¹西安医学院，陕西 西安

²西安交通大学医学院附属陕西省肿瘤医院，陕西 西安

收稿日期：2022年12月12日；录用日期：2023年1月5日；发布日期：2023年1月12日

摘要

近年来免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor, ICIs)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的治疗中取得了巨大的进展，NSCLC的免疫治疗已成为继手术、化疗、放疗后的标准治疗方法之一，但只有部分NSCLC患者能从ICIs治疗中获益，因此，迫切需要探索出能够预测ICIs疗效的生物标志物，为临床优势人群的筛选提供依据。肿瘤程序性死亡配体-1 (programmed cell death ligand 1, PD-L1)是免疫治疗中最早进行探索的指标，对于免疫治疗的疗效展现出一定的预测作用，但具有一定的局限性，其他生物标志物也展现出一定的预测作用，例如肿瘤突变负荷(tumor mutation burden, TMB)、肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)、微卫星不稳定/错配基因修复(microsatellite instability/mismatch repair, MSI/MMR)、肠道微生物群等。本文就不同指标在NSCLC免疫治疗的疗效预测价值展开探讨。

关键词

非小细胞肺癌，免疫治疗，预测标志物

Research Progress in Prognostic Markers of Immunotherapy for Non-Small Cell Lung Cancer

Keyu Zhang¹, Suoni Li², Qi Zheng², Shangying Sun¹, Zhilan Gao¹, Zheng Zhao^2*

¹Xi’an Medical University, Xi’an Shaanxi

²Shaanxi Provincial Cancer Hospital, Affiliated to Xi’an Jiaotong University Medical College, Xi’an Shaanxi

Received: Dec. 12^th, 2022; accepted: Jan. 5^th, 2023; published: Jan. 12^th, 2023

ABSTRACT

In recent years, immune checkpoint inhibitors have made great progress in the treatment of non-small cell lung cancer. Immunotherapy of NSCLC has become one of the standard treatment methods following surgery, chemotherapy and radiotherapy. However, only some NSCLC patients benefit from ICIs treatment. Therefore, it is urgent to explore biomarkers that can predict the efficacy of ICIs and provide a basis for screening the population with clinical advantage. Programmed cell death ligand 1 (PD-L1) is the first explored indicator in immunotherapy, showing a certain predictive role for the efficacy of immunotherapy, but with certain limitations. Other biomarkers have also been shown to be predictive, such as tumor mutation burden (TMB), tumor microenvironment (TME), microsatellite instability/mismatch repair (MSI/MMR), intestinal microflora, etc. In this study, we explored efficacy prediction value of different indicators in NSCLC immunotherapy.

Keywords:Non-Small Cell Lung Cancer, Immunotherapy, Predictors

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1. 引言

肺癌在全球所有肿瘤中发病率位居第二，死亡率位居第一 [1]，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌病理类型的85% [2]。近年来肿瘤的免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor, ICIs)治疗逐渐兴起，但只有约20%的NSCLC患者能从ICIs治疗中获益 [3]，所以如何筛选出优势人群从而达到精准治疗目标成为临床中面临的一个问题。一些生物标志物被发现对NSCLC患者免疫治疗的疗效显示出一定的预测作用，例如肿瘤程序性死亡配体-1 (programmed cell death ligand 1, PD-L1)、肿瘤突变负荷(tumor mutation burden, TMB)、肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)、微卫星不稳定/错配基因修复(microsatellite instability/mismatch repair, MSI/MMR)、肠道微生物群等。这些生物标志物为临床医生及患者选择治疗方案提供了一定的指导作用，但是不同指标预测效能不尽相同。有研究表明，随着患者肿瘤微环境中PD-L1表达、肿瘤组织TMB水平、肿瘤微环境组成、基因测序微卫星是否稳定、肠道微生物菌群稳定等状态不同时，使用ICIs治疗疗效也随之变化。但是不同指标预测效能不尽相同，且都不够完美，本文就NSCLC免疫治疗相关的生物标志物的研究现状和进展进行综述，以便全面了解不同标志物特点，以期为临床优势人群的筛选提供参考。

