Botanical Research
Vol.3 No.03(2014), Article ID:13542,6 pages DOI:10.12677/BR.2014.33013

人参皂苷生物合成途径及关键酶的研究进展

Jia Liu, Zhonghua Tang*

Key Laboratory of Forest Plant Ecology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin

Email: *tangzh@nefu.edu.cn

Copyright © 2014 by authors and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Received: Feb. 28th, 2014; revised: Mar. 29th, 2014; accepted: Apr. 11th, 2014

ABSTRACT

Ginsenosides are the major bioactive ingredients of rare traditional Chinese herbs of Panax ginseng and belong to specific types of triterpene saponins. There is much evidence that ginsenosides exert beneficial effects in a wide range of pathological conditions such as cardiovascular diseases, cancer, immune deficiency, and aging. It was reported that about 20 key enzymes and the encoding genes related to the biosynthesis of ginsenosides from Panax genus plants have been identified. This paper summarizes new progress in ginseng secondary metabolic pathways and genes of the key enzyme, focusing on the biosynthesis pathway of ginsenosides. In addition, the newly cloned and functionally identified genes encoding those key enzymes in the ginsenosides biosynthesis pathway are introduced in detail.

Keywords:Ginsenosides, Biosynthesis, Panax Ginseng, Key Enzymes

人参皂苷生物合成途径及关键酶的研究进展

刘  佳,唐中华*

东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室,哈尔滨

Email: *tangzh@nefu.edu.cn

收稿日期:2014年2月28日;修回日期:2014年3月29日;录用日期:2014年4月11日

摘  要

人参皂苷是名贵药材人参中的主要有效成分,属于三萜类皂苷化合物,由于其具有改善记忆力、延缓衰老、抗氧化、抗炎作用以及抗肿瘤作用,近年来得到了广泛关注。在人参皂苷生物合成途径解析及其反应机制研究方面,目前已从人参属植物中克隆到20多个与人参皂苷生物合成相关的关键酶基因。本文综述了近年来国内外学者对人参次生代谢途径及关键酶基因研究的新进展,重点阐述了人参皂苷的生物合成途径,针对途径中新发现的关键酶及编码基因进行了详细的介绍。

关键词

人参皂苷,生物合成,人参,关键酶

1. 引言

人参(Panax gensing C.A. Meyer),属五加科人参属植物,是名贵的中草药材之一,被公认为药中之王[1] 。主要分布于中国东北部,韩国、美国和日本[2] 。由于人参的主要生物活性具有降血糖、调节免疫系统、提高免疫力、延缓说衰老、抗癌、抗炎以及抗氧化的作用,因此在中国主要作为一种养生药材供给人们食用,甚至有的作为化妆品添加材料,而在美国、韩国和日本除了作为药材,还作为一种营养食品和饮品供人们食用[2] -[4] 。人参会有如此广泛的生理和药理活性主要是由于它的次生代谢产物人参皂苷。到目前为止,已经有60余种的人参单体皂苷被分离出来并最终确定其结构。人参皂苷属于三萜类物质,是由糖和苷元相连而成的糖苷类化合物。由于苷元不同,人参皂苷可有3类组成:1) 皂苷元由齐墩果酸构成的齐墩果烷型皂苷Ro;2) 人参二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3和Rh2等;3) 人参三醇型皂苷Re、Rg1、Rf和Rh1等。人参二醇型皂苷与人参三醇型皂苷都属于达玛烷型皂苷[5] [6] 。而每种单体皂苷的药性活性是不同,如Rb1具有增强胆碱系统的功能,改善记忆力作用等[7] 。Rc是一种人参中的固醇类分子,具有抑制癌细胞的功能等[8] 。Rd对心脑血管、神经系统以及肾功能具有良好的药理作用[9] 。Rg3可调节疲劳、舒张血管、提高免疫力以及抗肿瘤等[10] 。Rg1可快速缓解疲劳、延缓衰老、改善学习记忆等[11] 。尽管人参皂苷具有如此多的药物活性,但其在人参中的的含量较低,有些皂苷的含量甚至微乎其微的[12] 。为了满足日益增长的医药及研发要求,近年来国内外学者应用基因工程和分子生物学方法,重组药用次生代谢物生物合成途径的研究已有初步的研究和实践[13] 。深入计时人参皂苷生物合成途径,对提高人参皂苷生产效率,是一个非常具有吸引力的策略。本文就针对人参皂苷生物合成研究进展进行了综述,并通过前人的研究与发现展望了人参皂苷生物合成的发展前景及意义。

