ABSTRACT

White spot syndrome virus (WSSV) is one of the major viral pathogens which has greatly hampered the healthy development of the aquaculture industry of shrimps and crabs. Compared with other viruses, the WSSV genome is characterized with a huge size and relatively low homology. This paper has summarized and prospected the recent progress in the study of the genome, mechanism of virus-host interaction, detection, prophylaxis and control of the WSSV. This review will contribute to the better understanding of the WSSV and its future research direction.

Keywords:White Spot Syndrome Virus, Genome, Interaction Mechanism, Shrimps, Crabs

白斑综合症病毒研究的最新进展

李雪飞¹，陶奕文¹，郭华荣^1,2*

¹中国海洋大学，海洋生命学院，海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东 青岛

²中国海洋大学，海洋生命学院，海洋生物多样性与进化研究所，山东 青岛

收稿日期：2020年5月4日；录用日期：2020年5月20日；发布日期：2020年5月27日

摘 要

白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是危害我国虾蟹类水产养殖业健康发展的重要病毒性病原体之一，与其他病毒相比，庞大的基因组和较低的基因组同源性是其显著特征。本文对WSSV病毒在基因组、病毒与宿主互作的机制、检测方法及防治手段方面的最新研究进展进行了综述和展望，为加深人们对于WSSV病毒的理解，把握未来发展方向提供帮助。

关键词 :白斑综合症病毒，基因组，互作机制，虾，蟹

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1. 引言

水产养殖是我国渔业经济的重要支柱，然而频发的各类流行性疾病给水产养殖业造成了巨大的经济损失。其中危害虾蟹类养殖的最严重的病毒类病原体之一为白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV) [1] [2]。WSSV的典型病理特征为虾蟹的甲壳上出现白色斑块，一般认为是由于WSSV感染引起代谢功能障碍，进而导致钙盐在体表积累形成 [3]，WSSV感染还可能伴有身体发红、食欲减退、行动缓慢、血淋巴变稀、肝胰腺肿胀及甲壳易剥离等症状。此外，WSSV病毒还具有宿主范围广泛、感染能力强和致死率高等特点，动物在感染后的3~10天内死亡率可达到70%以上，虾类可达到100% [4]，给我国的水产养殖业带来了巨大的挑战 [5]。

1992年，WSSV首次在台湾地区被发现，后传播至日本、韩国、印度和泰国等地。起初各地的疫情被认为是不同病原体同时发病的结果，因此根据形态特点、发病症状及发现地点分别进行命名 [6]。后被证实为同一种病原体，并于1996年被命名为白斑综合症病毒 [7]。起初，研究人员将WSSV归为杆状病毒，后发现二者的DNA聚合酶、核糖体大小亚基及部分开放阅读框(Open reading frames, ORFs)存在明显差异 [8] [9] [10]，故国际病毒分类委员会(CITV)第七次报告将其归为线形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属(Whispovirus)，WSSV目前为该属的唯一成员。

WSSV病毒粒子呈杆状，完整病毒粒子大小约为(70~167) nm × (210~470) nm，末端具有尾状附器(Tail-like appendage)，包括囊膜(Envelope)、被膜(Tegument)及核衣壳(Nucleocapsid)这三个结构 [4]。WSSV病毒的囊膜是由脂质分子组成的双层膜结构，上面存在大量囊膜蛋白，在病毒的宿主识别及入侵过程中发挥重要功能；被膜位于囊膜与核衣壳之间，可能与病毒在宿主细胞内的运动相关；核衣壳由球蛋白排列组成，大小约为(54~85) nm × (180~420) nm，其内为DNA结合蛋白VP15及DNA组成的致密结构 [11]。Li等(2020)人分别对完整的WSSV粒子及核衣壳进行透射电镜及扫描电镜观察，根据观察结果认为核衣壳由叠在一起的由三排细丝组成的环段组成，而非通常的螺旋结构。他们还对病毒膜的组装过程进行了推测：裸露的核衣壳首先被被膜包裹，形成带有电子致密核壳的未成熟病毒粒子，随后进行第二次包装，被囊膜包裹在其内，形成完整的病毒粒子 [12]。

为了降低WSSV对水产养殖业造成的损失，加深对病毒的致病机理及进化等相关研究，科研工作者对WSSV进行了大量的研究，下面就WSSV的基因组、与宿主互作的机制、检测与防治相关的最新研究进展进行简要介绍。