2. PD-L1 (程序性死亡配体-1)

PD-1 (programmed cell death 1，程序性死亡受体-1)/PD-L1是介导肿瘤细胞免疫逃逸的重要通路，PD-L1在肿瘤表面和肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中表达，与效应T细胞上的PD-1受体结合，使PD-1发生磷酸化和SHP2磷酸酶水平升高 [4]。PD-1在活化的T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞(Dendritic Cells, DC)、调节T细胞(Regulatory cells, Tregs)和自然杀伤T细胞(Natural killer T cell, NKT)等细胞上表达，可能通过耗竭T细胞、增强肿瘤微环境的免疫抑制状态，降低肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)的吞噬能力等途径，诱导肿瘤的免疫耐受，使肿瘤细胞形成适合生长的微环境，造成肿瘤细胞的免疫逃逸，促进肿瘤细胞的生长 [5]。而免疫检查点抑制剂治疗，就是通过阻断PD-1/PD-L1通路，使免疫系统活性增强，恢复免疫系统对肿瘤细胞的杀伤能力 [6]。所以肿瘤细胞和组织表达PD-L1水平高低成为预测ICIs疗效的重要因素之一。

KEYNOTE024研究表明，对于PD-L1肿瘤细胞阳性比例分数(tumor proportion score, TPS) ≥ 50%的NSCLC患者，pembrolizumab单药治疗组5年生存率(survival rate)高于化疗组(31.9% vs 16.3%) [7]，KEYNOTE042研究在PD-L1表达≥1%的NSCLC患者中也得到类似结果 [8]。KEY-NOTE189研究显示，随着PD-L1表达增加，使用pembrolizumab联合化疗组的患者其无进展生存期(progression-free survival, PFS)逐渐提高 [9]。

但并非NSCLC患者使用ICIs的疗效都与PD-L1表达水平有关。IMpower150研究表明，在bevacizumab联合化疗的基础上加用atezolizumab可提高NSCLC患者的PFS和总生存期(Overall Survival, OS)，但与患者PD-L1表达水平无关 [10]。KEYNOTE-407研究显示，某些PD-L1表达<1%的患者能观察到ICIs的获益，但一些PD-L1高表达的患者对ICIs无明显的反应 [11]。因为部分PD-L1阴性患者也可以从ICIs中获益，而PD-L1表达≥50%的患者，客观缓解率仅有40%~50%，并不是所有的患者都能从ICIs治疗中获益，因此PD-L1表达水平对患者使用ICIs疗效的预测效能有待进一步证实。

早期的NSCLC患者可以选择新辅助免疫治疗的方法。NeoSTAR研究使用nivolumab + ipilimumab新辅助治疗可手术的NSCLC，观察到主要病理学缓解(major pathologic response, mPR)的患者治疗前肿瘤样本中的肿瘤细胞PD-L1表达总体较高(p = 0.017) [12]。Shu等人的一项Ⅱ期临床研究表明，早期NSCLC患者使用atezolizumab新辅助治疗的mPR和病理学完全缓解(complete pathological response, pCR)与PD-L1表达水平有关(p < 0.05) [13]。

从以上临床研究可以看出，使用PD-L1作为生物标志物来预测NSCLC患者免疫治疗疗效可能有一定的价值，但PD-L1的表达与临床疗效之间并不是正相关关系。其可能与肿瘤的异质性、PD-L1表达的不稳定性、检测和评分方法的不同、病理医生评估TPS的主观性等因素有关，所以需要我们进一步地探索。超稳定纳米气泡(NB)可以作为细胞表面分子成像的造影剂，增强PD-L1的显示对比度信号，可以提高对PD-L1的检测能力 [14]。而近期也有去糖基化PD-L1在PD-L1检测中的应用，能够提高PD-L1的检出几率 [15]，可能成为未来疗效预测新的指标。

3. 肿瘤突变负荷(TMB)

组织TMB (tissue TMB, t-TMB)是指在所检测的肿瘤组织中，每兆碱基区域内发生非同义突变的个数。其计算方法为：突变数目/所检测外显子Mb长度，目前最常用的TMB测定方法是全外显子组测序(WES)。一般来说，研究对象的TMB突变水平在NSCLC数据库中排序为前25%的患者定义为高TMB (TMB-H)组，排名数值在25%之后的为低TMB (TMB-L)组。

Checkmate227临床研究基于TMB分层后发现，TMB-H (TMB ≥ 10 muts/Mb)的患者使用ICIs治疗的PFS及ORR均较常规化疗更高 [16]。Checkmate026临床研究基于PD-L1分层并没有发现使用ICIs治疗和化疗之间PFS和OS之间的差异，但基于TMB分层后发现，TMB-H的患者使用ICIs治疗的PFS及ORR均较常规化疗有更高，但OS数据却没有差别 [17]。而KEYNOTE201研究没有发现TMB表达与ICIs疗效的相关性 [8]。这些结果提示TMB对于NSCLC患者使用免疫治疗的预后临床价值有限。由此来看，TMB作为预测指标也同样不够完美。

