湖北中医药大学第一临床学院，湖北 武汉

收稿日期：2023年5月4日；录用日期：2023年6月21日；发布日期：2023年6月30日

摘要

目的：基于网络药理学研究四君子汤“异病同治”原发性肝癌与胃癌的通路及途径。方法：获得经方四君子汤活性成分，其通过TCMSP知识库，再利用Uniprot蛋白质元数据库转换所需的靶点基因。本文研究仅选用了四大数据库，其中数据库为TTD、GeneCards、DrugBank及OMIM，处理此四个数据库数据相互增补原发性肝癌(Primary liver cancer, PLC)和胃癌(Gastric cancer, GC)疾病关键靶向基因，再引用JVENN网站绘制韦恩图，得到处理后韦恩图具体数据，再通过Cytoscape 3.9.1软件工具构建“药物–活性成分–靶点–疾病”关系网络图。再进一步利用STRING数据库，输入数据中得到的关键靶向点，绘制蛋白质相互关系图(PPI)，再次使用Cytoscape 3.9.1软件中的扩展程序中的相关指标值(度值，degree；介数，Betweenness)，将PPI的核心靶点与靶向预测进行分析。最后就是进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，同样在DAVID数据库帮助下对上述处理后得到的数据分析。结果：本文研究中的经方经过数据重重筛选，治疗异病PLC与GC的有效成分和目标靶向点分别是114个和106个，而较相关的关键靶点经degree值排名前八有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、肿瘤抑制基因P53 (TP53)、血管内皮生长因子A (VEGFA)、胱天蛋白酶3 (CASP3)、肿瘤坏死因子(TNF)、核蛋白类癌基因(MYC)、前列腺素内过氧化物合酶2 (PTGS2)、白细胞介素-1β (IL1B)。在基因本体中生物功能的富集分析重点显示了基因表达正向调控方面上显著为高通路，同时也反映在药物反应及转录DNA模板正向调控的重要性信号通路。结论：本文基于中医理论与网络药理学的研究表明，经方四君子汤异病同治PLC、GC是多通路、多途径、多靶点的极为复杂过程，主要通过参与细胞的基因正向表达、转录DNA表达、药物反应、多种相关酶的调控等发挥治疗疾病的作用。

关键词

四君子汤，原发性肝癌，胃癌，网络药理学，异病同治，靶点，信号通路

Exploring the Mechanism of Sijunzi Decoction of “Treating Different Diseases with the Same Method” in Treating Primary Liver Cancer and Gastric Cancer Based on Network Pharmacology

Jinxiang Li

The First Clinical College, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan Hubei

Received: May 4^th, 2023; accepted: Jun. 21^st, 2023; published: Jun. 30^th, 2023

ABSTRACT

Objective: To study the Mechanism of Action of Sijunzi Decoction on “Same Treatment for Different Diseases” in Primary Liver Cancer and Gastric Cancer Based on Network Pharmacology. Method: We get the active ingredients of Sijunzi Decoction, use the TCMSP knowledge base and then use the Uniprot Protein Element database to convert the necessary target genes. This study selected only four major databases, including TTD, GeneCards, DrugBank and OMIM, which were processed to supplement the major target genomes of primary liver cancer (PLC) and stomach cancer (GC), and then used the JVENN website to draw Wayne maps. After processing specific data from the Wayne map, the software tool Cytoscape 3.9.1 was used to create a network diagram of “drug-active-target- disease. Next, we use the STRING database to enter the most important target points obtained from the data, create a Protein Interaction Chart (PPI) and analyze the most important PPI target points with target predictions again with the corresponding indicator values (degree, precipitation, median, Bedouin) in the Cytoscape 3.9.1 software extension. Finally, it includes gene concentration analysis (GO) and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), as well as data obtained through analysis and processing by the David database. Result: In this study, the menstrual diet was carefully validated against data. The active ingredients and targets for the treatment of heterogeneous PLC and GC were 114 and 106 respectively. The more relevant key targets were evaluated using the first eight degrees of serine/sulfate kinase (AKT1), namely the tumor suppressor gene P53 (TP53), Endothelial growth factor A (VEGFA), vesicular protease 3 (CASP3), tumour necrosis factor TNF, nucleic acid oncogen (MYC) and interleukin-1β (IL1B). Analysis of the concentration of biological functions in the genome shows that gene expression in positive regulation is significantly higher, which is also reflected in important signaling pathways that positively regulate drug response and DNA transcription patterns. Conclusion: Based on the theory of traditional Chinese medicine and research of network pharmacology, this article points out that PLC and GC are extremely complex processes with multiple pathways, channels and applications that are mainly involved in positive expression of cellular genes, transcription of DNA expression, and drug reactions. It regulates and controls various related enzymes to exert therapeutic effects on disease.

