Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2012, 2, 1-5 http://dx.doi.org/10.12677/hjbm.2012.21001 Published Online January 2012 (http://www.hanspub.org/journal/hjbm) Experimental Research on the Vitro Inactivation of HL60 Cells Based on CdTe and CdSe Quantum Dots Yulu He, Kangqiang Huang, Fei Jiang, Jian Wang, Jianwen Xiong* Laboratory of Quantum Information Technology, School of Physics and Telecommunication Engineering, South China Normal University, Guangzhou Email: heyulu198707@126.com, *jwxiong@scnu.edu.cn Received: Sep. 30th, 2011; revised: Nov. 6th, 2011; accepted: Nov. 9th, 2011. Abstract: Quantum dots used to destruct the cancer cells through the photocatalytic reaction has caused great attention in recent years. In the paper, thiol-capped CdTe and CdSe QDs were used to destruct the HL60 cells. The results showed that the best light irradiation dose of CdTe and CdSe were 15 J/cm2 and 18 J/cm2. The best concentration of additive QDs were all 2.0 µmol/L. The inactivation efficiency were 62.7% and 83.0% under the best destruction para- meters, respectively. Additionally, the destruction efficiency of CdSe is better than that of CdTe in the optimized condi- tions. Keywords: CdSe; CdTe; Quantum Dots (QDs); Photodynamic Therapy (PDT); CCK-8 基于 CdTe 和CdSe 量子点体外 PDT 灭活白血病 HL60 细胞实验研究 贺宇路,黄康强,姜 飞,王 健,熊建文* 华南师范大学物理与电信工程学院,量子信息技术重点实验室,广州 Email: heyulu198707@126.com, *jwxiong@scnu.edu.cn 收稿日期:2011年9月30 日;修回日期:2011 年11 月6日;录用日期:2011 年11 月9日 摘 要:近年来,随着光动力疗法基础研究的不断深入,量子点作为潜在的光敏剂对癌细胞的灭活效应引起了 人们的极大关注,实验利用羧基乙酸包覆的量子点 CdTe 和CdSe 进行了 QDs-PDT 体外灭活 HL60 细胞的实验 研究。实验结果表明:CdTe 和CdSe 的对 HL60 细胞灭活的最佳光照剂量分别为15 J/cm2和18 J/cm2,最佳作用 浓度均为2.0 µmol/L;在最佳作用参数下两者的灭活效率分别为62.7%,83.0%,基于 CdSe 的QDs-PDT灭活效 率优于 CdTe。 关键词:CdSe;CdTe;量子点(QDs);光动力疗法(PDT);CCK-8 1. 引言 光动力疗法(photo dynamic therapy,PDT)是借助 光敏剂进入患者体内后,动态浓集于生长异常的组织 (如肿瘤、鲜红斑痣及黄斑病变),后者在一定波长光 辐照下,因其所摄入光敏剂发生光动力敏化反应而产 生活性氧物质,导致生物大分子光氧化失活,并由此 造成细胞器损伤而破坏目标组织以达到治疗目的的 方法[1-3]。在光动力疗法中,由于肿瘤等在人体中的深 浅不一,使得传统光敏剂的应用受到限制,而量子点 由于其尺寸效应,使其吸收光谱能够被调节去匹配深 浅不同的肿瘤的需要[4,5]。量子点直接作为光敏剂或用 于能量转移提高传统光敏剂的光动力疗效已初见成 *通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 1 基于 CdTe和CdSe 量子点体外 PDT 灭活白血病 HL60 细胞实验研究 效[6,7]。 