2. 基因组相关的研究进展

WSSV基因组为双链闭合环状DNA，大小约为300 kb，不同分离株的核苷酸序列的相近程度在99.3%以上 [4]。研究结果表明不同分离株之间的差异主要在于序列的插入与缺失、ORFs内重复单元的差异、基因重组的可变区及单核苷酸多态性差异等 [4] [10]。随着测序技术的不断成熟及研究人员的努力，已成功完成多个WSSV分离株的全基因组测序工作。目前，在NCBI上可查询到14个WSSV全基因组序列，具体信息参照表1。

表1. 不同WSSV分离株的基因组信息

WSSV基因组中约有180个ORFs编码功能蛋白，占基因组92%左右，然而编码的70%以上的蛋白与数据库中的蛋白没有同源性 [4] [9]。约有72%的ORFs具有ATG起始密码子，54%的ORFs具有Poly A结构，早期转录的病毒基因在转录起始位点上游20~30个核苷酸处具有TATA box结构 [9]。25%的ORFs之间有部分重叠，非重叠ORFs之间有155~1595 bp的距离 [8]。此外WSSV基因组内部具有核糖体内部进入位点(Internal ribosome entry site, IRES)，提高了翻译效率 [8] [13]。

WSSV基因组的另一个显著特点为含有9个不同大小的同源区(Homologous regions)，分布于整个基因组中，部分同源区内部还含有少量的ORFs [8] [9]。每个同源区由若干个长度约为250 bp的重复单元(Repeat units)串联而成，由两侧的约70 bp的易变区及中间的约115 bp的保守区组成，保守区内存在一个由A与T组成的不完全回文结构。有研究学者认为同源区的功能为启动子或增强子。李嵚(2003)克隆并纯化了重复单元中158 bp的保守区域，作为亲和层析的配体与感染后的对虾肌肉组织蛋白粗提液进行反应，得到纯化的蛋白后，根据DNA凝胶阻滞反应的鉴定结果，与健康虾的洗脱产物进行对比，并结合肽指纹图谱分析结果，通过与相关数据库进行搜索，确定纯化的蛋白中有5个蛋白为非病毒自身表达的蛋白，可能为虾的相关蛋白，其中1个为ORF59的编码产物，表明重复片段可受该蛋白的调控 [14]。朱艳冰等(2006)人则选取了重复单元内210 bp的片段作为配体，通过WSSV基因组噬菌体展示库最终筛选出1个与其特异性结合的重组噬菌体克隆，比对结果显示相应片段为wsv021的5’部分 [15]。随后他们又克隆并原核表达了wsv021基因，凝胶阻滞结果显示二者的结合是特异性的，对之前的研究成果进行了证实 [16]。综合上述结果，他们推测wsv021可能是一个与病毒复制或调控相关的重要基因。

3. 与宿主互作机制的研究进展

WSSV与宿主的相互作用机制是当下的研究热点，根据实验结果，分析相关基因在这一过程中发挥的功能，一方面加深了研究人员对病毒与宿主之间关系的理解，另一方面也为水产养殖业中疾病的防治提供了理论基础，为相关免疫制剂及疫苗的研发提供了方向。关于WSSV与宿主互作机制的研究成果可分为两大类，一是分析WSSV如何影响宿主细胞的凋亡、抑制宿主细胞内原有的生命活动并利用宿主内的相关系统完成病毒的复制与组装，二是研究宿主如何通过自身的免疫功能抑制WSSV的复制与侵染。

