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Hans Journal of Biomedicine
Vol.07 No.02(2017), Article ID:20393,6 pages
10.12677/HJBM.2017.72005

Analysis of Agglutination from Cerasus humilis Lectin on Micro Algae, Bacteria and Yeast

Hongyan Han1, Aiqing Ji1, Linjing Chen1, Junjie Du2*

1Jinzhong University, Jinzhong Shanxi

2Shanxi Agriculture University, Jinzhong Shanxi

Received: Apr. 8th, 2017; accepted: Apr. 27th, 2017; published: Apr. 30th, 2017

ABSTRACT

A lectin has been isolated from seed of the Cerasus humilis using a procedure that involved degreasing of petroleum ether, extraction of phosphate buffer, precipitation of 50% ammonium sulfate and dialysis with PBS. Then we researched on its agglutination activity toward micro algae, bacteria and yeast. The results showed that Cerasus humilis lectin could not agglutinate Chlorella pyrenoidosa of freshwater micro algae, but could agglutinate Microcystis aeruginosa and Scenedesmus obliquus; Cerasus humilis lectin had ability to agglutinate Escherichia coli, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. As the bacterial density increased, agglutination became more and more obvious; Cerasus humilis lectin could agglutinate yeast cells after heat treatment. In general, the higher the concentration of lectin is, the greater the effect of agglutination will be.

Keywords:Cerasus humilis Lectin, Agglutination, Micro Algae, Bacteria, Yeast

欧李凝集素对微藻、细菌和酵母凝集作用分析

韩红艳1，冀爱青1，陈林晶1，杜俊杰2*

1晋中学院，山西 晋中

2山西农业大学，山西 晋中

收稿日期：2017年4月8日；录用日期：2017年4月27日；发布日期：2017年4月30日

摘 要

本试验以欧李果仁为材料，经石油醚脱脂后，用磷酸盐缓冲液PBS (PH7.4)浸提，50%饱和硫酸铵沉淀，PBS透析，获得欧李凝集素粗提液，分别研究它对微藻、细菌和酵母的凝集作用。研究结果表明：欧李凝集素能够凝集铜绿微囊藻和斜生栅藻，对蛋白核小球藻无凝集作用；对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的凝集能力，并且随细菌密度的增加，凝集现象越明显；欧李凝集素能凝集热处理后的酵母菌细胞，凝集素浓度越高，凝集效果越显著。

关键词 :欧李凝集素，凝集作用，微藻，细菌，酵母

Copyright © 2017 by authors and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

凝集素是一类能凝集细胞和沉淀单糖或多糖复合物的非免疫来源的非酶蛋白质，包括微生物凝集素、植物凝集素和动物凝集素。凝集素具有独特的生化性质及生物学功能，使其在医学和生物学研究上有着广泛的用途，可以促有丝分裂、抗真菌、抗病毒、抗虫及抗肿瘤等多种活性 [1] - [7] 。大多数植物凝集素存在于贮藏器官中，它们既可以作为一种氮源，也可以在植物受到危害作为一种防御蛋白发挥功能 [8] 。凝集素在其它植物中研究较多，比如雪花莲凝集素基因、豌豆外源凝集素基因等，但到目前为止很少有关于欧李凝集素研究报道。欧李作为我国特有的一个古老野生果树种，以药源植物利用已有2000多年记载历史，因此，本文以“农大钙果4号”为材料，研究欧李凝集素对微藻、细菌和酵母的凝集作用，旨在为日后研究欧李凝集素在医学方面的应用提供理论参考。

2. 材料和方法

2.1. 试验材料

选取山西农业大学培育的“农大钙果4号”为试验材料。蛋白核小球藻，铜绿微囊藻，斜生栅藻购自光大藻种店铺；大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌和酵母来自于晋中学院生物科学与技术学院。

2.2. 试验器材

器材：96孔圆底细胞培养板、生化培养箱SPX-150BSH-II (上海新苗医疗器械制造有限公司)、电热恒温培养箱DNP-9082BS-III (上海新苗医疗器械制造有限公司)、EU-2600R紫外可见分光光度计(上海昂拉仪器有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱OHG-907835-Ⅲ (上海新苗医疗器械制造有限公司)。

2.3. 试验药品

唾液酸(Sigma)、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、蔗糖、麦芽糖、石油醚、硫酸铵(均为分析纯)。