用于光动力疗法中的量子点必须具有亲水性,生 物相容性[8,9]。研究证明量子点外包覆一层羧基乙酸或 羧基丙酸,不仅可以使量子点具有水溶性,还可以在 生物细胞内产生活性氧[10,11],这将会提高量子点在光 动力疗法中的灭活效率。量子点CdTe 因此本文主要 利用巯基乙酸包覆的量子点 CdSe 和CdTe进行了 QDs-PDT体外灭活 HL60 细胞的实验研究。 2. 实验材料 羧基乙酸做外包覆的 CdSe 量子点(CdSe/HS- CH2-COOH,核半径为4.8 nm,包覆后约为 10 nm), 羧基乙酸做外包覆的CdTe 量子点(核半径4 nm,包覆 后约为 9 nm)。HL60(中山大学实验动物中心细胞库提 供),CCK-8 试剂(日本同仁化学),PDT 反应室(自行 设计,以大功率LED 作为光源),F-4500 荧光分光光 度仪(日本日立),DG5031 型酶联免疫检测仪(南京华 东电子),96 孔培养板,细胞计数板及其他常规器皿。 3. 实验方法 3.1. 细胞培养 HL60 细胞接种于装有1640 培养液的培养瓶中, 置于 CO2体积分数为 5%,空气湿度为 95%,环境温 度为 37℃的培养箱中培养。取对数生长期(即生命力 最旺盛时期)的细胞进行实验。 3.2. 细胞活性检测 采用与传统的细胞活性检测方法 MTT法相比, 操作方便、简洁、灵敏度高、重复性好的CCK-8(Cell Counting Kit-8)法[12,13]对细胞进行活性检测,降低实验 误差。 3.3. 光谱分析 量子点 CdTe 和CdSe 的吸收光谱如图 1所示,两 种量子点的吸收波长都集中在400~500 nm之间,而 且在这一波段,CdSe 量子点的吸收明显大于CdTe, 同时,为了避免近紫外光对细胞本身的损伤,实验中 采用中心波长在 450 nm的蓝光 LED 作为 PDT 实验光 源。自行设计的,发射波峰在450 nm 附近的蓝光 LED 光反应室,很好的满足了实验中对 PDT 光源单色性 好,光源面积大,光功率稳定,热效应变化不明显的 要求[14]。 4. 实验设计 4.1. 基于 CdTe 和CdSe 的QDs-PDT 疗法对 HL60 细胞灭活的最佳参数研究 在96孔培养板上根据实验内容规划实验孔(包括 调零孔、对照孔),同一实验条件设三个重复孔。取对 数生长期的 HL60 细胞接种于 96 孔培养板上设定的实 验孔,每孔接种 100 µl(调零孔除外),并加适量体积 的已配好的量子点溶液和培养液,确保每孔的总体积 为200 µl,调零孔中只含 200 µl 培养液。放入培养箱 中培养一定时间,需要 PDT 的实验孔在光反应室接受 光辐照,然后继续培养一定时间后在每个实验孔加 20 µl CCK-8 试剂,培养四小时后,用酶联免疫检测仪测 各孔 OD 值。 在实验中 HL60 细胞的终值浓度为1 × 105个/ml, 羧基乙酸修饰的量子点 CdTe 和CdSe 的终值浓度分别 各设置为五组:1 µmol/L、1.5 µmol/L、2.0 µmol/L、 2.5 µmol/L、3.0 µmol/L,辐照光功率为 5 mW/cm2,光 照剂量分别为12 J/cm2、15 J/cm2、18 J/cm2、21 J/cm2。 4.2. 最佳作用参数下 CdTe 和CdSe对HL60细 胞灭活效率的比较 对比最佳光照剂量参数(CdTe 为15 J/cm2,CdSe 为18 J/cm2)下,四种量子点浓度情况时(1.0 µmol/L, 1.5 µmol/L,2.0 µmol/L,2.5 µmol/L),量子点 CdTe和 Figure 1. Absorption spectra of thiol-capped CdTe and CdSe QDs 图1. 羧基乙酸修饰的量子点 CdTe 和CdSe 的吸收光谱 2 Copyright © 2012 Hanspub 基于 CdTe和CdSe 量子点体外 PDT 灭活白血病 HL60 细胞实验研究 Copyright © 2012 Hanspub 3 数据如下表(表1)。 CdSe 对HL60细胞的灭活效率。 灭活 HL60 细胞的效率用 Pe表示 对比量子点最佳作用浓度(CdTe 和CdSe 均为 2.0µmol/L)下,光照剂量为 12 J/cm2,15 J/cm2,18 J/cm2 和21 J/cm2时CdTe 和CdSe 的灭活效率。 1 R W OD Pe OD 其中,ODR表示光照后细胞的OD 值,ODW表示 不光照时的细胞OD 值。 4.3. 统计学处理 n = 3,数值采用均数 ± 标准差 XS 表示。 SPSS11.5 统计软件进行多样本均数两两比较的方差 分析。P < 0.05 为有统计学差异。 图2表明,在相同量子点浓度条件下,随着光照 剂量的增加,PDT效率越显著,但当光照剂量超过15 J/cm2,即光照时间为50 min时,PDT效率增加不明 显,考虑到光剂量太大对正常细胞的灭杀也会增加 [15],因 此15 J/cm2 (P < 0.05)是本实验的最佳光照剂量 参数。 