Keywords:Sijunzi Decoction, Primary Liver Cancer, Gastric Cancer, Network Pharmacology, Same Treatment for Different Diseases, Target Points, Signal Pathway

Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

原发性肝癌(Primary liver cancer, PLC)中肝细胞癌(HCC)是最高概率的(80%~90%)，其次是胆管癌(CCA)发病率(10%~15%)，HCC与CCA是在PLC中占比较为重要的，也是研究中的重点方向 [1] 。肝癌是慢性炎症反应所致坏死细胞，以及病毒感染，其中包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)，及代谢性肝癌等诸多不利原因下病因的疾病 [2] [3] 。而胃癌(Gastric cancer, GC)在癌症中发病率仍是全球第五，致死率第二，而幽门螺旋杆菌则是致病的主要因素 [4] 。原发性肝癌与胃癌在传统医学中都有相应记载，中医学上根据症状和体征辩证，属“肝癌病”、“肝积”、“黄疸”、“鼓胀”等范畴，其病因病机也是极为复杂，脏腑经络之间都互相牵连，可由肝生理功能出发辩证肝气郁结、肝脾两虚、气滞血瘀、肝胆湿热等 [5] 。胃癌则属中医范畴中的“噎嗝”、“积聚”、“胃脘痛”等，临床辩证可分为：肝胃不和、痰湿郁结、脾胃虚寒、胃阴不足等证型 [6] 。四君子汤属于中医经典方药，补气之基础，药物配伍之缓和，多甘温之性，医篇古文记“人受气于谷，谷入于胃，以传于肺，五脏六腑皆以受气”，调理脾胃之气，则肝脾条达，木土相合，五行相生转化运动得以运行。诸多学者对四君子颇有研究，如张艳梅 [7] 学者认为四君子汤对脾胃气虚证患者在临床治疗中有显著疗效，研究组(47例) SDS、SAS及复发率均低于对照组(观察指标P值均小于0.05)，对经方运用十分认可，其临床实用价值值得推广。李紫瑞 [8] 等则从疏肝健脾，补土荣木之法来研究肝癌的科学方法发展新的思维与方向。本文研究主要是通过药理学探讨经方四君子汤药物对PLC、GC的共同靶点以及关键通路作用的机制。

2. 方法

2.1. 化学成分的收集

运用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，检索词为经典医著《伤寒论》中四君子汤中的药物成分：白术、茯苓、甘草、人参。利用TCMSP药代动力学参数中的口服生物利用度(Oral bioavailability, OB ≥ 30%)以及类药性(Drug-likeness, DL ≥ 0.18)，收集限定后且符合有效数据，对收集的候选数据进行整理，再利用Uniprot蛋白质知识库(https://www.uniprot.org/)将数据转换，设置物种条件(homo sapiens)，数据用于后续分析。

2.2. PLC与GC相关靶点筛选

利用检索词“Primary liver cancer”、“PLC”、“primary carcinoma of liver”以及“Gastric cancer”，在TTD数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、DrugBank数据库(https://go.drugbank.com)、OMIM数据库(http://www.omim.org)四个数据库中的PLC与GC的潜在靶点，四个数据库相关靶点可相互补充，剔除重复值，最后整理得到PLC、GC的两个疾病靶点。