2.4. 试验方法

2.4.1. 欧李凝集素粗提取液的制备

取欧李仁5 g，去皮后用研钵磨成粉末。脱脂：用石油醚(1:4, v:v)于4℃浸泡脱脂2次后取出，弃去上层石油醚后待其自然风干。浸提：用pH 7.4的PBS缓冲液按照1:7 (g/mL)的比例在4℃下浸提。盐析：提取液经离心(4℃, 12.000 g, 30 min)后，弃去沉淀，取得上清液后采用50%饱和硫酸铵盐折，4℃下过夜处理后经离心(4℃, 12.000g, 30 min)后弃去上清，取得沉淀。透析：将沉淀溶于pH 7.4的PBS缓冲液中一起装入事先经处理好的透析袋中，然后将透析袋泡入pH 7.4的PBS缓冲液中，透析48 h，其中用0.1 mol/L的氯化钡检测PBS缓冲液是否有白色沉淀，透析完成后将袋内物质取出，经离心(4℃, 12.000 g，10 min)后取得的上清液即为欧李凝集素粗提取液。

2.4.2. 糖结合专一性测定

试验用浓度为0.1 mol/L的D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、蔗糖(Sucrose)、唾液酸、麦芽糖进行倍比稀释。再向凝血板各孔加入25 μL制备好的2%的B型血细胞悬液，待全部加完后震荡1 min，将凝血板室温静置1 h，观察凝集反应情况，记录现象。

2.4.3. 欧李凝集素对微藻的凝集试验

参照文献 [9] 的处理方法将三种藻种用SE培养基培养，取指数生长期的微藻培养物10 mL，经离心(4800 r/min, 10 min)收集微藻细胞，加生理盐水，离心(4800 r/min, 10 min)洗涤2次，最后用生理盐水制成藻细胞悬液并在680 nm下测定其吸光度。取25 ul凝集素样品于96孔圆底细胞培养板中用PBS缓冲液进行倍比稀释，然后各加入25 ul藻类细胞悬液混匀，室温放置l h后显微镜观察效果。

2.4.4. 欧李凝集素对细菌的凝集试验

将待测细菌用牛肉膏蛋白胨培养基经继代培养活化，并计算菌液浓度。之后用生理盐水配置成原来体积的细菌悬液。将三种细菌细菌悬液分别进行倍比稀释，参照文献 [10] 每种菌在6个浓度下分别以25 ul滴入96孔圆底细胞培养板，然后在每一孔中都加入4%的人血细胞悬液，在37℃下培养，30 min后向每孔中再加提取的欧李凝集素25 uL，在37℃下继续培养，30 min后观察凝集情况并记录。

2.4.5. 欧李凝集素对酵母的凝集试验

取市售鲜酵母，用生理盐水配制成约1%~2%，洗涤3次，置沸水浴中30 min，过滤，除去酵母凝块。取分散酵母菌，用生理盐水洗涤2次，离心(2500 r/min, 15 min)，去上清液，用生理盐水配成1%酵母菌悬液(相当于1 × 108菌/ml浓度)，然后对凝集素进行倍比稀释，加入到血凝板中，低倍镜下观察酵母菌的凝集程度。凝集状况判定标准如表1。

3. 结果与分析

3.1. 凝集素糖结合专一性分析

用6种糖对欧李凝集素进行抑制试验，将结果与血凝试验中凝集效价为20时对B型血的凝集结果进行比较，可以得出，6种糖对欧李凝集素的抑制作用也具有专一性，如表2所示，D-半乳糖、D-甘露糖和唾液酸对欧李凝集素有抑制作用，其糖抑制的所需的最低浓度分别为22.12 mg/mL、0.519 mg/mL、1.126 mg/mL，而D-果糖、麦芽糖和蔗糖对欧李凝集素无抑制作用。

3.2. 欧李凝集素对微藻细胞的凝集作用分析

从表3可以看出，在测定的3种微藻中，欧李凝集素仅对淡水微藻蛋白核小球藻无凝集作用；对铜

Table 1. Criteria for determining the results of microscopic examination of yeast

表1. 酵母菌镜检结果判定标准

Table 2. Results of determination of carbohydrate specificity

表2. 糖专一性测定结果

注释：NI表示无抑制作用。

Table 3. Effect of lectin agglutination of Cerasus humilis microalgae

表3. 欧李凝集素对微藻的凝集作用

-不凝集

绿微囊藻在凝集素倍比稀释中的最大浓度(0.032 ug/ml)产生了凝集作用，其它浓度无凝集作用；凝集素浓度稀释至0.016 ug/ml时仍然能对斜生栅藻产生凝集作用。