5. 实验结果与分析 5.1. 基于 CdTe 和CdSe 的QDs-PDT 疗法体外 灭活 HL60 细胞的最佳参数 图3表明,在光照剂量相同放入条件下,随着 CdTe 浓度的增加,PDT 效应越显著,CdTe 浓度超过 2.0 µmol/L 时,由于量子点浓度接近饱和,PDT 效应 增加不明显,因此浓度为 2.0 µmol/L (P < 0.05)为本实 验的最佳量子点作用浓度。 5.1.1. 基于 CdTe 的QDs-PDT 疗法体外灭活HL60 细胞的最佳参数 利用 CCK-8法测量 HL60细胞在添加不同浓度的 量子点 CdTe 并光照不同时间后的 OD 值,测的实验 Table 1. The influence of CdTe concentration and light dosage to OD values of HL60 cells 表1. 不同 CdTe 浓度和不同光照剂量 PDT 对HL60 细胞 OD 值的影响 Light irradiation dose (J/cm2) Concentration (10–6 mol/L) 0 (control) 12 15 18 21 0 (control) 0.989 ± 0.031 0.725 ± 0.013 0.661 ± 0.011 0.603 ± 0.010 0.542 ± 0.015 1.0 0.977 ± 0.012 0.617 ± 0.011 0.563 ± 0.013 0.488 ± 0.014 0.457 ± 0.011 1.5 0.962 ± 0.016 0.537 ± 0.008 0.421 ± 0.015 0.397 ± 0.012 0.366 ± 0.008 2.0 0.906 ± 0.020 0.376 ± 0.012 0.338 ± 0.008 0.319 ± 0.010 0.305 ± 0.012 2.5 0.883 ± 0.013 0.357 ± 0.009 0.312 ± 0.007 0.301 ± 0.009 0.289 ± 0.015 Figure 3. The influence of CdTe concentration to CdTe-PDT efficiency Figure 2. The influence of light dosage to CdTe-PDT efficiency 图3. 不同浓度 CdTe作用下的 QDs-PDT 效率 图2. 不同光照剂量下量子点 CdTe 的PDT 效率 基于 CdTe和CdSe 量子点体外 PDT 灭活白血病 HL60 细胞实验研究 5.1.2. 基于CdSe 的QDs-PDT 疗法体外灭活HL60 细 胞的最佳参数 在相同的实验参数下,利用 CCK-8 法测量 HL60 细胞在添加不同浓度的量子点 CdSe并光照不同时间 后的 OD 值,测的实验数据如下表(表2): 同理,由图 4和5知,基于 CdSe 的QDs-PDT 灭 活HL60 细胞的最佳光照剂量参数为18 J/cm2 (P < 0.05);基于CdSe 的QDs-PDT灭活 HL60 细胞的最佳 量子点作用浓度为 2.0 µmol/L (P < 0.05)。 在最佳作用参数(CdTe:光照剂量 15 J/cm2,量 子 点浓度 2.0 µmol/L;CdSe:光照剂量 18 J/cm2,量子 点浓度 2.0 µmol/L)下,基于 CdTe 和CdSe 的QDs-PDT 对HL60 细胞的灭活效率分别为 62.7%和83.0%. 5.2. 最佳作用参数下 CdTe 和CdSe对HL60细 胞灭活效率的比较 图6表明,在最佳光照剂量参数(CdTe为15 J/cm2, CdSe 为18 J/cm2)下,四种量子点浓度情况 (1.0 µmol/L, 1.5 µmol/L,2.0 µmol/L,2.5 µmol/L)时,量子点 CdSe 的灭活效率均明显高于量子点CdTe 的灭活效率。 图7表明在量子点最佳作用浓度(CdTe 和CdSe 均为 2.0 µmol/L)下,在光照剂量为12 J/cm2和15 J/cm2 时,量子点CdTe 的灭活效率高于 CdSe 的灭活效率但 两者的 PDT 效率相对较低,不超过 65%。当光照剂 量为 18 J/cm2 和21 J/cm2时,CdSe 的灭活效率显著提 高,并且明显高于CdTe的灭活效率。 6. 结论 本文通过实验得出基于 CdTe 和CdSe 的体外灭活 HL60 细胞的最佳光照剂量分别为15 J/cm2和18 J/cm2;最佳作用浓度均为2.0 µmol/L。在量子点最佳 作用参数下,CdTe 和CdSe 对HL60 细胞的灭活效率 分别为 62.7%和83.0%。在最佳光照剂量参数下,四 种不同量子点浓度下,量子点 CdSe的灭活效率均高 于量子点CdTe 的灭活效率。