycin, Mice

同源结构域相互作用蛋白激酶2 (HIPK2)对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的影响

张亚楠，于文成

青岛大学附属医院呼吸与危重症医学科，山东 青岛

收稿日期：2020年5月25日；录用日期：2020年6月15日；发布日期：2020年6月22日

摘 要

目的：探讨HIPK2对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的影响。方法：成功构建博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，构建稳定过表达HIPK2腺病毒载体，设为对照组、模型组和过表达HIPK2组，每组各5只，对肺组织进行HE和Masson染色，并用RT-PCR、Western Blot法测定肺组织中HIPK2和α-SMA含量。结果：博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型中HIPK2表达下调(P < 0.05)，α-SMA表达上调(P < 0.05)，且纤维化程度加重；过表达HIPK2可抑制成纤维细胞的激活，使α-SMA表达下调(P < 0.05)，且肺纤维化程度减轻。结论：HIPK2缺乏在肺纤维化机制中具有重要作用，HIPK2可抑制成纤维细胞的激活，减轻肺纤维化。

关键词 :同源结构域相互作用蛋白激酶2，肺纤维化，博来霉素，小鼠

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1. 引言

肺纤维化是一种慢性、进行性、致死性的肺间质疾病，其病因不明，且发病率逐年增加 [1]，该病更常见于男性及吸烟患者，中位生存期平均3~5年，IPF患者的治疗选择有限，肺移植是唯一可以明显改善患者生存率的治疗方法 [2]。因此，探讨IPF的发病机制，寻找新的治疗靶点及针对新的靶点的治疗药物，是今后IPF研究的关键。同源结构域相互作用蛋白激酶-2 (HIPK2)是一种通过调节各种基因和信号分子，HIPK2的缺乏在成纤维细胞行为和IPF发病机理中具有重要作用 [3]。本实验建立博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型，观察上调HIPK2对小鼠肺纤维化程度及间质标志物α-SMA的影响。

2. 材料和方法

2.1. 材料

8周龄的SPF级雄性C57BL/6小鼠，体重每只约20 g (北京中国医学科学院实验动物研究所提供)；anti-HIPK2、anti-α-SMA、anti-GAPDH (Abcam，美国)，本次动物实验获得青岛大学动物实验伦理委员会许可。

2.2. 方法

2.2.1. 构建腺病毒载体

合成和测序目的基因，对目的基因和载体进行连接，热休克法转化感受态大肠杆菌，取其中的单克隆菌落培养并提取质粒，在酶切后对其进行测序，成功构建pAdTrack-CMV/HIPK2、pAdTrack-U6/sh-HIPK2。纯化质粒并将重组腺病毒载体转染293A细胞并且大量扩增，建带有GFP示踪基因的Ad-HIPK2腺病毒载体，鉴定正确后进行扩增、浓缩纯化，并测定腺病毒的滴度，用于实验。

2.2.2. 构建动物模型

将15只C57小鼠，随机分3组，每组5只，具体分组情况如下：A：对照组(Mock组) B：模型组(Ad-control组) C：模型组+HIPK2过表达组(Ad-HIPK2组)。将70 uL博莱霉素溶液(浓度为1 mg/mL，剂量约为3.5 mg/kg)滴入小鼠气管进行肺纤维化造模，对照组使用等体积无菌生理盐水，常规SPF级动物房喂养。造模次日于小鼠尾静脉注射相应的腺病毒(5 × 10⁹ PFU/只)。实验过程中观察小鼠饮食情况，于第7天处死实验小鼠，收集肺组织。

2.2.3. 模型纤维化评估

将固定24 h的肺组织常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制作5 μm厚的连续切片，每片相距30 μm，用苏木精–伊红(HE)染色进行结构观察，用Masson染色检测胶原沉积，高倍镜下拍照，200×。于显微镜下观察肺组织纤维化程度。

2.2.4. RT-PCR测定肺组织HIPK2、α-SMA的含量

研磨肺组织、裂解、过滤并离心提取总RNA，并逆转录获得cDNA。荧光定量PCR扩增待检测基因和内参β-actin，使用表1所示的引物进行PCR反应。循环温度为：94℃ 4 min, 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s 40个循环。