2. 人参皂苷的生物合成途径

人参皂苷生物合成途径的上游是IPP(异戊烯焦磷酸)和DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸)的合成,其合成过程是有两分子乙酰辅酶A在其转移酶乙酰辅酶A酰基转移酶(AACT)的催化下通过缩合生成了乙酰辅酶A,随后在(HMG-CoA)合成酶催化下继续与乙酰辅酶A缩合形成了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA),此反应是需要Fe2+和质体醌共同协助下才可完成[14] 。MVA途径中的第一个关键步骤就是在NADPH的协同下,通过HMGR催化HMG-CoA生成了具有6碳中间体甲羟戊酸(MVA)。随之而来的是在ATP存在下,MVA被甲羟戊酸激酶(MVK)和磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)依次催化生成磷酸甲羟戊酸(MVAP)和焦磷酸甲羟戊酸(MVAPP)。而异戊烯焦磷酸(IPP)的形成则是由焦磷酸甲羟戊酸(MVAPP)通过脱羧酶(MVD)催化MVAPP使其脱羧而形成的。随后在IPP通过异戊烯焦磷酸异构酶(IDI)的催化下,将C-2的质子转移到C-4形成具有活性异构体的二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)[15] 。总而言之,人参皂苷生物合成途径的上游是通过糖酵解所得的乙酰辅酶A作为最初原供体,经过甲羟戊酸中间物合成萜类成分在生物体内合成的真正前体IPP和DMAPP。

人参皂苷生物合成途径的中游途径是三萜碳环骨架合成的途径,达玛烷型和齐墩果酸型的碳环骨架的形成是将具有活性的二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)作为起始单位,通过萜类环化酶和烯丙基转移酶的催化后所构建的。C10 = 牛儿基焦磷酸(GPP)合成酶、C15法呢基焦磷酸(FPP)合成酶和C20 = 牛儿基 = 牛儿基焦磷酸(GGPP)合成酶均属于烯丙基转移酶,它们的区别在于丙烯基底物的长度不同。C10 = 牛儿基焦磷酸(GPP)是通过DMAPP的C5骨架和其异构体IPP在牦牛儿基焦磷酸合成酶(GPPS)的作用下按照头–尾方式缩合而生成。C15法呢基焦磷酸(FPP)是在法呢基焦磷酸合成酶(FPPS)作用下,GPP和第二个IPP缩合生成。然而C20 = 牛儿基 = 牛儿基焦磷酸(GGPP)则是通过FPP与第三个IPP缩合而成的一种烯丙基转移酶[15] 。随后,两分子的C15法呢基焦磷酸头–头还原偶联后生成C30骨架的角鲨烯,这一过程是在角鲨烯合成酶(SS)催化的分子内进行的环化反应,与烯丙基转移酶的作用方式是不同的,它是首先通过头–头相接形成一个环丙基中间产物,所谓的前角鲨烯,然后再转化成C30的产物[16] [17] 。最后经过鲨烯环氧酶(SE)催化转化形成是异戊二烯途径的终产物。

齐墩果酸型和达玛烷型人参皂苷的合成是人参皂苷生物合成途径的下游途径,在人参皂苷生物合成的中游途径最终生成了甾醇和三萜等代谢产物生物合体的共同前体2,3-氧化鲨烯[18] -[20] 。2,3-氧化鲨烯在环化酶(OSC)的作用下生成植物甾醇和三萜类骨架,在人参中,氧化角鲨烯环化酶(OSC)家族包括β-香树酯合酶(β-AB)、环阿屯醇合酶(CS)和达玛烷合酶(DS),分别位于固醇和三萜生物合成途径的分支点上。根据三萜苷元存在的骨架结构不同,导致人参皂苷存在两种型:一种是达玛烷型,而另一种则是齐墩果酸型两类,此外达玛烷型无论是在含量上,还是在结构多样性上均高于齐墩果酸型[21] -[23] 。植物固醇的前体则是由CAS催化形成的环阿屯醇,而人参皂苷的前体则是由β-香树酯合酶(β-AS)和达玛烷合酶(DS)催化,但是其中β-香树酯合酶(β-AS)则为齐墩果烷型人参皂苷的合成提供了四环骨架,与此同时达玛烷型人参皂苷合成则是由达玛烷合酶(DS)提供了达玛烷四环骨架并存在着细胞色素P450通过单加氧酶、糖基转移酶和糖苷酶等化学修饰[24] 。

3. 人参皂苷生物合成途径中的关键酶

近年来,由于人参皂苷在人参体内含量甚微,科学家们对人参皂苷的生物合成途径进行了大量的研究,目的是为了有效的利用系统生物工程技术大量生产人参中有药用价值的人参皂苷,并取得了一些进展,尽管目前对人参皂苷的生物合成途径已有了基本的认识[25] [26] ,然而对于起到重要作用的关键酶的功能和调控机制仍处在研究和推测的阶段。人参皂苷的生物合成途径包括20多步的连续酶促反应。其中十分重要的几种关键酶为:3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶、法呢基焦磷酸合酶、角鲨烯合酶、鲨烯环氧酶、达玛烯二醇-II合酶、β-香树素合酶、植物细胞色素P450和糖基转移酶[5] 。

