¹浙江科技学院，浙江 杭州

²浙江佐力药业股份有限公司，浙江 湖州

收稿日期：2022年8月5日；录用日期：2022年9月2日；发布日期：2022年9月13日

摘要

阿尔兹海默症对患者的正常生活及家庭造成严重影响，已经成为神经医学亟需解决的难题。本文运用网络药理学探究乌灵菌粉抗阿尔兹海默症的作用机制。数据库筛选阿尔茨海默症相关治疗靶点及乌灵菌粉关键活性成分，获取交集靶点，软件构建交集靶点蛋白相互作用网络，挖掘互作网络中的核心靶点，最终获得乌灵菌粉抗阿尔兹海默症的潜在信号通路。网络药理学结果表明，乌灵菌粉可能作用于ACE、HSD17B1、NOS2和BACE1靶点调控甾类激素生物合成信号通路，发挥抗阿尔兹海默症作用。

关键词

乌灵菌粉，阿尔兹海默症，网络药理学，信号通路

Study on the Mechanism of Action of Wuling against Alzheimer’s Disease Based on Network Pharmacology

Juan Sun^1,2, Jian Chen², Guofu Feng², Yao Yao²

¹Zhejiang University of Science & Technology, Hangzhou Zhejiang

²Zhejiang Jolly Pharmaceutical Co., Ltd., Huzhou Zhejiang

Received: Aug. 5^th, 2022; accepted: Sep. 2^nd, 2022; published: Sep. 13^th, 2022

ABSTRACT

Alzheimer’s disease has a serious impact on the normal life of patients and their families, which has become an urgent problem to be solved in neuromedicine. In this paper, network pharmacology was used to explore the action mechanism of Wuling against Alzheimer’s disease. The database was used to screen the Alzheimer’s disease-related therapeutic targets and the key active ingredients of Wuling, and the intersection targets were obtained. Then, the protein interaction network of intersection targets was constructed, and the core targets in the interaction network were excavated, and the potential signaling pathway of Wuling powder against Alzheimer’s disease was finally obtained. The results of network pharmacology showed that Wuling may act on ACE, HSD17B1, NOS2 and BACE1 targets to regulate steroid hormone biosynthesis signaling pathway and play an anti-Alzheimer’s effect.

Keywords:Wuling, Alzheimer’s Disease, Network Pharmacology, Signaling Pathway

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

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1. 引言

阿尔茨海默症(Alzheimer’s diease, AD)，又称老年痴呆，是慢性的中枢神经系统退行性疾病 [1] [2]，多发于老年和老年前期，主要临床表现为脑萎缩、认知能力减退、记忆力下降、生活不能自理，最后死亡 [3]。随着老龄化社会的发展，阿尔兹海默症已经成为除心血管疾病、肿瘤之外的最严重疾病和死亡原因，对患者的正常生活及家庭造成严重影响，已经成为神经医学亟需解决的难题。

临床上对阿尔兹海默症的治疗仍未发现特效药 [4] [5]。乌灵胶囊属于国家一类新药，是一种纯中药制剂，在临床上广泛用于焦虑、抑郁、神经衰弱、帕金森病等的治疗 [6] [7] [8]。除此之外，乌灵胶囊也能明显改善各种记忆障碍，如记忆获得、记忆巩固、记忆再现缺失等，具有益智健脑功能 [9] [10]。然而目前为止乌灵菌粉治疗阿尔兹海默症的作用机制尚不明确。

网络药理学融合了生物信息学和药理学的方法，通过数据整合与计算分析，可系统性地阐明中药及化合物与诸多疾病的相互关系，探究药物作用机制 [11] [12] [13]。因此，本研究拟采用网络药理学预测、细胞实验验证乌灵菌粉治疗阿尔兹海默症的作用靶点及可能机制，为乌灵胶囊的应用提供一定理论支持。

2. 实验数据库及软件

中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP，化学绘图工具ChemBioDraw Ultra 14.0，化合物结构数据库Pubchem，小分子药物靶点预测在线平台SwissTargetPrediction，人类在线孟德尔遗传数据库OMIM，DrugBank数据库，蛋白质数据库Uniprot，RSCB PDB数据库，在线venn图绘制网站，生物信息注释数据库Metascape，计算机辅助药物设计软件Discovery Studio 2019，软件Cytoscape 3.7.1。