表1. 用于PCR分析的引物序列

2.2.5. Western Blot检测肺组织中HIPK2、α-SMA的表达变化

RIPA裂解液裂解肺组织，收集总蛋白，BAC法测定各样品蛋白质浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF膜转膜，2%的BSA中封闭，分别用anti-HIPK2、anti-α-SMA、anti-GAPDH孵育膜，辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗(天津赛尔，中国)进行孵育，洗涤后用化学发光法显色，在暗室曝光并进行显影、定影处理，用Lab Works^TM凝胶成像及分析系统扫描所有胶片，分析各蛋白条带的亮度值，计算校正后的目的蛋白相对表达量。

图1. HIPK2在各组小鼠中的表达情况。A：通过qPCR检测HIPK2 mRNA表达。B Western blot 检测HIPK2蛋白表达。^*：与Ad-control组相比，p < 0.05，n = 5

2.2.6. 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件，两组间均数的比较采用单因素方差分析的Dunnet事后比较，实验数据以 $\bar{x}\pm s$ 表示，P < 0.05时差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. HIPK2在肺纤维化小鼠体内低表达

RT-PCR和Western Blot检测显示(图1)，与Mock组相比，HIPK2的mRNA和蛋白表达在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型组中是低表达的；Ad-HIPK2组可稳定过表达HIPK2，p < 0.05，n = 5。

3.2. HIPK2能减轻博来霉素诱导小鼠肺纤维化程度

HE和Masson染色可见(图2)，与Mock组相比，模型组肺纤维化程度加重；与模型组相比，HIPK2过表达组纤维化程度减轻。

图2. 各组小鼠肺组织HE和Masson染色，200×

图3. α-SMA在各组小鼠中的表达情况。A：RT-PCR检测α-SMA mRNA表达，B：Western blot检测α-SMA蛋白表达。^*：与Ad-control组相比，p < 0.05，n = 5

3.3. HIPK2能抑制成纤维细胞的活化

RT-PCR和Western Blot检测显示(图3)，与Mock组相比，模型组中α-SMA的mRNA和蛋白表达增加；Ad-HIPK2组较模型组减少，p < 0.05，n = 5。

4. 讨论

目前认为肺纤维化的病理学过程表现为在各种致纤维化因素作用下，肺泡上皮细胞弥漫性损伤，激活成纤维细胞，大量分泌胶原纤维，胶原纤维等细胞外基质的异常沉积引起组织收缩，最终发展成为广泛的纤维化变化 [4] [5]。

同源结构域相互作用蛋白激酶2 (HIPK 2)是保守的丝氨酸/苏氨酸同源结构域相互作用激酶家族的一部分，是一种重要的转录辅助调节蛋白 [6] [7]。研究发现HIPK 2有多种功能，包括转录因子的共同调节、生长、发育、形态发生和细胞死亡的调控、肿瘤抑制和DNA损伤反应的调节 [8] [9]。HIPK在癌症和慢性纤维化中已成为有希望的药物靶点 [10]。研究发现，HIPK2通过调节促凋亡、促纤维化和促炎症通路，被认为是肾纤维化的重要驱动因素，可能是抗纤维药物的潜在靶点 [11]。尚有研究发现，HIPK2参与Sigma-1受体在二氧化硅致纤维化中的调控作用 [12]。对于HIPK2在博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠中研究较少。

我们构建了博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，证明HIPK2在纤维化肺组织中是低表达的；同时构建稳定过表达HIPK2的腺病毒载体，通过染色发现转染该载体的小鼠肺组织肺纤维化程度较模型组减轻，且其间质标志物α-SMA表达下降，说明过表达HIPK2能抑制成纤维细胞的活化。我们的研究与Ricci等人相符，其证实IPF人成纤维细胞HIPK2表达降低，认为肺成纤维细胞中HIPK2基因的缺失可能会抑制P53的活化，从而促进了肺成纤维细胞的凋亡，促进肺纤维化的发生 [3]。我们从体内实验明确了HIPK2在纤维化肺组织内的表达情况，并证实过表达HIPK2可减轻肺纤维化。下一步，我们将设立体外实验进一步探究HIPK2减轻肺纤维化的具体机制，为治疗提供更新的靶点。

文章引用

张亚楠,于文成. 同源结构域相互作用蛋白激酶2 (HIPK2)对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的影响
The Effect of HIPK2 on Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis in Mice[J]. 临床医学进展, 2020, 10(06): 1091-1096. https://doi.org/10.12677/ACM.2020.106164

参考文献