1) 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是MVA途径中的关键酶之一,通过催化HMG-CoA从而形成MVA,HMGR被认为是MVA途径中的第一个限速酶,同时是萜类化合物合成过程中最先起作用的关键酶。Wu[27] 等还发现该基因与从其他许多植物中克隆到的HMGR基因具有很高的同源性,尤其是同源性可以达到83.8%的喜树的HMGR。而喜树中存在的喜树碱的生物合成是要通过MVA途径,由此可推断HMGR基因与人参皂苷生物合成有着密切的相关性。虽然HMGR是人参皂苷生物合成途径中的一个上游酶,但是作为一个可调节MVA途径的关键酶,HMGR也可以通过影响人参皂苷两个前体(IPP和DMAPP)的产量而最终影响人参皂苷的生物合成。

2) 法呢基焦磷酸合酶(FPS)可作为一分子的IPP和GPP合成FPP的催化剂,Kim等通过从人参根中克隆得到编码FPS的基因PgFPS,通过Southern blot分析表明,人参中含有两个以上的FPS编码基因。PgFPS在大肠杆菌中的表达充分证明了重组蛋白具有FPS的活性。Kim[28] [29] 等又通过将人参的PgFPS基因转移到积雪草毛状根中并在根中使其过量表达,结果发现积雪草达玛烷合成酶的mRNA水平显著提高,三萜皂苷羟基积雪草苷和积雪草皂苷的含量瞬时上升。上述结论表明,FPS在三萜类化合物质的生物合成中扮演着十分重要的角色,是运用合成生物工程技术提高人参皂苷含量的一个关键酶。

3) 角鲨烯合酶(SS)作为类异戊二烯途径限制酶,催化甾醇和三萜类化合物合成的起始步骤,其含量和活性对于人参皂苷的最终产量起着非常重要的作用。国外学者Lee[30] 等将人参叶作为试验材料从构建的cDNA文库中克隆得到了SS基因PgSS1,PgSS1基因在人参中过度表达可导致甾醇和人参皂苷的合成,这是首次报道SS基因是三萜类化合物生物合成的调节基因。Lee[16] 等推测,SS在转基因植物中过量的表达很有可能激发甾醇和人参皂苷生物合成中下游基因的转录,从而提高人参皂苷的含量。Kim[30] 等通过采用不定根作为试验材料构建的表达序列标签文库中克隆得到了与PgSS1为同源基因的另外两个基因:PgSS2和PgSS3。通过原位杂交分析表明,PgSS1、PgSS2和PgSS3在人参不同器官中的转录水平是各不相同的,其试验结果表明这三个SS基因虽然表达模式不同但都参与人参的鲨烯合成。综上所述,SS可以利用合成生物学技术作为提高人参皂苷产量的一个非常重要的元器件。

4) 鲨烯环氧酶(SE)作为三萜类皂苷生物合成途径中的重要限速酶,催化着甾醇和三萜类生物合成的第一步氧化反应,相关试验研究认为,三萜皂苷的生成量与SQE基因mRNA表达量呈正相关。研究发现人参SQE基因与刺五加、三七等植物SQE基因序列同源性达到了90%以上,它们同属于对植物三萜类化合物形成与积累起到重要调控作用的鲨稀环氧酶家族。国外学者Han等从cDNA文库中克隆到了PgSQE1和PgSQE2两个SE基因,在转基因人参根中利用RNA干扰(RNAi)技术PgSQE1的沉默导致PgSQE2和环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase, CAS)的表达量上调,从而导致甾醇的含量提高。于此同时沉默基因SQE导致了人参中三萜类皂苷含量急剧下降,结果表明PgSQE1和PgSQE2具有不同的调控机制,沉默基因PgSQE1只参与人参皂苷的合成,而与甾醇的产生无关[31] 。此外,蒋世翠等针对西洋参14个组织器官中总皂苷和单体皂苷量的差异进行分析,同时还分析了SS和SE基因在14个组织或器官的表达量,结果发现SS和SE的基因表达量具有非常显著地差异,并与人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd和总皂苷量之间存在着正态分布[32] 。由此可见,SS和SE在人参皂苷生物合成途径中都起着极其重要的作用。