3.3. 欧李凝集素对细菌的凝集作用分析

三种菌液的所测得的浓度如表4所示。

测出三种菌种在420 nm下的OD值，如下表5、表6和表7可以看出，其OD值随着浓度的降低而降低。菌种浓度从高至低依次编号为1至6号。

三种菌对血细胞均有破坏作用，使血细胞发生凝集。大肠杆菌的OD值越大其凝集血细胞的能力越强，随着OD值得降低凝集能力减弱，当OD值为0.002时几乎无凝集能力，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌对血细胞的凝集作用与之相似。但是，在菌液和红细胞发生凝集反应30 min后加入高浓度的欧李凝集素粗提液，能有效的解除菌液对血细胞的凝集作用，抑制细菌的毒害作用。

3.4. 欧李凝集素对酵母的凝集作用分析

从表8可以看出，欧李凝集素能凝集酵母菌细胞，且随凝集素浓度的变化，凝集效果也随之变化。

Table 4. Concentrations of the three kinds of bacteria

表4. 三种菌液的所测得的浓度

Table 5. The concentration and the OD value of Escherichia coli

表5. 大肠杆菌的浓度与OD值

Table 6. The concentration and the OD value of Staphylococcus aureus

表6. 金黄色葡萄球菌的浓度与OD值

Table 7. The concentration and the OD value of Bacillus subtilis

表7. 枯草芽孢杆菌的浓度与OD值

Table 8. The record of Cerasus humilis lectin agglutination yeast

表8. 欧李凝集素对酵母的凝集情况记录

大体上来讲，凝集素的浓度越高，凝集效果越明显。

在低倍镜下观察到的欧李凝集素对酵母凝集作用的。凝集素的浓度从0.032 ug/ml~0.0005 ug/ml依次梯度递减，对酵母的凝集作用也依次降低，当浓度降低到0.00025 ug/ml时，酵母细胞不表现凝集。结合表8可知浓度为0.00025 ug/ml酵母菌散在周围；浓度为0.002 ug/ml、0.001 ug/ml、0.0005 ug/ml时，+5%以下酵母菌几个细胞凝集；浓度为0.008 ug/ml、0.004 ug/ml时，++5%~20%酵母菌凝集成小块；浓度为0.032 ug/ml、0.016 ug/ml时，+++20%~50%酵母菌凝集成絮状凝块。

4. 讨论

欧李凝集素可专一性的结合3种糖，分别为D-半乳糖、D-甘露糖和唾液酸，说明欧李凝集素具有糖结合专一性。

Bird等人最早利用藻类(海藻)凝集素粗品研究对细菌的凝集作用 [11] ，但结果表明对细菌只有微弱的凝集活性。凝集素对藻类细胞的凝集研究最先开展的是Hori等的实验，研究了多种不同类型的凝集素对海洋微藻的凝集作用 [12] ，结果发现16种海洋微藻中有4种发生了凝集反应。凝集素对真菌的凝集作用来看，曾日中和黎瑜发现壳三糖的加入可以提高热失活橡胶蛋白的抗真菌活性 [13] ，表明了橡胶蛋白对真菌生长的抑制作用与其几丁质的结合特性有关。通过检测不同浓度下的欧李凝集素对三种微藻细胞的凝集效果，可以看出欧李凝集素对蛋白核小球藻无明显的凝集作用，而郑怡等 [9] 研究得出坛紫菜凝集素(PHL)对蛋白核小球藻有凝集活性，这种差异是由于不同的凝集素其糖链结构不同所引起的。欧李凝集素对于铜绿微囊藻和斜生栅藻来讲，凝集效果较为明显，并且在高浓度下效果显著。同时本实验中欧李凝集素对酵母菌有凝集作用，且凝集作用随着凝集素浓度的升高而加剧，对酵母菌的凝集现象越来越明显。总之，凝集素引起的藻类、细菌和酵母的凝集是一个比较复杂的过程，受多种因素的影响，与凝集素的性质，细胞的种类、细胞的表面特征和细胞在外界环境影响下其状态的改变等有关，今后我们将进一步的深入研究。

基金项目

晋中市软科学计划项目(项目编号：R1601)。

文章引用

韩红艳,冀爱青,陈林晶,杜俊杰. 欧李凝集素对微藻、细菌和酵母凝集作用分析
Analysis of Agglutination from Cerasus humilis Lectin on Micro Algae, Bacteria and Yeast[J]. 生物医学, 2017, 07(02): 25-30. http://dx.doi.org/10.12677/HJBM.2017.72005

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