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Bioprocess
 Vol.4 No.03(2014), Article ID:14094,8 pages
DOI:10.12677/BP.2014.43007

Amplification of PRDM16, BMP7, PPARα, COX II and PGC-1α Genes Tupaia belangeri

Di Zhang, Hao Zhang, Wanlong Zhu*

School of Life Science, Yunnan Normal University, Kunming

Email: *zwl_8307@163.com

Copyright © 2014 by authors and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Received: Aug. 12th, 2014; revised: Aug. 29th, 2014; accepted: Sep. 10th, 2014

ABSTRACT

In the present study, partial cDNA sequence of PRDM16, BMP7, PPARα, COX II and PGC-1α genes in Tupaia belangeri were amplificated and analyzed. The obtained partial sequences of PRDM16, BMP7, PPARα, COX II and PGC-1α in T. belangeri were 184 bp, 84 bp, 358 bp, 212 bp and 271 bp, respectively. The coding protein of these sequences included 61 amino acids in PRDM16; 27 amino acids in BMP7; 119 amino acids in PPARα, 70 amino acids in COX II and 87 amino acids in PGC-1α. Comparison of the amino acids of PRDM16, BMP7, PPARα, COX II and PGC-1α with the amino acids in many mammals found that the homology of amino acids was higher. The PRDM16, BMP7, PPARα, COX II and PGC-1α genes were used to reconstruct phylogenetic trees which showed that T. belangeri had the closest relationship relative to primates.

Keywords:Tupaia belangeri, Adipose Tissue, Amplification

中缅树鼩PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α基因的扩增研究

章  迪，张  浩，朱万龙*

云南师范大学生命科学学院，昆明

Email: *zwl_8307@163.com

收稿日期：2014年8月12日；修回日期：2014年8月29日；录用日期：2014年9月10日

摘  要

本研究对中缅树鼩PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α基因的部分序列进行扩增和分析，获得中缅树鼩PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α片段分别为184 bp、84 bp、358 bp、212 bp、271 bp，推测其分别编码61、27、119、70、87个氨基酸。将PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α基因编码氨基酸序列分别与多种哺乳动物对应的氨基酸序列进行同源性比较分析发现氨基酸的同源性较高。以获得的PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α基因序列分别构建系统进化树，结果显示中缅树鼩与灵长类动物的亲缘关系较近。

关键词

中缅树鼩，脂肪组织，扩增

1. 引言

栖息于季节性变化的环境中小型哺乳动物应对冬季的冷胁迫，脂肪组织在其能量稳态调节过程中发挥着重要的作用[1] 。哺乳动物的脂肪组织主要包含两种类型的脂肪细胞：白色脂肪细胞和褐色脂肪细胞，两者形态、生物学功能截然不同。白色脂肪细胞，主要是以三酰甘油为主的化学能的储库，当机体需要能量时输出化学能，从而满足机体对能量的需要，而褐色脂肪细胞，是解偶联呼吸的主要部位，化学能以热能的形式散失。褐色脂肪组织是非颤抖性产热的主要部位，对于小型哺乳动物抵抗低温环境具有重要作用[2] [3] 。

白色脂肪组织(white adipose tissue, WAT)广泛分布在皮下组织及内脏周围；而褐色脂肪组织(Brown adipose tissue, BAT)则主要分布于肩胛、颈部、腋窝、纵隔及肾脏周围；在某些部位褐色脂肪组织和白色脂肪组织是混合存在的[4] 。过去认为人体仅仅在新生儿阶段具有BAT，成体退化消失，但是，2009年采用PT-CT在成年人体内也发现了具有功能的BAT组织和细胞，并且该结果被美国《时代周刊》评为“2009年世界医学十大重大发现之一”，并且认为BAT是治疗人类肥胖症和II型糖尿病极为重要的靶器官[5] -[7] 。白色脂肪细胞和褐色脂肪细胞拥有一个共同的前体细胞间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)，通过不同的调控机制转化而来。白色脂肪细胞由成脂肪细胞分化而来，而褐色脂肪细胞则与骨骼肌细胞有共同的分化来源Myf5+成肌细胞[2] 。PRDM16、BMP7、COXII、PPARα、PGC-1α是褐色脂肪细胞分化与代谢中的关键调控因子。

