Bioprocess 生物过程, 2011, 1, 22-25 http://dx.doi.org/10.12677/bp.2011.12006 Published Online December 2011 (http://www.hanspub.org/journal/bp/) Copyright © 2011 Hanspub Bp Study on Antioxidant Activity of Selenium Carboxymethyl-Chitosan# Liang Sun1, Xianling Qin1, Yan Yang2, Xiaojing Zhao1, Shengdi Fan1, Liming Jin1* 1College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 2College of Life Science, Jinan University, Guangzhou 3College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao Email: jlm@dlnu.edu.cn Received: Sep. 17th, 2011; revised: Oct. 14th, 2011; accepted: Nov. 8th, 2011. Abstract: The antioxidant activities in vitro of selenium carboxymethyl-chitosan were investigated by phe- nanthroline-Fe2+, pyrogallol autoxidation and T-AOC kit. The results showed that in the setting concentration range, the antioxidant activities increased with the elevation of concentration. The antioxidant activities of se- lenium carboxymethyl-chitosan were better than that of carboxymethyl-chitosan. The clearance rates of hy- droxyl free radical and superoxide anion free radical of 1mg/mL selenium carboxymethyl-chitosan were 42.68% and 31.16%, respectively, and the total antioxidant activity was 0.863 Unit/mL. The results provide references of low toxicity and effective organic selenium products. Keywords: Carboxymethyl-Chitosan; Selenium Carboxymethyl-Chitosan; Antioxidant Activity 硒化羧甲基壳聚糖的抗氧化作用研究# 孙 良1,覃仙玲 2,杨 艳3,赵小菁 1,范圣第 1,金黎明1* 1大连民族学院生命科学学院,大连 2暨南大学生命科学学院,广州 3中国海洋大学海洋生命学院,青岛 Email: jlm@dlnu.edu.cn 收稿日期:2011 年9月17 日;修回日期:2011 年10月14日;录用日期:2011 年11月8日 摘 要:采用邻二氮菲-Fe2+氧化法、邻苯三酚自氧化法以及总抗氧化能力试剂盒测定硒化羧甲基壳聚 糖的抗氧化能力。结果表明,在实验设置的浓度范围内,硒化羧甲基壳聚糖的抗氧化能力随着浓度的 增加而增加,且硒化羧甲基壳聚糖的抗氧化能力高于羧甲基壳聚糖。1 mg/mL的硒化羧甲基壳聚糖对 羟自由基的清除率为 42.68%,对超氧阴离子自由基的清除率为 31.16%,总抗氧化能力为 0.863 单位/mL。 为研究低毒性、有效的有机补硒产品提供了思路。 关键词:羧甲基壳聚糖;硒化羧甲基壳聚糖;抗氧化性 1. 引言 壳聚糖(chitosan)是甲壳素(chitin)的N-脱乙酰基 的产物,因其良好的生物相容性、无毒性和可降解性 被广泛应用于生物医药和保健等诸多领域。目前已有 研究证明,壳聚糖在化学水平、细胞水平和动物整体 水平上具有一定的抗氧化作用[1,2]。壳聚糖的缺点是 难溶于水,限制了其应用,而羧甲基壳聚糖是(carboxy- methyl-chitosan) 是壳聚糖经化学改性得到的水溶性衍 生物,其溶解性好、络合金属离子能力强,扩大了壳 聚糖的应用范围,可作为水处理的絮凝剂,化妆品保 湿剂,果蔬的保鲜剂,植物的生长促进剂,药物辅料 等[3]。近年来的研究证实,羧甲基壳聚糖也具有一定 的抗氧化作用[4,5]。 硒(selenium)是人体所必需的微量元素之一,由 于其本身具有极高的抗氧化能力,因此它在延缓衰 老、抗癌、增强人体免疫力等方面具有明显的功效, 甚至被人赞誉为“抗癌之王”。