3.1. WSSV与宿主互作的相关机制研究

WSV403由极早期基因wsv403编码，为含Ring-H2结构域的E3泛素连接酶。马艳丽等(2019)人通过串联亲和纯化和蛋白质谱技术，通过293T细胞筛选到15个可能与其互作的蛋白，通过分析选定5个候选蛋白并进行了免疫共沉淀及免疫荧光分析，结果显示WSV403可与核转运蛋白(KP-NA6) 、丝/苏氨酸蛋白磷酸酶2A (PPP2RIA)以及striatin (STRN)蛋白进行互作，为WSV403的功能研究奠定了基础 [17]。VP9是WSSV的一种非结构蛋白，其二聚体为DNA类似物，在感染初期高度表达。Tan等(2020)人向Hela细胞中转染了含有vp9基因的载体，通过横向磁力钳单分子操作(Single-molecule manipulation using transverse magnetic tweezers)、荧光漂白恢复、荧光各向异性分析(Fluorescent anisotropy assay)、盐分馏、微球菌核酸酶可及性分析(Micrococcal nuclease accessibility assay)、Southern blot及微阵列技术表明，VP9可通过增加组蛋白的迁移率及溶解度来抑制组蛋白与DNA的结合，从而进一步改变染色质高级结构。染色质重排可阻碍宿主细胞的分裂，并促进病毒复制，这为子代病毒的形成提供了条件 [18]。wsv152为非结构蛋白基因，定位于宿主的染色体外膜。Yan等(2020)人通过谷胱甘肽S-转移酶的下拉实验(Pull down)及免疫共沉淀分析证明WSV152可与对虾的线粒体蛋白细胞色素C氧化酶5a (Mitochondrial protein cytochrome c oxidase 5a, COX5a)互作，导致宿主细胞的凋亡。抑制wsv152基因的表达可导致细胞色素酶C等凋亡相关基因的表达下调，此外还导致宿主组织中WSSV的拷贝数显著降低，从而降低感染后的对虾的死亡率，表明wsv152可能与宿主细胞的凋亡相关，在WSSV的传播及发病中发挥复杂功能 [19]。

3.2. 宿主抗病毒相关的免疫机制研究

对虾的免疫系统并不完善，以非特异性免疫为主。卡西塔斯B谱系淋巴瘤(Casitas B-lineage lymphoma, CBL)家族蛋白是RING型E3泛素连接酶，在信号转导中发挥重要功能。Kong等(2020)人克隆了泥蟹(Scylla paramamosain)的CBL家族蛋白基因sp-CBL，并制备了相应的siRNA与多克隆抗体。qPCR及Western Blot结果显示，当泥蟹被WSSV侵染时，sp-CBL的表达显著增加；敲降sp-CBL，泥蟹体内的WSSV数量增多，细胞凋亡比例降低，半胱天冬酶3 (Caspase 3)的活性降低，线粒体膜电位升高。因此，他们推测当WSSV进入泥蟹体内后，sp-CBL表达升高，进而降低线粒体的膜电位，Caspase 3酶活性升高，促进细胞凋亡，从而控制WSSV在宿主体内的进一步扩增 [20]。Tao等(2020)人则探究了一种凡纳滨对虾的血浆蛋白在血细胞抗凋亡中的功能。该血浆蛋白为一种胰蛋白酶样蛋白，被命名为LvTLAP (L. vannamei trypsin like anti-apoptosis protein)，当对虾被WSSV侵染时，血细胞中该基因表达显著上调。使用dsRNA对LvTLAP进行敲降，与对照组相比，血细胞的凋亡比例显著上升，凋亡相关基因LvCaspase3/7和LvCytochrome C表达显著增加，而凋亡抑制因子LvIAP1的表达则明显下调。随后，他们通过GST下拉试验确定了血细胞中与LvTLAP互作的蛋白为生长与转化依赖样蛋白(LvGTD-like protein)；当LvTLAP表达下调时，LvGTD-like protein的表达上调。因此他们推测LvTLAP可能通过抑制LvGTD-like protein的凋亡活性，进而保护对虾血细胞免于凋亡 [21]。Bao等(2020)人研究了MicroRNA-589-5p通过调节血蓝蛋白(Hemocyanin, HMC)的表达进而参与宿主抗病毒的过程。通过构建稳定过表达EGFP-LvHMC的果蝇S2细胞，流式细胞术及双荧光素酶报告基因检测结果表明，miR-589-5p负调节LvHMC，在对虾体内敲降或过表达miR-589-5p也获得了相应的结果。当miR-589-5p表达增加时，WSSV侵染后对虾的死亡率提高，血细胞及肝胰腺中病毒的拷贝数也增加，表明miR-589-5p通过负调节LvHMC进而影响宿主的免疫反应 [22]。Li等(2018)人将RNAi干扰、免疫荧光及qPCR等技术相结合，阐明了对虾通过Toll4-Dorsal-AMPs的级联信号传导通路，抑制WSSV的侵染。具体为：1) Toll4受体识别WSSV，诱导MyD88/Tube/Pelle复合体的组装；2) 上述复合体加速Cactus的降解，诱导转录因子Dorsal 在Ser342位点磷酸化，并从胞质转移到细胞核中；3) Dorsal 与基因组中的特殊位点结合，激活相关抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)基因的表达，如抗脂多糖因子(Anti-LPS-factor, ALF)和溶菌酶(Lysozyme, LYZ)等；4) 抗菌肽分泌到胞外，与WSSV的相关结构蛋白结合，进而抑制WSSV的侵染 [23]。