血液TMB (blood-TMB, b-TMB)指在血液组织中检测计算得到的肿瘤突变负荷。一项前瞻性的2期临床试验显示，b-TMB ≥ 16 muts/Mb组的OS和ORR更高，且ORR随着b-TMB的增高而增加 [18]。

TMB虽然可以作为ICI治疗效果的预测标志物，但也有其局限性，包括检测方法的不一致，不同肿瘤的异质性，以及对TMB高低水平定义的阈值不同等，均可能对预测效能产生影响。

4. 肿瘤微环境(TME)

肿瘤微环境指肿瘤所生存的环境，主要包含肿瘤细胞、周围的血管、细胞外基质、免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞和各种细胞因子、趋化因子等所构成，是影响肿瘤生长和转移的关键因素。

4.1. 肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)

TILs是指肿瘤微环境中的异质性淋巴细胞，主要包括T细胞、B细胞、NK细胞等。高水平的TIL与多种肿瘤(包括NSCLC)更好的预后相关，这可能与免疫系统的激活有关，使机体对肿瘤细胞有更强的杀伤能力 [19]。TIL主要包括CD3+TIL、CD4+TILs、CD8+TILs和CD20+TILs 等，CD3+TILs在NSCLC患者中的作用目前尚不清楚，有研究表明，低CD3+TILs可能是结肠癌患者的一个额外危险因素 [20]。CD8+T细胞与细胞免疫有关，而CD4+T细胞与体液免疫有关，不同肿瘤组织所含的CD8+T细胞和CD4+T细胞比例可能不相同，对肿瘤细胞的杀伤主要依赖CD8+T细胞，可能因为其直接对肿瘤的杀伤作用 [21]。

有研究将NSCLC患者基于免疫组化或mRNA测序分组，其中高表达CD8+TILs患者有更长的OS (9.4个月vs 5.6个月；p = 0.05)，而与PD-L1表达情况无关，另外，高PD-L1水平同时低CD8+TIL水平的患者预后可能最差 [22]。抗PD-1治疗可诱导肿瘤浸润耗竭样CD8+T细胞的增殖，从而产生抗肿瘤作用。在一项对100例早期和26例晚期NSCLC患者接受新辅助治疗的回顾性研究中发现，患者接受nivolumab治疗时，PD-1/CD8比值越低，其OS和无病生存期(Disease-free survival, DFS)越长。在PD-L1表达不同的情况下，PD-1阴性为T淋巴细胞提供了免疫豁免的微环境，为晚期NSCLC患者提供了手术机会和免疫治疗良好预后的可能 [23]。

CD39+CD8+T细胞为同时可以检测出CD39+CD8+分型的T细，Yeong等人根据肿瘤微环境中CD39+CD8+T细胞比例将NSCLC患者分为对ICIs有反应者和无反应者，可以用来预测ICIs治疗的效果，且这种预测作用独立于CD8 + T细胞比例、PD-L1表达等因素 [24]。

CD8+T细胞可分为效应细胞(effector cell)和效应记忆细胞(memory cell)，Sanmamed等人发现，在NSCLC患者的肿瘤组织中，除了常规的效应细胞之外，还存在着表达CD45RO、EOMES、FAS、Ki67、LAG-3、PD-1、TIM-3等具有“耗竭作用”的细胞(Ebo),而在外周血中并不存在Ebo，提示肿瘤患者的Ebo过度增殖，并且在肿瘤微环境中选择性表达，与免疫治疗的耐药性相关，可以作为潜在的生物标志物 [25]。