PRDM16 (PRdomain-containing 16)锌指蛋白在BAT中特异性表达，可触发BAT细胞中PGC-1α (Peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1)和解偶联蛋白1(Uncoupling protein 1, UCP1)基因等的表达[8] ，是促进褐色脂肪细胞形成的关键调控因子。BMP7 (Bone morphogenetic proteins 7)也可激活PRDM16和PGC-1α等基因的表达，刺激BAT细胞分化及产热增强[9] 。COX II(cyclooxygenase-2)、PPARα(peroxisome proliferator-activated receptor α)、PGC-1α是褐色脂肪细胞分化与代谢中的关键调控因子。在WAT中COX II是肾上腺素信号通路的一个效应分子[10] ，对于WAT中诱导形成褐色脂肪细胞是必需的。PPARα在BAT中的表达水平高于WAT，能诱导BAT中的产热相关基因的表达及原代褐色脂肪细胞的生成[11] 。PGC-1α也能诱导WAT中褐色脂肪细胞的形成，在褐色脂肪细胞分化的过程中PGC-1α表达量上升[12] 。目前对褐色脂肪细胞的研究已成为生物学领域研究的一个热点问题，本实验以中缅树鼩为研究对象，分别对PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α基因进行扩增，为了解这些基因的组成、结构和生物学功能奠定一定的基础。

2. 研究方法

2.1. 实验动物

中缅树鼩(Tupaia belangeri)属攀鼩目(Scandentia)树鼩科(Tupaiidae)，是东南亚树鼩中分布最北的一个种，为东洋界特有的小型哺乳动物[13] -[16] 。中缅树鼩捕自昆明禄劝县灌丛(北纬25˚26'~26˚22'；东经102˚13'~102˚575')，海拔1679 m。

2.2. 实验动物处理

捕获的实验动物带回云南师范大学生科院实验动物房(昆明)，室温条件下单只饲养于饲养笼(300 mm × 120 mm × 200 mm)，光照12L:12D，中缅树鼩饲料的配制根据邹如金等[17] 的报导，并每隔1日加喂少许的水果。所有实验动物均为成年的非繁殖期个体。

2.3. 方法

2.3.1. RNA提取及纯度鉴定

实验动物断颈处死，于腹部大网膜提取皮下脂肪组织，脂肪组织总RNA的提取与纯化按照RNApure高纯总RNA快速抽提试剂盒(BioTeke Co.)提供方法进行。琼脂糖凝胶电泳进行RNA纯度和完整性检验。提取的总RNA于−80℃保存。

2.3.2. cDNA第一链合成

cDNA第一链的合成以皮下脂肪组织总RNA为模板，按照FastQuant RT Kit(With gDNase)试剂盒提供方法进行。

按表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3 min。然后置于冰上放置。

按照表2的反转录反应体系配制混合液。

将反转录反应中的mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃，孵育15 min，95℃，孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA低温保存。

2.3.3. PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α基因cDNA序列的扩增

根据已知脊椎动物PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α基因氨基酸保守序列设计引物，所涉引物见表3。以上述cDNA第一链为模板进行RT-PCR，RT-PCR产物送至昆明硕阳科技有限公司进行正反向测序。

2.3.4. 数据处理

对于获取的PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α基因cDNA序列，用美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST软件进行同源性比对，同时用该生物技术信息中心的ORF软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)对序列进行在线分析，推导编码蛋白的氨基酸序列。用ClustalX1.81软件进行PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α基因cDNA序列的对位排列，再经过MEGA5软件以NJ法运算1000次分别构建以上基因的系统进化树。

Table 1. The reaction system with gNase

表1. gDNA去除反应体系

Table 2. The reaction system of reverse transcription

表2. 反转录反应体系

Table 3. Primers used for amplifying PRDM16, BMP7, PPARα, COX II, PGC-1α genes of T. belangeri

表3. 扩增中缅树鼩PRDM16、BMP7、PPARα、COX II、PGC-1α所用引物

3. 结果

3.1. 脂肪组织总RNA提取

中缅树鼩皮下脂肪组织总RNA提取根据Bioteke公司的Total RNA Isolation Kit试剂盒说明书进行，提取的总RNA以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测显示250~2000 bp位置有连续弥散状，可作为模板用于后续试验(图1)。将脂肪组织RNA模板以FastQuant RT Kit(With gDNase)试剂盒推荐方法建立cDNA文库。

3.2. 中缅树鼩PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α序列比对及分子进化分析

扩增PRDM16、BMP7、PPARα、COX II及PGC-1α基因分别获得184 bp、84 bp、358 bp、212 bp、271 bp的cDNA片段，推测其编码的氨基酸序列分别为61、27、119、70、87个氨基酸。通过BLAST

Figure 1. Electrophoretogram of adipose tissue total RNA in T. belangeri; M: BM 2000 DNA marker; L: adipose tissue total RNA