量子点最佳作用浓度下, 光照剂量不同时,CdSe 的灭活效率也明显高于CdTe。 综上所述,量子点 CdSe 的QDs-PDT效率优于量子点 CdTe 。 Table 2. The influence of CdSe concentration and light dosage to OD values of HL60 cells 表2. 不同 CdSe 浓度和不同光照剂量 PDT 对HL60 细胞 OD 值的影响 Light irradiation dose (J/cm2) Concentration (10–6mol/L) 0 (control) 12 15 18 21 0 (control) 1.092 ± 0.031 0.897 ± 0.023 0.768 ± 0.021 0.695 ± 0.013 0.591 ± 0.011 1.0 1.017 ± 0.012 0.815 ± 0.018 0.701 ± 0.016 0.397 ± 0.014 0.373 ± 0.011 1.5 0.985 ± 0.016 0.783 ± 0.012 0.634 ± 0.011 0.277 ± 0.008 0.261 ± 0.015 2.0 0.886 ± 0.020 0.651 ± 0.011 0.453 ± 0.016 0.151 ± 0.012 0.128 ± 0.008 2.5 0.851 ± 0.015 0.515 ± 0.013 0.385 ± 0.012 0.137 ± 0.009 0.102 ± 0.007 Figure 4. The influence of light dosage to CdSe-PDT efficiency 图4. 不同光照剂量下量子点 CdSe 的PDT 效率 Figure 5. The influence of CdSe concentration to CdSe-PDT efficiency 图5. 不同浓度 CdSe 作用下的 QDs-PDT 效率 4 Copyright © 2012 Hanspub 基于 CdTe和CdSe 量子点体外 PDT 灭活白血病 HL60 细胞实验研究 Figure 6. The inactivation efficiency of CdTe and CdSe under the best light dosage 图6. 最佳光照剂量参数下 CdTe 和CdSe 量子点对 HL60 细胞灭活 效率的比较 Figure 7. The inactivation efficiency of CdTe and CdSe under the best QDs concentration 图7. 最佳作用浓度下 CdTe 和CdSe 量子点 PDT 效率的比较 量子点以其独特、无可比拟的物理化学特性在光 动力疗法中备受关注,其作为 PDT 的光敏剂也呈现出 良好的发展前景。但由于目前的研究主要集中在可行 性的实验验证层次上,而且大多数量子点中含有重金 属,其本身会对正常细胞产生一定的毒性[16],虽然通 过包裹可以减小量子点的毒性,但其毒性依然存在, 需要进一步的研究和评估,这也是量子点作为光敏剂 应用于未来临床所必须要解决的关键问题之一。 7. 致谢 本文受到国家自然科学基金项目(61072029); 广东省自然科学基金项目(10151063101000025);广 州市科技计划项目(2010Y1-C111)联合资助,作者在 这里表示感谢。 参考文献 (References) [1] J. Tyrrell, S. M. Campbell and A. Curnow. Monitoring the accu- mulation and dissipation of the photosensitizer protoporphyrin IX during standard dermatological methyl-aminolevulinate photo- dynamic therapy utilizing noninvasive fluorescence imaging and quantification. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, 2011, 1(8): 30-38. [2] C. P. Chang, D. J. Nagel and M. E. Zaghloul. Irradiance depen- dence of photobleaching of resorufin. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 2011, 2(217): 430-432. [3] J. S. Dysart, M. S. Patterson, T. J. 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