根据肿瘤的PD-L1表达状态和是否存在TILs可以将肿瘤微环境分为4组，包括I型(适应性免疫抵抗型)：PD-L1⁺/TILs⁺、II型(免疫忽视型)：PD-L1⁻/TILs⁻、III型(免疫内在感应型)：PD-L1⁺/TILs⁻和IV型(免疫耐受型)：PD-L1⁻/TILs⁺ [26]。其中I型表示TILs具有活性和处于增殖状态，而PD-L1⁺提示肿瘤细胞可能通过PD-L1表达来逃避TILs的攻击，因此在I型肿瘤微环境中，使用抗PD-1/PD-L1治疗可能克服肿瘤的免疫逃避，患者更容易从ICIs治疗中获益；在II型肿瘤微环境中，由于缺乏预先存在的T细胞浸润，且无PD-L1表达，此类患者使用ICIs治疗可能预后较差；而III型也因为肿瘤微环境中没有TILs，阻断PD-1/PD-L1可能不会导致TIL对肿瘤细胞的反应；在IV型肿瘤微环境中TILs存在的情况下，PD-L1呈阴性状态表明免疫反应尚未发生，可能因为TILs的功能受到阻碍，且肿瘤细胞没有受到TILs 的攻击，肿瘤细胞没有诱导PD-L1表达，因此ICIs药物可能在这种微环境中作用受限 [27]。

CD8+PD-L1+TILs的水平在NSCLC肿瘤组织中有所不同，具有高CD8+PD-L1+TILs的肿瘤样本具有更高水平的CD8+TILs、CD68+巨噬细胞、PD-L1+肿瘤细胞、PD-1+ TILs和CD163+ M2型巨噬细胞，并且TMB也更高 [28]。一项回顾性研究表明，在非免疫治疗组中，肿瘤组织中CD8+PD-L1+ TILs水平越高，预后越差(p = 0.005)，而在免疫治疗组中，由于免疫抑制被ICIs阻断，CD8+PD-L1+ TILs水平越高，使用抗PD-1治疗的疗效越好(p = 0.0337)，且PD-L1⁺/CD8⁺含量高组较低组的完全/部分缓解率高(75% vs 31%) [29]。Mazzaschi等人发现，使用nivolumab治疗NSCLC患者时，表达高水平TILs和低水平PD-L1的患者有更长的OS (p = 0.03)，PD-1/CD8比值可作为预后的独立因素，且CD8+T细胞低表达PD-1时其PFS更长(p = 0.004) [23]。

目前对TILs与免疫治疗之间的关系还不是十分清楚，但目前对肿瘤微环境和TILs的研究越来越多，值得我们持续关注。

4.2. 肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophage, TAM)

TAM是指肿瘤组织中浸润的巨噬细胞，是肿瘤微环境中的重要组成部分，可导致肿瘤免疫耐受，刺激肿瘤血管生成和肿瘤的转移，促进肿瘤的发生、进展 [30]。TAM可被不同微环境刺激活化为不同的表型，通常分为经典激活的M1型和替代激活的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞受集落刺激因子-2 (colony stimulating factor 2, CSF-2)、肿瘤坏死因-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、γ干扰素(interferon γ, IFN-γ)等细胞因子激活，可分泌IL-6、TNF-α、IL-12和活性氧，起到促进炎症反应、抑制肿瘤细胞生长等作用，与良好的预后相关；而M2型巨噬细胞由集落刺激因子-1 (colony stimulating factor 1, CSF-1)、IL-4、IL-13和IL-10等细胞因子激活，分泌多种抗炎细胞因子，如转化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β)、IL-10和精氨酸酶等，这些因子可通过多种机制促进肿瘤的生存、发展和转移 [31]。Romano等人使用ipilimumab治疗黑色素瘤患者，根据对治疗应答情况将患者分为有反应组和无反应组，有反应组肿瘤微环境中的TAM密度高于无反应组，且有反应组TAM中M1型/M2型比率明显升高，而M2型TAM在无反应组中密度更高 [32]。这预示着M1、M2型巨噬细胞在肿瘤微环境中的分布可能在与NSCLC患者使用ICIs的疗效有关。一项使用ICIs治疗NSCLC的回顾性研究表明，与其他免疫细胞相比，PD-L1在肿瘤细胞和微环境中的巨噬细胞中明显升高，巨噬细胞中升高的PD-L1与肿瘤中的高PD-L1、CD8和CD68水平相关(p < 0.0001)，巨噬细胞中高PD-L1表达与更好的OS相关，而肿瘤细胞中的高PD-L1表达则与OS没有明显相关性，这可能预示着巨噬细胞中高PD-L1水平可在预测ICIs疗效方面起到一定作用 [33]。

4.3. 自然杀伤细胞(Natural Killer Cell, NK)