4. 检测方法的研究进展

目前WSSV的检测方法包括观察法、组织学方法、电子显微镜技术、核酸探针技术、PCR技术及ELISA检测技术等，在此基础上，研究人员不断改进检测方法，或将几种技术结合使用，提高检测的灵敏性、准确性及特异性。对动物进行检测时，应根据具体要求灵活选取检测方法。陈红莲等(2020)人采用改进后的套式PCR法检测了2018年4~5月份安徽省4个市中集中养殖的克氏原鳌虾的部分样本的WSSV携带情况，并根据当地的具体情况进行分析，给出了不同的建议，给养殖户的疾病防治工作提供了技术指导 [24]。吴丽云(2019)则改进了基于环介导等温扩增(Loop mediated isothermal amplification, LAMP)的快速检测技术，通过设计两条内引物、两条外引物和一条环引物，加入到扩增体系中，再向体系中加入钙黄绿素作为指示剂，63℃反应1小时，即可根据扩增产物的颜色进行判断。该法操作简单，特异性好，灵敏度高，最低检测限度在0.225~2.25 copies/μL之间，且可直接通过观察进行判断，不需要借助检测仪器，具有诸多优点 [25]。此外，由于不需要复杂的实验仪器，具有稳定热源的设备足以进行反应，因此具有应用到实际生产中的价值。

5. 防治手段的研究进展

5.1. 防止WSSV进入养殖环境

白斑综合症的爆发是动物自身的健康状况、环境因子及WSSV病毒粒子的存在等多方面因素共同影响的结果。有报道显示当养殖环境急剧变化时，对虾出现应激反应，体质变弱，给WSSV的爆发提供了条件与场所 [26]。此外，养殖户为节约成本采取集约化养殖的模式，尽可能增加养殖密度，为个体之间的水平传播提供了条件 [27]。对WSSV进行防控，首要任务是保证水体的清洁。定期对饲养池进行彻底消毒，避免病毒的进入；加强水质管理，保证溶氧充足；控制合理的养殖密度，避免虾蟹同池养殖；定期从池中取样进行检测，降低疾病爆发的风险 [28]。以上措施可有效控制对虾疾病的爆发，且不需很高的费用及技术水平。

5.2. 使用免疫增强剂

向饲料中添加免疫增强剂以提高虾蟹类对WSSV的抵抗能力也是有效的方法之一。常见的添加剂包括维生素、益生菌、藻类(如螺旋藻和单胞藻等)及多糖类(如脂多糖、葡聚糖及肽聚糖等)等 [29]。近年来将中草药制剂作为免疫添加剂的相关研究也取得了一定的进展。中草药中包含的免疫活性物质主要包括生物碱、皂甙、蒽类、多糖、有机酸及挥发油等，它们主要通过增强细胞的代谢能力来促进机体血液循环，提高免疫力 [30]。陈辉辉等(2017)人将黄芪、甘草及陈皮等11种中草药组合成复方药剂，并添加到基础饲料中至终浓度为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%及2.0%，未添加组作为对照。分别计算不同组别中凡纳滨对虾的生长指标，后使用WSSV进行染毒试验，测定总超氧化物歧化酶(T-SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物磷酸酶(ACP)、谷草转氨酶(GOT)及谷丙转氨酶(GPT)的酶活，并统计实验动物的存活率。实验结果显示该中草药添加剂可促进对虾的生长，0.4%和1.2%的添加组增重率最高；低剂量复方中草药可延缓染毒对虾的死亡时间并降低死亡率，以0.8%添加组的保护效果最好，与对照组100%的死亡率相比，0.8%添加组的死亡率仅为66.67 ± 6.11%；除GPT活力变化不稳定外，其余4种酶的活力在12~96 h内均呈现先升后降的趋势，可能原因为机体为抵抗病毒侵染而调节自身的免疫防御机制。虽然不同实验组间有细微区别，总体而言0.8%和1.2%的添加组的酶活最高。综合上述结果，他们认为该复方中草药可以提高对虾对WSSV的抵抗能力，其中，以0.8%的添加终浓度保护效果最好，这为将中草药应用于水产养殖中WSSV的防治提供了依据 [31]。