2.3. “药物–活性成分–靶点–疾病”相互作用网络构建与分析

整理上述2.1、2.2步骤得到数据，利用jvenn网站(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html)绘制四君子汤药物活性成分靶点与PLC、GC疾病靶点的韦恩图，即可得到四君子汤药物活性成分靶点和PLC、GC疾病靶点的交集结果，在进行整体数据合并整理后的文件导入Cytoscape 3.9.1软件，创建并可视化处理，得到四君子汤与PLC、GC“同病异治”的网络关系图。应用该平台的网络分析插件模块进行网络分析。

2.4. 四君子汤与PLC与GC相关靶点蛋白质相互作用(PPI)网络构建

STRING是目前常用的蛋白质–蛋白质相互作用的数据库，收录了多种途径的数据，并利用多种方法显示蛋白质之间的相互作用。将“药物–疾病”交集靶点导入STRING数据库，设置限定物种(Homo sapiens)，相关设置保持原有，得到四君子汤作用于PLC、GC的PPI网络。

导出的文件(string_interactions_short.tsv)导入Cytoscape 3.9.1软件中，运用网络分析中扩展程序功能，进行数据分析，得出“节点度值分布”“介数中心性”。度值(Degree)为节点与余节点相互连接的条数，客观显示出节点与节点相互作用，即数目越高值越大也表明越重要；而介数(Betweenness)是关系图中所有捷径节点与此节点路径的数值占比捷径总值的比数，即节点经过捷径路径数越多，Betweenness越大。Degree和Betweenness是数据化图一个节点在关系网中的重要拓扑参数，其重要性转为二者值越大越重要，另一层次关系网络图分析可表明二者是对网络药理研究预测靶点的方向，也是药物在作用机制中的重要观察参数。

2.5. 药物活性成分-PLC、GC疾病靶点GO功能与KEGG富集及通路分析

使用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)进行药物–疾病共同靶点蛋白的GO功能注释与富集分析。设置条件筛选其中重要数据，生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)、KEGG通路等信息。对得到输出的数据整理输入微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn)，对整体数据按照P值大小升序排序。基因信号通路则借助KEGG网站(https://www.kegg.jp)构建靶点蛋白质信号通路。

3. 结果

3.1. 四君子汤中候选化学成分和潜在靶点信息

通过TCMSP平台，检索出四君子汤化学成分，根据限定条件筛选并剔除重复值及无对应靶点的有效活性成分，最后收集四君子汤有效成分114种化学成分，其中白术4种、茯苓6种、人参17种、甘草88种，其中人参与甘草共同1个成分(山奈酚(kaempferol))，将这114种药物成分的目标靶点导入Uniprot获取相对应的基因名称，得到2037个有效目标靶点，剔除重复，最后整理共有231个潜在的靶点蛋白。四君子汤各药物化学化学活性可见表1。

表1. 四君子汤的活性成分

3.2. PLC、GC的相关靶点信息

分别通过TTD数据库、GeneCards数据库、DrugBank数据库和OMIM数据库四个数据库获取PLC、GC相关靶点信息，取四个数据库数据信息的并集，最后整理得到PLC有3680个和GC有1590个相关靶点。

3.3. “药物–活性成分–靶点–疾病”相互作用网络分析

将收集到的药物活性靶点蛋白与PLC、GC疾病靶点制作Venn图(图1)。可知四君子汤与PLC交集157个靶点与GC交集106个靶点，PLC与GC交集1495个相关靶点，三者交集106个共同靶点。导出数据应用至Cytoscape 3.9.1软件构建“药物–活性成分–靶点–疾病”相互作用网络图(图2)，最终得到217个节点和1451条边，根据节点度(degree)值大小排序1，值越高显示靶点核心成分起到关键作用概率越大，得到degree值前六位靶点为(最后两位为并列)：前列腺素内过氧化物合酶2 (PTGS2)、雄激素受体(AR)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、一氧化氮合酶2 (NOS2)、糖原合成酶激酶-3β (GSK3B)、细胞周期蛋白依赖性激酶2 (CDK2)可分别对应多种有效成分。