NK细胞是具有细胞毒性的先天性淋巴细胞，可通过分泌溶细胞颗粒靶向和消除癌细胞，并通过分泌免疫调节细胞因子触发免疫反应，通常被定义为CD3-CD56+淋巴细胞 [34]。肿瘤浸润NK细胞可能与免疫治疗预后相关，Riaz等人发现，使用nivolumab治疗黑色素瘤患者时，肿瘤微环境中NK细胞和CD8+T细胞数量高的患者其疗效更好 [35]，这对于在NSCLC患者中探讨肿瘤浸润NK细胞与ICIs治疗疗效关系具有一定的指导意义。

5. MSI/MMR (微卫星不稳定/错配基因修复)

MS (微卫星)是基因组中以少数核苷酸为单位多次串联重复的序列，MSI是指MMR缺陷(dMMR)从而导致DNA复制时插入或缺失突变所引起MS长度的改变，MSI可分为高度微卫星不稳定(MSI-H)、低度微卫星不稳定(MSI-L)和微卫星稳定(MSS) [36]。MSI-H/dMMR肿瘤细胞具有更高的突变率，可能对免疫治疗更较强的反应，或许能作为免疫治疗疗效预测的又一生物标志物。MSI肿瘤通常具有高TMB，虽然TMB可能与患者使用ICIs治疗的疗效有关，但与MSI-H高相关性的高TMB是实体肿瘤患者评估ICIs疗效的另一个关键因素 [37]。

包括CheckMate 142、KEYNOTE177等多项研究均提示免疫检查点抑制剂治疗能够为MSI-H的患者带来更佳的生存获益 [38] [39]。在结直肠癌患者的新辅助免疫治疗中，MSI-H结直肠癌患者的pCR率也更高 [40]。但关于MSI的研究目前主要集中于消化道肿瘤，肺癌中尚无相关报道，MSI/MMR是否能作为NSCLC患者使用ICIs治疗的疗效预测标志物值得我们进一步地探讨。

6. 肠道微生物群

肠道微生物群与肿瘤有着密切的关系，肠道微生物群可以通过调节宿主免疫系统功能和提高抗肿瘤药物疗效起到抗肿瘤的作用，肠道微生物群失调则可通过诱导基因突变、影响机体免疫系统等促进肿瘤的发生发展 [41]。肠道微生物群可产生细胞因子激活效应T细胞，效应T细胞与肿瘤抗原结合可对肿瘤细胞产生杀伤作用。使用抗生素和质子泵抑制剂(proton pump inhibitors, PPI)可能使肠道微生物群失调，从而降低ICIs疗效降低 [42]。嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila, Akk)是人肠道的一种正常细菌，Lisa Derosa等人发现Akk+ (Akk丰度 ≥ 4.799%)患者使用ICIs有更高的ORR，且与患者性别、年龄、机体状态、抗生素的使用、PD-L1的表达无关 [43]。一种称为KCTC3357的双歧杆菌和抗PD-1联合使用可以使小鼠肠道中CD4+T细胞、CD8+T细胞、效应CD8+T细胞和NK细胞的数量明显增加 [44]。Tomita等人使用ICIs治疗NSCLC患者时，治疗中添加了益生菌丁酸梭菌(CBT)的患者PFS和OS更长 [45]。

以上研究说明肠道微生物群对肿瘤免疫疗法的疗效有着一定的预测价值，但我们需要进一步了解微生物和肿瘤之间复杂的双重作用，以及衡量抗生素的使用对肿瘤的治疗带来的影响，从而更加合理地使用抗生素和抗肿瘤药物。

7. 结语

随着我们对人体免疫系统的认识的越来越深刻，免疫治疗急速发展，肿瘤生物标志物也被发现，肿瘤的治疗已经进入了新的时代，但是到目前为止，我们尚未发现免疫检查点抑制剂治疗良好的预测生物标志物，未来，多种预测标志物的联合也许是探索方向。越来越多的免疫治疗疗效预测我们需要更加准确或联合多种标志物来判断免疫治疗的预后，筛选出适合免疫治疗的患者，才能达到肿瘤精准治疗的目标。对于肿瘤的免疫治疗，我们仍然任道而重远。

基金项目

陕西省重点研发计划资助项目(项目编号：2022SF-282)。

文章引用

张科宇,李索妮,郑 琪,孙尚莹,高芝兰,赵 征. 非小细胞肺癌免疫治疗疗效预测标志物研究进展
Research Progress in Prognostic Markers of Immunotherapy for Non-Small Cell Lung Cancer[J]. 临床医学进展, 2023, 13(01): 264-271. https://doi.org/10.12677/ACM.2023.131041

参考文献