但是,大多数无机硒 化合物毒性比较大,最低致死量相对较小,因此应用 受到极大的限制[6]。所以,寻找生物活性相对较高且 毒性相对较低的有机硒替代品就成为给机体补硒的 #资助信息:国家自然科学基金(21172028);中央高校基本科研业务 费专项资金资助项目(DC110318,DC10040108)。 孙良 等硒化羧甲基壳聚糖的抗氧化作用研究 | 23 首要任务。目前已有研究表明,有机硒多糖作为补硒 剂不仅稳定性好,溶出性高,而且释放出硒后配体多 糖不会对机体产生毒副作用,是理想的补硒产品[7,8], 而对硒化壳聚糖的研究也引起了广泛的关注[9,10]。但 是,对硒化羧甲基壳聚糖(selenium carboxymethyl- chitosan)的研究较少。 本实验制备了硒化羧甲基壳聚糖,并采用邻二氮 菲-Fe2+氧化法、邻苯三酚自氧化法以及总抗氧化能力 试剂盒测定其抗氧化能力。 2. 材料与方法 2.1. 材料、试剂与仪器 羧甲基壳聚糖,实验室自制,羧基化度为 75.21%。 总抗氧化能力试剂盒,上海天呈科技有限公司。亚硒 酸钠、邻苯三酚、无水乙醇、过氧化氢、氢氧化钾、 氯乙酸、邻二氮菲、硫酸亚铁 、抗坏 血酸(VC)等均为 国产试剂,分析纯。 SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸 有限公司),Seven Easy 型PH 计(上海梅特勒–托利 多仪器有限公司),DHG-9053A 型电热恒温鼓风干燥 箱(上海精宏实验设备有限公司),UV-2100 型分光光 度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。 2.2. 硒化羧甲基壳聚糖的制备 参考徐春兰等[9]介绍的方法进行制备。准确称取 羧甲基壳聚糖 1.0 g,加入 49 mL的去离子水和 1 mL 1%的冰乙酸,搅拌溶解至澄清。将 1.33 g 亚硒酸钠溶 于10 mL 的去离子水中,缓慢加入到羧甲基壳聚糖溶 液中,混匀后放置 2 h,使其充分反应。加入 3倍体积 的无水乙醇,室温条件下过夜醇析,抽滤,再用无水 乙醇洗涤 2次,冷冻干燥即得硒化羧甲基壳聚糖样品。 2.3. 清除羟自由基的测定 采用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定硒化羧甲基壳聚糖 和羧甲基壳聚糖清除羟自由基的能力,并以 VC为对 照实验[11]。 1) 在试管中依次加入 0.2 mmol/L PBS 2 mL、去 离子水 1 mL,摇匀;加入 0.75 mmol/L FeSO4 1 mL, 充分混匀;加入 0.01% H2O2 1 mL,振荡 1 min;加入 0.75 mmol/L 邻二氮菲无水乙醇溶液 1 mL,37˚C水浴 60 min。用分光光度计于λ = 536 nm处检测反应体系 的吸光度值 Ap。 2) 以1 mL去离子水替代(1)中的 1 mL H2O2,其 余条件同(1),测其吸光度值 Ab。 3) 分别以不同浓度样品 1 mL替代(1)中的去离子 水,测其吸光度值 As1。 4) 分别以不同浓度 VC溶液 1 mL替代(1)中的去 离子水,测其吸光度值 As2。 5) 按以下公式计 算测试物及阳性对照物对·O H 的清除率(d): d100% sp bp AA AA 2.4. 清除超氧阴离子自由基的测定 采用邻苯三酚自氧化法测定硒化羧甲基壳聚糖和 羧甲基壳聚糖清除超氧阴离子的能力,并以 VC为对 照实验。 1) 取4.5 mL Tris-HCl加入 0.1 mL样品溶液,混 匀后在 25˚C下预热 20 min;然后加邻苯三酚 0.4 mL, 在25˚C下继续保持 4 min,加 0.5 mL浓盐酸终止反应。 在325 nm 波长处测吸光度为 Ai; 2) 用0.4 mL的去离子水代替(1)中的 0.4 mL邻苯 三酚,其余操作同上,测其吸光度为 Aj; 3) 空白管:用 0.1 mL 去离子水代替 0.1 mL 样品 溶液,吸光值为 Ao; 4) 计算各管对超氧阴离子的清除率(d): d1 100% ij o AA A 2.5. 总抗氧化能力的测定 分别取 0.100 g的硒化羧甲基壳聚糖和羧甲基壳 聚糖,加水定容到 100 mL,配制成 1 mg/mL的样品 溶液。按照总抗氧化能力试剂盒说明书进行操作,在 520 nm处测吸光值,并根据公式进行计算。 总抗氧化能力 ODu ODc 30 N n 0.01 (单位/mL) 式中,ODu:测定管吸光度值; ODc:对照管吸光度值; N:反应体系稀释倍数(反应总体积/取样量); n:样本测试前稀释倍数。 Copyright © 2011 Hanspub Bp 孙良 等硒化羧甲基壳聚糖的抗氧化作用研究 24 | 总抗氧化能力单位定义:在 37˚C时,每分钟每毫 升样本中使反应体系的吸光度(OD)值每增加 0.01 时, 为一个总抗氧化能力单位。 3. 结果与讨论 3.1. 