图1. 药物活性靶点蛋白与PLC、GC疾病靶点Venn图

图2. 药物–活性成分–靶点–疾病相互作用网络图

3.4. PPI网络构建与核心靶点分析

将“药物–疾病”靶点添加至STRING 11.5数据库中可得蛋白质作用图(图3)，该网络中共有106个节点，1615条边，介数83.03，平均节点度值30.47，路径是节点(即蛋白)与节点之间的关系网络，图中注释路径越复杂则联系越紧密，degree值越大蛋白点越大颜色越深(绿渐变红为深)。本文数据化PPI关系图(图4)利用前期得到数据导入Cytoscape 3.9.1软件绘制。如图显示，本文受限截取degree值前八名，分别为：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、肿瘤抑制基因P53 (TP53)、血管内皮生长因子A (VEGFA)、胱天蛋白酶3 (CASP3)、肿瘤坏死因子(TNF)、核蛋白类癌基因(MYC)、前列腺素内过氧化物合酶2 (PTGS2)、白细胞介素-1β (IL1B)，其中检索前数据有效活性成分主要分析有：山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)、人参皂苷Rh2 (ginsenoside rh2)。

图3. 蛋白质作用图

3.5. 四君子汤治疗靶点的GO功能与KEGG富集分析

从DAVID数据库中截取GO功能富集BP条目671条，CC条目54条，MF条目120条，三者P值由小到大排序取前十名，绘制GO功能可视化分析图(图5)以及制作BP、CC、MF数据的前三名表格(表2)，分析可知四君子汤对疾病在基因表达的正向调控、转录DNA模板化的正向调节以及药物反应上有着积极作用，对于细胞外质和胞内线粒体有一定关联，在大分子调控方面对结合酶、蛋白结合及蛋白质二聚活性有关联性。

KEGG通路富集分析获取，根据P值升序排序选取前20位进行绘制可视图(图6)。结果分析四君子汤中中药对机体作用是整体的，通过多通路、多途径、多靶点发挥作用，图中可视数据发现，可预测性最大是癌症信号通路，其次分别排列为前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、动脉粥样硬化、小细胞肺癌、PI3K-AKT信号通路等共20条较为密集的通路，通过图中可分析出本文研究的药物中治疗PLC、GC是多种通路交集复杂的生物体内代谢的过程。具体KREGG作用通路结果图(图7)。

图4. PPI网络和核心靶蛋白

图5. GO富集分析

图6. KEGG信号通路分析

图7. PI3K-AKT信号通路

表2. BP、CC、MF数据

4. 讨论

在国家大力发展中医药事业中，中医优势逐渐显现突出。临床上使用中医药干预治疗PLC、GC都用显著临床疗效。如郑蔚婵 [9] 等用中医治疗下，可减轻患者疼痛、药物毒副作用以及经济负担，延长患者生存及生活质量。本文研究是基于网络药理学的方法，借助官方TTD、GeneCards、TCMSP及OMIM数据库在Cytoscape 3.9.1软件对四君子汤异病同治原发性肝癌和胃癌的作用机制进行探讨，最后在蛋白质相互作用关系网络图中分析得出，最关键价值靶点取前8位为AKT1、TP53、VEGFA、CASP3、TNF、MYC、PTGS2、IL1B。在相关研究中发现，MAPK信号通路是肝癌细胞在自身免疫中，产生免疫反应起到关键用 [10] ，因此在临床中是药物作用的观察研究方向，在本研究中TNF是研究方药中重要靶点，又是受此信号通路的作用，应该值得关注。同研究下 [11] [12] ，PI3K-AKT对相关胃癌患者具有一定的判别作用，而TP53对总生存期及复发可能有预测重要性，关乎患者是否为高危的因素，对预测临床预后有指导意义。相关研究发现 [13] ，VEGFA的基因和蛋白表达是影响肝癌细胞系中某些物质，从而受到调控，其调控基因为miRNA-874、miRNA-637影响，而VEGFA可启动RASRAF-MEK-ERK-MAPK通路因子，也有待进一步观察，也有研究显示 [14] [15] ，抑制CASP3可对肝癌细胞产生损伤和转移的作用。而研究中四君子汤对此信号通路是关键的，因此对于研究“异病同治”是具有方向指导，同时也值得在临床中运用。有学者研究认为 [16] ，转录因子MYC抑制肿瘤向恶性表达，对肿瘤细胞代谢能够影响并控制，进而达到对抑制疾病进一步扩散。相关研究支持下 [17] ，对体内息肉风险控制PTGS2可利用一种启动因子降低癌变风险。在观察研究中 [18] ，IL1B对癌症患者预后有明显的负向作用，因此在治疗过程中抑制其浓度，对疗效有参考意义，对未来新型治疗方向有一定的指向性。