5) 达玛烯二醇-II合酶(DS)在它的催化下2,3-氧化角鲨烯环化为达玛烷二醇,被认为是人参皂苷生物合成中最重要的关键酶。Tansakul[18] 等通过同源碱基PCR的方法突破性的克隆得到了DS-II的cDNA序列,并使其在羊毛固醇合成酶的酵母中表达,LC-MS和NMR的数据分析发现有大量的达玛烷二醇合成。最近,有研究人员利用RT-PCR技术克隆出了DS的基因,这个达玛烷-II合酶包含一个2310bp的编码770个氨基酸的多肽ORF。此外,DS被RNA干扰在转基因人参根中可沉默DS的表达。从而导致了转基因人参根中皂苷产量减少至84.5%。这些研究表明,DS作为人参皂苷生物合成的一个重要元器件,因此DS过度的表达,可导致人参皂苷的生物合成大幅度提升。

6) 在β-香树酯合酶(β-AS)的催化作用下2,3-氧化角鲨烯可环化为B-香树素,是迄今为止发现的唯一一种合成齐墩果烷型人参皂苷Ro的关键酶。Kushiro[22] 等采用同源碱基PCR的方法从人参毛状根中首次成功克隆出了β-AS的cDNA序列PNY,其全长序列为2289个核苷酸,编码763个氨基酸。赵寿经等利用RT-PCR技术从人参毛状根的总RNA中扩增出了β-AS基因,并成功的建造了人参β-AS基因的反义植物表达载体。由于β-AS作为合成齐墩果烷型人参皂苷Ro的关键酶,因此通过采用遗传工程技术的专一性为获得人参皂苷Ro提供了有效手段。

7) 植物细胞色素P450是由少数几个超基因家族之一编码的含有血红素的氧化酶类,参与多种生物过程,包括三萜皂苷次生代谢的后修饰过程。其中在人参皂苷的生物合成中,细胞色素P450主要对碳环骨架进行羟基化,氧化和糖基化等复杂修饰作用,在这种复杂的修饰过程后就是形成结构多样性的主要因素。近年来,为了鉴定CYP450对人参皂苷生物合成途径中所起的重要作用,不少课题组通过大量实验加以证明其功能[33] 。Seki和Shibuya等人通过CYP88D6催化甘草(Glycyrrhizauralensis)β-AS C-11位的氧化反应;大豆(Glycine max)β-AS和sophoradiol C-24位被CYP99E1羟基化,这一系列实验结果充分鉴定了CYP450s对于齐墩果烷型人参皂苷合成途径的重要性[34] [35] 。Han等得到了9个候选CYP450全长基因,并发现其中一种基因不仅可以使茉莉酸甲酯诱导表达量增强,而且还导致转入过量表达SS基因的转基因人参后能使人参根中皂苷的产量显著提高[36] 。上述关于CYP450对人参皂苷合成相关性的研究进展,极大的推动了人参皂苷合成途径的研究。

8) 糖基转移酶(GT)人参皂苷生物合成的最后一步就是由GT催化的糖基化反应,其主要的反应过程是将核苷二磷酸活性的糖分子转化到人参皂苷苷元底物上,最终形成糖苷键。糖基化的作用是可以增强人参皂苷的稳定性以及水溶性,这一糖基化反应过程也决定了人参皂苷的多样性。因此,GT是人参皂苷代谢途径上的一个十分重要的酶。Yue等通过从三七悬浮细胞中获得了一种能将Rd转化为Rb1的GT[37] 。此外,陈欣等通过采用酶学特征对从人参毛状根中提取分离得到的GT进行了初步研究[38] 。但到目前为止人们尚未从人参属植物中克隆出GT基因。糖基化反应时人参皂苷生物合成途径中最下游的步骤,对其进行深入研究对获取较高价值的人参皂苷具有非常重要的意义。

4. 展望

人参植物可产生多种人参皂苷,包括起到抗肿瘤作用的Rh2、Rg3和Rc,以及具有抗疲劳、延缓衰老、改善记忆力的Rg、Rg1和Rb1,人参皂苷的生物合成途径是受多种条件因素共同协调的非静止变化过程,其合成途径中所涉及的多种中间产物、分支点和多种关键性的酶导致其合成过程的复杂性。此外还存在一些外界环境的因素同样可以导致人参皂苷合成产量的变化。因此对于人参皂苷生物合成研究备受关注。但应用生物工程技术想要大幅度提高人参皂苷含量仍没有取得突破性的进展。目前伴随着代谢组学和功能基因组学的快速发展,将为阐明人参皂苷代谢途径中一些亟待解决的重要性问题提供了很好的帮助,最终为人工调控人参皂苷生物合成提供了支持。相信随着科学技术的日益发展和完善,人参基因工程终将发挥越来越重要的作用,为增强药物来源和提高药用植物质量以及创造更多的经济效益发挥重要的作用。

项目基金

感谢林业公益性行业科研专项经费(20120460108)、国家林业局林业科学技术推广项目([2012] 46)和东北林业大学青年拔尖人才支持计划(PYTT-1213-07)的资助。

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NOTES

*通讯作者。

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