图1. 中缅树鼩脂肪组织总RNA电泳图；M：BM2000分子量标准；L：脂肪组织总RNA

搜索，所得中缅树鼩PRDM16基因编码的氨基酸序列与绵羊(Ovis aries XP_004014087.1)、智人(Homo sapiens, EAW71451.1)、家牛(Bos taurus, XP_003583293.2)、裸鼢鼠(Heterocephalus glaber, XP_004863 837.1)、小家鼠(Mus musculus, NP_001171466.1)、食蟹猴(Macaca fascicularis, XP_005545046.1)、褐家鼠(Rattus norvegicus, XP_002726668.2)、大猩猩(Gorilla gorilla gorilla, XP_004024575.1)、原鸡(Gallus gallus, XP_417551.3)、家犬(Canis lupus familiaris, XP_005620489.1) PRDM16氨基酸同源性很高，均为95%以上。

中缅树鼩BMP7基因与家兔(Oryctolagus cuniculus, AAL24500.1)、食蟹猴(Macaca fascicularis, EHH65220.1)、智人(Homo sapiens, NP_001710.1)、灰仓鼠(Cricetulus griseus, XP_003501484.1)、苏门答腊猩猩(Pongo abelii, XP_002830501.1)、家犬(Canis lupus familiaris, NP_001183981.1)、褐家鼠(Rattus norvegicus, AAD27804.1)、小家鼠(Mus musculus, NP_031583.2)、大熊猫(Ailuropoda melanoleuca, XP_002915590.1)、绵羊(Ovis aries，XP_004014818.1)BMP7氨基酸序列同源性均为97%以上。

所得中缅树鼩PPARαcDNA序列与灰鼠猴(Saimiri boliviensis boliviensis, XP_003932800.1)、九带犰狳(Dasypus novemcinctus, XP_004478041.1)、智人(Homo sapiens, XP_006724334.1)、东非狒狒(Papio Anubis, XP_003905752.1)、猕猴(Macaca mulatta, NP_001028201.1)、野猪(Sus scrofa, AAF73404.1)、家马(Equus caballus, NP_001229482.1)、家猫(Felis catus, XP_003989443.1)、裸鼢鼠(Heterocephalus glaber, XP_004900845.1)、白颊长臂猿(Nomascus leucogenys, XP_003278613.1) PPARα氨基酸序列比较，发现中缅树鼩PPARα与多种哺乳PPARα氨基酸序列在90%以上。

中缅树鼩COXⅡ基因与家马(Equus caballus, BAA94762.1)、智人(Homo sapiens, AAA58433.1)、褐家鼠(Rattus norvegicus, AAA40947.1)、山羊(Capra hircus, AEX88630.1)、灰仓鼠(Cricetulus griseus, ERE72779.1)、苏门答腊猩猩(Pongo abelii, XP_002809734.1) COXⅡ氨基酸同源性为93%以上。

所得中缅树鼩PGC-1α基因编码的氨基酸序列与苏门答腊猩猩(Pongo abelii, NP_001125407.1)、猕猴(Macaca mulatta, XP_001105289.1)、东非狒狒(Papio anubis, XP_003898591.1)、食蟹猴(Macaca fascicularis, XP_005554648.1)、智人(Homo sapiens, XP_005248191.1)、白颊长臂猿(Nomascus leucogenys, XP_0032 58587.1) PGC-1α氨基酸序列的同源性较高，均在97%以上。

将扩增所得PRDM16序列与智人(Homo sapiens, AF294278.1)、苏门答腊猩猩(Pongo abelii, XM_002811586.2)、东非狒狒(Papio Anubis, XM_003891017.1)、家马(Equus caballus, XM_001492978.3)、绵羊(Ovis aries, XM_004014038.1)、家牛(Bos Taurus, XM_002694178.2)、草原田鼠(Microtus ochrogaster, XM_005368644.1)、小家鼠(Mus musculus, BC059838.1)、灰仓鼠(Cricetulus griseus, XM_003515575.1)、罗非鱼(Oreochromis niloticus, XM_005478277.1)、斑马鱼(Danio rerio, XM_005167308.1)、褐背拟地鸦(Pseudopodoces humilis, XM_005528354.1)、原鸽(Columba livia, XM_005514328.1) PRDM16序列构建系统进化树，由图2可以看出中缅树鼩与智人、苏门答腊猩猩、东非狒狒处于同一分支，说明中缅树鼩与灵长类亲缘关系更为接近。

扩增得到的BMP7基因序列与智人(Homo sapiens, NM_001719.2)、苏门答腊猩猩(Pongo abelii, XM_002830455.1)、白颊长臂猿(Nomascus leucogenys, XM_003253450.2)、家犬(Canis lupus familiaris, D17697.1)、家马(Equus caballus, HM582229.1)、灰仓鼠(Cricetulus griseus, XM_003501436.1)、天竺鼠(Cavia porcellus, XM_003463644.2)、原鸽(Columba livia, HQ840930.1)、原鸡(Gallus gallus, AF205877.1)、非洲爪蟾(Xenopus laevis, NM_001087397.1)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis, NM_203866.1)BMP7序列构建系统进化树，由图3可知，中缅树鼩与灵长类动物聚在一起，表明中缅树鼩可能与人类具有较近的亲缘关系。

