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Traditional Chinese Medicine
Vol. 12  No. 07 ( 2023 ), Article ID: 69874 , 9 pages
10.12677/TCM.2023.127265

茜草药材及其配方颗粒TLC及HPLC指纹 图谱研究

刘红云1*，刘琴1，王祥培2，吴红梅1#

1贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳

2贵州民族大学民族医药学院，贵州 贵阳

收稿日期：2023年5月31日；录用日期：2023年7月18日；发布日期：2023年7月31日

摘要

目的：建立茜草药材及其配方颗粒的薄层色谱(TLC)和高效液相(HPLC)指纹图谱。方法：TLC法：展开剂为石油醚–丙酮(4:1.3)，在365 nm紫外光灯下检视。HPLC法：色谱柱为Diasonsil C18 (4.6 mm × 250 mm)，流动相为甲醇(A)-0.1%的磷酸水(B)，梯度洗脱，进样量10 μL，柱温30℃，体积流量1.0 mL/min。然后结合中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A版)进行相似度分析。结果：所建立的20批茜草药材及其配方颗粒的TLC法，斑点清晰，分离度良好；建立茜草药材及其配方颗粒的指纹图谱，共有16个共有色谱峰，20批茜草药材及其配方颗粒的指纹图谱相似度 > 0.527，两者化学成分存在一定差异。结论：该研究采用薄层色谱法和HPLC指纹图谱可综合评价茜草药材及其配方颗粒之间的质量差异，从而为茜草及其配方颗粒的质量控制研究提供参考依据。

关键词

茜草，配方颗粒，指纹图谱，质量控制

Study on TLC and HPLC fingerprint of Rubia cordifolia and Its Formula Granules

Hongyun Liu1*, Qin Liu1, Xiangpei Wang2, Hongmei Wu1#

1School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang Guizhou

2School of Chinese Ethnic Medicine, Guizhou Minzu University, Guiyang Guizhou

Received: May 31st, 2023; accepted: Jul. 18th, 2023; published: Jul. 31st, 2023

ABSTRACT

Objective: To establish thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) fingerprints of Rubia cordifolia L. and its formula granules. Methods: TLC method: The developing agent is petroleum ether-acetone (4:1.3), and it is examined under 365 nm ultraviolet light. HPLC method: The chromatographic column is Diasonsil C18 (4.6 mm × 250 mm), mobile phase is methanol (A)-0.1% phosphoric acid water (B), gradient elution, injection volume 10 μL. The column temperature is 30˚C, and the volume flow rate is 1.0 mL/min. Then, similarity analysis was conducted using the similarity evaluation software for traditional Chinese medicine chromatographic fingerprints (2004A version). Results: The TLC method for the 20 batches of Rubia cordifolia L. and its formula granules established showed clear spots and good separation. HPLC fingerprint of Rubia cordifolia L. and its formula granules was established, 16 common peaks were identified. The similarity of fingerprint spectra of 20 batches of Rubia cordifolia L. and its formula granules is greater than 0.527, indicating certain differences in their chemical composition. Conclusion: This study uses TLC and HPLC fingerprint to comprehensively evaluate the quality differences between Rubia cordifolia L. and its formula granules, thus providing a reference basis for the quality control research of Rubia cordifolia L. and its formula granules.

Keywords:Rubia cordifolia L., Formula Granules, Fingerprint, Quality Control

Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

中药茜草来源于茜草科茜草属植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根和根茎，其味苦、性寒，具有凉血止血、祛瘀、通经的功效，用于吐血、衄血崩漏、外伤出血、瘀阻经闭、关节痹痛、跌扑肿痛 [1] 。现代药理学研究表明茜草具有抗菌消炎、止血、抗癌、护肝等药理作用 [2] [3] [4] [5] ，临床上可以用于治疗子宫异常出血等疾病 [6] 。配方颗粒是中药饮片经过浸提、浓缩、干燥、制粒等工艺加工制成的中药单品，既保存汤剂的特点，又具有携带方便和服用方便等特点，但配方颗粒没有统一的质量控制标准 [7] [8] [9] [10] 。由于茜草化学成分复杂，制粒过程成分损失严重，导致其质量存在一定的差异。因此，本研究建立茜草药材及其配方颗粒的薄层色谱和HPLC指纹图谱，为茜草配方颗粒的质量控制提供参考。