5.3. 研发特异性疫苗

目前，针对WSSV的疫苗包括灭活病毒粒子疫苗、病毒蛋白亚单位疫苗、蛋白抗体疫苗、dsRNA疫苗及DNA疫苗等 [32]。

Taju等(2018)人原核表达并纯化了VP28蛋白，随后使用离子凝胶法制备了壳聚糖三聚磷酸盐纳米粒子(CS/TPP)，并用其包裹纯化后的VP28蛋白。将饲料分别与PBS (对照)、粗制VP28蛋白(饲料A)、纯化VP28蛋白(饲料B)及CS/TPP封装后的VP28蛋白(饲料C)混合，投喂实验用虾后进行染毒实验，结果显示，与对照组相比，饲料A、饲料B及饲料C对实验动物的保护率分别为65%、70%及80%，实验组中与免疫相关的酶的活性也显著提高。以上结果表明CS/TPP可以有效传递VP28蛋白，提高对虾的免疫能力，也为WSSV的口服疫苗的研发提供了思路与基础 [33]。郭媛媛等(2017)人以口服的方式使用转vp28基因的蓝藻免疫幼虾，以投喂普通的饲料的幼虾作为对照，7 d后感染WSSV，通过测量免疫相关酶类的活力来评估该口服剂的免疫效果。检测结果显示，实验组幼虾的超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)、过氧化氢酶(CAT)和碱性磷酸酶(AKP)的活性均有不同程度的提高，表明该口服剂能增加对虾对WSSV的抗性。与投喂普通的饲料相比，幼虾的生长速度有明显变化，表明该转基因蓝藻同时还是一种优良的饵料。这些工作为研制并大规模生产可用于预防WSSV的对虾饲料提供了重要的实验依据 [34]。Cho等(2017)人利用杆状病毒构建了单独含有vp28、vp19及含有vp28和vp19组合的DNA疫苗，后又在vp28和vp19组合的基础上在3’端融合了鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白2 (Salmonella typhimurium flagellin 2, FL2)基因制成相应疫苗，分别接种实验动物后进行染毒实验。结果显示接种仅含有vp28和vp19基因疫苗的动物的死亡率为28.9%和34.2%，接种vp19-vp28和vp28-vp19基因组合疫苗的死亡率为21.2%和23.7%，而接种了vp19-vp28-FL2及vp28-vp19-FL2基因疫苗的死亡率为15.8%及10.5%，此外，qPCR结果显示，接种融合了FL2基因的疫苗，动物体内的NF-κB表达更高，表明融合FL2基因可以增加相应DNA疫苗的免疫能力 [35]。与蛋白疫苗相比，DNA疫苗的优点在于稳定性好，持续时间久，但免疫效果也相对较差，而这一研究成果表明可以通过融合基因来增加免疫能力，为DNA疫苗的研发提供了思路。

6. 总结与展望

WSSV病毒的基因组较大，在目前已知的动物病毒基因组中排在第四位 [4]，其编码的大部分蛋白与数据库中的蛋白缺少同源性，给研究人员的工作带来了困难。此外，缺乏可连续传代的甲壳类动物细胞系也增加了WSSV病毒研究的难度。WSSV的基因组存在一些独特的特征，这可能代表了海洋与陆地病毒在进化上的差异 [36]。对WSSV与宿主之间的互作机制进行研究，可以使人们更好地理解WSSV致病的机理。不断改进检测方式，制备相应疫苗，为生产实践中疾病的防控提供了技术支持，减少经济损失。

虽然关于WSSV的研究已经取得了一些进展，但仍有许多的科学问题有待解决，如编码的特有的功能蛋白的具体功能、基因组重复区的功能与作用机制以及病毒传播的机制等。WSSV与目前已知的所有病毒都具有较大区别，对其进行系统透彻的研究已经超出了病害防治的目的，可以进一步丰富病毒学研究的领域与分支，为病毒分类学研究提供了方向，具有重要的理论意义。

基金项目

国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”专项(2018YFD0901301)和中央高校基本科研业务费专项(201822018和201762003)资助。

文章引用

李雪飞,陶奕文,郭华荣. 白斑综合症病毒研究的最新进展
Recent Advances in the Study of White Spot Syndrome Virus[J]. 海洋科学前沿, 2020, 07(02): 44-51. https://doi.org/10.12677/AMS.2020.72007

参考文献