经过KEGG通路分析，分析表明四君子汤的靶点成分与PLC、GC的相关通路关系密切，其中癌症信号、前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、动脉粥样硬化、小细胞肺癌、PI3K-AKT信号通路都是相关作用的表达。本文研究中利用PI3K-AKT信号通路，此通路互相联系包含GF、PTK、ECM、PTEN、Raf-1、GSK3、Casp9、Bcl-2、NF-κB、P53、Myc等多达22种通路信号相关。其中PTEN是双磷酸酶其中一种，有蛋白质作用和脂质磷酸酶活性，对癌症细胞代谢和生长具有调节作用 [19] 。Davis RK一项具有展望的研究对破坏蛋白作用的小分子，Raf-1相关通路提供了很大希望，对临床在抗癌治疗中有了理想选择 [20] 。大量相关的研究表明，GSK3通过降解蛋白质抑制或激活细胞生长，GSK3可以影响其信号通路AMPK、mTOR和Wnt的致瘤性产物，GSK3对部分癌症有发挥代谢作用，因此GSK3抑制癌有帮助作用 [21] [22] 。Bcl-2是化疗药物研究发展的重要靶点方向，Ebrahim [23] 团队对Bcl-2基因沉默DNA的方法来阻断其表达，达到对癌细胞的作用。有研究发现，免疫反应中NF-κB基因产物可对肿瘤表达和发展进行作用，因此该基因可能对癌症预后与肿瘤标记物有重要参考 [24] 。基于P53基因容易发生突变，改善其突变的机制，靶向突变型可重新激活为野生型，从而作为新的治疗策略 [25] 。研究Myc基因转录、翻译抑制中，阻断其表达出致死基因，此基因与其结合伴侣基因或通过替代方式都有许多深入研究，因此Myc基因在癌症细胞中有着核心地位 [26] [27] 。本文研究四君子汤中同治PLC、GC等进展或转移的治疗上也是密切相关，相关研究的文献相对较多，对四君子汤在临床实践中用很好的参考作用。

本文应用网络药理学研究的相关方法，基于中医肝胃(脾)同治理论对四君子汤异病同治PLC、GC展开整体研究，在网络药理基础数据库中探讨此方组的药物作用机制，为往后四君子汤在临床中是如何通过哪些关键基因以及药物的活性成分提供了科学依据。而本文主要研究发现是四君子汤是通过多中癌症通路及本文述的关键靶点的表达，其中调控癌症信号通路较本文突出等多途径、多通路来达到治疗PLC、GC的效果。同时，此次研究也反应了中医药的方组是在多方面作用、多靶点作用下治疗疾病的特点，本文研究为此多提供了另一种新思路。因为本文研究是对此经方作用机制进行预测，在中医理论支持下，严谨对待研究结果，暂未有实验或临床数据支持，仍需众多数据验证如动物研究，细胞研究等，另外也是对药物观察指标参数设置限定，本文研究中《伤寒论》中四君子汤治疗PLC、GC的作用机制，需要未来研究中更多的投入来更加明确经方在治疗疾病的重要性。

文章引用

李锦湘. 基于网络药理学探讨四君子汤“异病同治”原发性肝癌与胃癌的作用机制
Exploring the Mechanism of Sijunzi Decoction of “Treating Different Diseases with the Same Method” in Treating Primary Liver Cancer and Gastric Cancer Based on Network Pharmacology[J]. 中医学, 2023, 12(06): 1496-1510. https://doi.org/10.12677/TCM.2023.126223

参考文献