2. 实验材料

2.1. 仪器

硅胶G板(青岛海洋化工厂有限公司)，KQ-100E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，紫外灯(上海智岩科学仪器有限公司)，DFT-50A高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，Waterse-2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，HH-6数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)，AL204-IC/万分之一分析天平(METTLE RTOLEDO仪器有限公司)。

2.2. 试剂

甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)，磷酸(色谱纯，重庆川东化工有限公司)，石油醚(分析纯，重庆川东化工有限公司)，丙酮(分析纯，遵义师范学院化学试剂厂)，水为哇哈哈纯净水(贵州娃哈哈集团有限公司)。

2.3. 药材

茜草药材来源不同，且经贵州中医药大学王祥培教授鉴定，均为茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根和根茎。药材及配方颗粒来源见表1。

Table 1. Source of Rubia cordifolia L. and its formula granules

表1. 茜草药材及配方颗粒的来源

3. 实验方法

3.1. 薄层色谱鉴别研究

参照《中国药典》2020版制备供试品溶液，取本品药材粉末0.5 g，加甲醇10 mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至1 mL。按上述方法制得配方颗粒供试品溶液。吸取以上制备的样品溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚–丙酮(4:1.3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。

3.2. HPLC指纹图谱鉴别研究

3.2.1. 供试品溶液的制备

取10批茜草药材样品约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加25 mL甲醇，密塞，称定重量，超声提取(功率250 W，频率35 kHz) 30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得茜草药材供试品溶液；同上述方法制得配方颗粒供试品溶液。

3.2.2. 色谱条件

色谱柱为Diasonsil C18 (4.6 mm × 250 mm)，流动相为甲醇(A)-0.1%的磷酸水(B)，梯度洗脱见表2，进样量为10 μL，柱温为30℃，体积流量为1.0 mL/min，分析时间为100 min。

Table 2. Mobile phase gradient elution table

表2. 流动相梯度洗脱表

4. 实验结果

4.1. 薄层色谱鉴别研究

10批茜草药材色谱图中荧光斑点数为5~7个，10批配方颗粒样品在相应的图谱位置上均有7个相同颜色的斑点，见图1。

石油醚–丙酮(4:1.3)

Figure 1. Thin layer chromatogram of 20 batches of Rubia cordifolia and its formula granules

图1. 20批茜草药材和颗粒薄层色谱图

4.2. HPLC指纹图谱研究

4.2.1. 精密度试验

取同一批次的茜草样品，按“3.2.1”项下的方法制备供试品溶液，再按“3.2.2”项下的色谱条件下连续进样6次，并记录各共有峰的保留时间和峰面积，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，说明仪器精密度良好。

4.2.2. 稳定性试验

取同一批次的茜草样品，按“3.2.1”项下的方法制备供试品溶液，按“3.2.2”项下的色谱条件下分别于0、2、4、8、12、24 h进样，并记录各共有峰的保留时间和峰面积，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD均小于3%，说明茜草样品在24 h都稳定。

4.2.3. 重复性试验

取同一批次茜草样品6份，按“3.2.1”项下的方法平行制备分析样品，按“3.2.2”项下的色谱条件分别进样，并记录各共有峰的保留时间和峰面积，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明该方法的重复性良好。

4.2.4. 指纹图谱的建立及共有峰的确定

Figure 2. HPLC fingerprint of 10 batches of Rubia cordifolia

图2. 10批茜草药材HPLC指纹图谱

Figure 3. HPLC control spectrum of Rubia cordifolia

图3. 茜草药材对照指纹图谱

通过采用HPLC指纹图谱后，提取茜草药材及其配方颗粒样品在280 nm处的色谱图，导入“中药指纹图谱相似度评价系统”2004A版后，进行色谱峰匹配，应用中位数法，时间窗宽度为0.3。生成10批茜草样品的HPLC指纹图谱及对照指纹图谱，共标定22个共有指纹色谱峰，见图2、图3；生成配方颗粒样品的HPLC指纹图谱及对照指纹图谱，标定出22个共有指纹色谱峰，见图4、图5；生成茜草及其配方颗粒的HPLC指纹图谱及对照指纹图谱，标定出16个共有指纹色谱峰，见图6、图7。

Figure 4. HPLC fingerprint of 10 batches of Rubia cordifolia formula granules

图4. 10批茜草配方颗粒HPLC指纹图谱

Figure 5. HPLC control spectrum of Rubia cordifolia formula granules

图5. 茜草配方颗粒对照指纹图谱

(S1-S10茜草药材；S11-S20茜草配方颗粒)