硒化羧甲基壳聚糖对羟自由基的清除作用 由图 1、图 2可见,硒化羧甲基壳聚糖和羧甲基 壳聚糖都具有一定的抗氧化能力;且其抗氧化能力 都随着浓度的升高而增强;相同浓度的硒化羧甲基 壳聚糖抗氧化能力要高于羧甲基壳聚糖,且随浓度 升高,这种趋势愈明显。以浓度为 1 mg/mL的硒化 羧甲基壳聚糖和羧甲基壳聚糖为例,在此浓度下, 他们对羟自由基的清除率分别为42.68%和35.18%, 接近于浓度为 0.5 mg/mL 的VC对羟自由基的清除率。 Fenton 反应是体内产生羟自由基(OH)的重要机 理,OH 是造成组织脂质过氧化,蛋白质解聚,核酸 断裂,多糖解聚的重要活性氧,OH 清除率是反映抗 氧化剂的抗氧化作用的重要指标。因此,本实验结果 可作为硒化壳寡糖抗氧化作用的一个证据。 Figure 1. Curve: Clearance rates on OH· of selenium carboxy- methyl-chitosan and carboxymethyl-chitosan 图1. 硒化羧甲基壳聚糖和羧甲基壳聚糖对 OH·的清除率曲线 Figure 2. Curve: Clearance rates on OH· of VC 图2. Vc 对OH·的清除率曲线 3.2. 硒化羧甲基壳聚糖对超氧阴离子的清除作用 由图 3、图 4可见,硒化羧甲基壳聚糖相对于羧 甲基壳聚糖而言,对超氧阴离子自由基具有更好的 清除能力。以浓度为 1.0 mg/mL的硒化羧甲基壳聚 糖和羧甲基壳聚糖为例,其对超氧阴离子自由基的 的清除率分别为 31.16%和22.94%,接近于浓度为 0.5 mg/mL的VC对超氧阴离子自由基的清除率。本 方法测得的结果与邻二氮 菲-Fe2+法测定的结果基本 一致。 利用某些体系在氧化过程中有超氧阴离子自由基 (O–2·)的生成,O–2·与某些化合物的作用,产生具有特 定吸收的有色物质,利用分光光度计进行测定。受试 物若能清除 O–2·,则吸光度发生变化,可间接判断受 试物对 O–2·的清除作用。邻苯三酚在碱性条件下迅速 自氧化,自氧化过程中产生 O–2·,O–2·又加速邻苯三酚 自氧化速率,同时产生有色中间物质,有色中间产物 的积累在滞后 30 s~45 s与时间成良好的线性关系,一 般维持 4 min,随后减慢。有色中间产物在 325 nm有 强烈的光吸收。由于自氧化的速率依赖于 O–2·的浓度, Figure 3. Curve: Clearance rates on O–2· of selenium carboxy- methyl-chitosan and carboxymethyl-chitosan 图3. 硒化羧甲基壳聚糖和羧甲基壳聚糖对 O–2·的清除率曲线 Figure 4. Curve: Clearance rates on O–2· of VC 图4. VC对O–2·的清除率曲线 Copyright © 2011 Hanspub Bp 孙良 等 | 硒化羧甲基壳聚糖的抗氧化作用研究 Copyright © 2011 Hanspub Bp 25 消除 O–2·则抑制自氧化反应,阻止中间产物的积累, 从而评价受试物清除O–2·的能力[12]。 3.3. 硒化羧甲基壳聚糖的总抗氧化能力 通过计算可得,硒化羧甲基壳聚糖的总抗氧化能 力为 0.863 单位/mL,高于羧甲基壳聚糖的总抗氧化能 力0.493 单位/mL。 4. 结论 本实验以亚硒酸钠和羧甲基壳聚糖为原料,合成 了一种新型的有机硒产品——硒化羧甲基壳聚糖。通 过邻二氮菲-Fe2+氧化法、邻苯三酚自氧化法以及总抗 氧化能力试剂盒测定其抗氧化能力,结果表明,在实 验设置的浓度范围内,硒化羧甲基壳聚糖的抗氧化能 力随着浓度的增加而增加,由于分子中引入了硒这种 具有抗氧化能力的元素,其抗氧化能力要高于单一的 羧甲基壳聚糖,并且随浓度升高,这种趋势愈加明显。 本实验结果表明,合成的硒化羧甲基壳聚糖是一 种具有较好抗氧化能力的有机硒多糖,为进一步研究 低毒性、高活性的有机补硒剂提供了思路与参考。 5. 致谢 本实验由国家自然科学基金(21172028) ,中央高 校基本科研业务费专项资金资助项目(DC110318, DC10040108)资助。特此感谢。 参考文献 (References) [1] 金黎明, 杨艳, 刘万顺等. 壳寡糖及其衍生物对 CCl4诱导的 小鼠肝损伤的保护作 用[J]. 山东大学学报(理学版), 2007, 42(7): 1-4. [2] 金黎明, 郑奕, 杨艳等. 壳聚糖及其衍生物的抗氧化作用研 究[J]. 食品与发酵工业, 2008, 34(11): 66-68. [3] 王海青. 壳聚糖及其衍生物的开发及应用[J]. 日用化学工业, 2003, 12(5): 18-22. [4] 林友文, 林青, 郑景峰等. 壳聚糖、羧甲基壳聚糖的降脂及抗 氧化作用[J]. 中国海洋药物, 2003, 3: 16-19. [5] 丁诚实, 沈业寿, 彭世奇. 羧甲基壳聚糖抗衰老作用的研究 [J]. 实用老年医学, 2006, 20(3): 171-173. 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