扩增得到的PPARα序列与智人(Homo sapiens, NM_001001928.2)、家牛(Bos taurus, NM_001034036.1)、小家鼠(Mus musculus, NM_001113418.1)、褐家鼠(Rattus norvegicus, NM_013196.1)、猕猴(Macaca mulatta, NM_001033029.1)、家犬(Canis familiaris, AF350327.1) PPARα序列构建系统进化树，中缅树鼩先与灵长类动物聚为一分支，再与其它哺乳动物聚为一支(图4)。

扩增得到的COX II序列与智人(Homo sapiens, M90100.1)、天竺鼠(Cavia porcellus, Y07896.1)、褐家鼠(Rattus norvegicus, AF233596.1)、家猫(Felis catus, 121955990)、小家鼠(Mus musculus, NM_011198.3)、山羊(Capra hircus, JN793538.1)COX II序列构建进化树，结果显示，树鼩与智人亲缘关系较近(图5)。

将中缅树鼩、智人(Homo sapiens, HQ695733.1)、白颊长臂猿(Nomascus leucogenys, XM_003258539.2)、

Figure 2. Phylogenetic tree of PRDM16 gene

图2. PRDM16系统进化树

Figure 3. Phylogenetic tree of BMP7 gene

图3. BMP7系统进化树

苏门答腊猩猩(Pongo abelii, NM_001131935.1)、鼠兔(Ochotona princeps, XM_004579176.1)、家马(Equus caballus, XM_001499929.3)、灰仓鼠(Cricetulus griseus, XM_003507779.1)、家猫(Felis catus, XM_00398 5488.1)、小家鼠(Mus musculus, XM_006503774.1)、褐家鼠(Rattus norvegicus, XM_006251040.1) PGC-1α序列构建系统进化树，由图6可见，中缅树鼩先与智人、苏门答腊猩猩、白颊长臂猿聚为一分支，说明树鼩与灵长类动物亲缘关系更为接近。

4. 讨论

PRDM16、BMP7、COX II、PPARα、PGC-1α是褐色脂肪细胞分化与代谢中的关键调控因子。由于它们的作用机理相对简单且分布广泛，在进化过程中面临的选择压力较小，编码的基因较为保守，故通过PRDM16、BMP7、COX II、PPARα、PGC-1α构建系统进化树能较为准确的反映物种间的亲缘关系的远近。

中缅树鼩具有真兽亚纲古生及现生动物的某些特征，它的系统发育地位一直以来颇受争议。以PRDM16、BMP7、COX II、PPARα、PGC-1α构建系统进化树的结果显示，中缅树鼩先与灵长类聚为一分支，再与啮齿类等其余哺乳动物聚为一支。这与中缅树鼩UCP1[18] 基因和UCP2[19] 基因构建的系统树的研究结果一致。但也与某些学者的研究结果有差异。Adkins等[20] 通过比较同形态学数据，认为树鼩与灵长类的关系没有比与皮翼目更近。Pupko[21] 和Bock[22] 等的研究结果则表明树鼩与兔形目、啮齿目的亲缘关系比灵长类更为接近。这种差异的原因可能是由于基因组的起源相当复杂，每个基因都有自己的独特进化方式[23] 。PRDM16和BMP7在褐色脂肪细胞分化过程中具有重要作用[24] 。目前关于脂肪

Figure 4. Phylogenetic tree of PPARα gene

图4. PPARα系统进化树

Figure 5. Phylogenetic tree of COX II gene

图5. COX II系统进化树

Figure 6. Phylogenetic tree of PGC-1α gene

图6. PGC-1α系统进化树

组织已有的研究资料大多来自于啮齿类动物，对PRDM16和BMP7蛋白等褐色脂肪细胞分化过程中转录及辅助因子的生理作用及分子机制的认识，为了解小型哺乳动物生存适应对策提供了一定的基础资料。

总之，基于PRDM16、BMP7、COX II、PPARα、PGC-1α基因核苷酸序列构建的系统进化树显示树鼩与灵长类动物的亲缘关系较近，为树鼩可作为生物医学研究的实验动物提供了一定的依据。且本研究所扩增的序列可以作为一种借鉴，为PRDM16、BMP7、COX II、PPARα、PGC-1α基因5’端和3’端调控区序列的克隆提供了条件，同时也为中缅树鼩的脂肪转化研究提供一定的条件。

基金项目

本研究受到国家国际科技合作项目(No. 2014DFR31040)；十二五国家支撑计划(No. 2014BAI01B00)；国家自然科学基金资助项目(No. 31360096)；云南省应用基础研究重点项目(No. 2013FA014)的资助。

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NOTES

*通讯作者。

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