Figure 6. HPLC fingerprint of 20 batches of Rubia cordifolia and its formula granules

图6. 20批茜草药材及配方颗粒HPLC指纹图谱

Figure 7. HPLC control spectrum of 20 batches of Rubia cordifolia and its formula granules

图7. 茜草药材及配方颗粒HPLC指纹图谱

4.2.5. 相似度评价

采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》对样品之间进行相似度评价分析，10批茜草药材相似度为0.879~0.963、10批配方颗粒相似度为0.997~1.000，20批茜草药材及配方颗粒相似度为0.527~0.984，见表3、表4。

Table 3. Evaluation of similarity Rubia cordifolia and formula granules

表3. 茜草药材和配方颗粒相似度评价

Table 4. Evaluation of similarity between Rubia cordifolia and formula granules

表4. 茜草药材与配方颗粒的相似度评价

5. 讨论

5.1. 薄层色谱研究分析

TLC法成本低、速度快、样品处理少、直观性强，被广泛用于中药材、提取物、制剂等质量的定性鉴别。本研究建立20批不同产地茜草药材及其配方颗粒TLC鉴别方法，结果显示不同厂家的茜草药材的薄层色谱图所反映出的化学成分信息存在差异，而同一来源的茜草颗粒的色谱图在相对应的位置上具有相同颜色的斑点，说明不同批次的颗粒具有相似的化学成分。此外，两者在1、3、5、6、7号上有相同位置的斑点，但其斑点颜色不同，配方颗粒无2、4号斑点，说明茜草药材和配方颗粒的化学成分存在差异。

茜草药材化学成分之间的差异可能是由于药材来源不同，不同来源的药材因其采收、气候和土壤环境等条件的不同导致其化学成分种类和含量存在差异 [11] [12] 。而药材与配方颗粒之间的差异可能由饮片的质量以及饮片经水提、浓缩、干燥和制粒等制备工艺所导致的。利用薄层色谱法可直观观察药材及配方颗粒间的化学成分信息，但薄层色谱法不能全面反映茜草药材内部的化学信息，因此本研究还采用茜草及其配方颗粒的HPLC指纹图谱，以全面地反映其化学成分信息差异性。

5.2. HPLC指纹图谱研究分析

本研究以茜草药材和配方颗粒为研究对象，建立HPLC指纹图谱并结合2004A相似度软件对其色谱图进行分析。本研究对254~280 nm波长色谱峰的个数和强度进行考查，结果发现280 nm处可较为全面地反映药材及其配方颗粒的图谱信息。10批茜草药材指纹图谱共有峰22个共有色谱峰，相似度均大于0.879，可知药材之间质量存在差异，这可能由于药材来源不同其生长环境、采收加工、贮存条件和运输等因素的影响。10批配方颗粒指纹图谱共有22个共有色谱峰，相似度均大于0.997，表明茜草配方颗粒制备工艺比较稳定。20批茜草药材及其配方颗粒指纹图谱共有16个共有色谱峰，分析可知相似度低，药材与配方颗粒之间质量差异较大，可能是由原药材的生长环境、采收加工、配方颗粒的加工工艺等引起(比如：温度、煎煮、干燥、制粒、环境和人为因素)。该方法稳定、可靠、重现性好，可为茜草药材和配方颗粒质量分析、评价与控制提供依据。

终上所述，该实验建立的茜草药材及配方颗粒的TLC鉴别和HPLC指纹图谱方法稳定可靠，可为提升该药材整体质控方法奠定一定基础。但该研究所收集的茜草配方颗粒均为统一厂家，若能收集不同厂家的茜草配方颗粒，并在本实验基础上建立不同厂家茜草药材及其配方颗粒的TLC鉴别和HPLC指纹图谱，将更能用于评价茜草的质量。

基金项目

贵州省一流课程重点建设项目(项目合同编号：黔教高发[2017]158)。

文章引用

刘红云,刘 琴,王祥培,吴红梅. 茜草药材及其配方颗粒TLC及HPLC指纹图谱研究
Study on TLC and HPLC fingerprint of Rubia cordifolia and Its Formula Granules[J]. 中医学, 2023, 12(07): 1774-1782. https://doi.org/10.12677/TCM.2023.127265

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    13. NOTES

    *第一作者。

    #通讯作者。

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