3. 网络药理学方法

3.1. 乌灵菌粉主要活性成分获取

采用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库，以“OB > 30%和DL ≥ 0.18”筛选乌灵菌粉的主要成分。基于TCMSP数据库筛选所得数据，同时查阅相关文献进行补充，最终确定乌灵菌粉活性成分。随后，使用3D Viewer建立所有化合物的3D结构，并保存为mol2文件格式，用于目标预测。

3.2. 乌灵菌粉主要活性成分靶点获取

从数据库中确定的乌灵菌粉活性成分，首先使用TCMSP数据库，根据特征信息及理化参数，获取相应靶点；然后利用PubChem数据库获得这些活性成分的SMILES文件，将SMILES文件导入SwissTargetPrediction网站，进行靶点预测。TCNSP数据库及STP数据库获得的所有靶点取并集，即为乌灵菌粉主要活性成分的靶点。

3.3. 阿尔兹海默症AD相关靶点收集

首先，利用关键词“Alzheimer”从OMIM数据库和DrugBank数据库中筛选阿尔茨海默症已知的治疗靶点。其次，将这些已知的阿尔茨海默症治疗靶点的基因名称导入Uniport数据库，寻找“Homo sapiens”蛋白。然后从RCSB PDB数据库中下载这些蛋白的3D结构。利用这四个数据库获得潜在的已知人源阿尔茨海默症靶蛋白。

3.4. 药物与疾病共同靶点筛选及互做网络构建

使用Venn图在线网站对AD靶点和活性成分靶点取交集，获取药物与疾病的共同靶点，绘制Venn图，交集基因即代表乌灵菌粉治疗炎症的潜在作用靶点。对筛选的活性化合物和AD预测靶点和进行统一的标准化命名(基因名)。将筛选的AD靶蛋白导入Cytoscape 3.7.1软件，获得化合物–靶点图网络。

3.5. GO和KEGG富集分析

将筛选得到的靶蛋白输入Metascape数据库进行GO基因生物过程富集和KEGG信号通路富集。

3.6. 分子对接

我们将乌灵菌粉的主要活性成分分别与高频靶蛋白进行模拟对接。首先把从RCSB PDB数据库中下载这些蛋白的3D结构导入Discovery Studio软件，去除原始配体，去除水、添加氢，优化和填充氨基酸。然后把保存为.mol2格式的活性成分结构导入软件，能量最小化。最后，选取CDocker板块进行模拟对接，计算结合能。

4. 结果

4.1. 乌灵菌粉主要活性成分

筛选获得10种乌灵菌粉主要活性成分，如表1所示。

表1. 乌灵菌粉主要活性成分

4.2. 乌灵菌粉主要活性成分靶点获取

利用TCMSP数据库和SwissTargetPrediction数据库对乌灵菌粉10种主要成分进行靶点预测，获得潜在靶点图1所示。

图1. 乌灵菌粉主要成分对应的靶点

4.3. AD潜在靶点获取

筛选并得到66个潜在的已知人源阿尔茨海默症靶蛋白，如图2所示。

4.4. 共同靶点获取及PPI网络构建

通过匹配66个药物靶点和399个活性化合物对应的靶点，筛选出32个共同靶点。这32个共同靶点是乌灵菌粉抗阿尔茨海默症的潜在靶点。将32个靶点导入STRING数据库，得到PPI网络，如图3所示。通过观察化合物与靶蛋白之间的相互作用关系我们发现，化合物(A1、A3、A4、A5、A7、A8、A9和A10)对高频靶蛋白ACE、HSD17B1、NOS2和BACE1均具有明显的作用。

图2. 潜在的AD靶点

图3. 乌灵活性成分–潜在AD作用靶点相互作用图

4.5. KEGG富集分析结果

KEGG信号通路富集如图4所示，分析结果表明，乌灵菌粉治疗AD的靶点主要富集在12条信号通路上。主要涉及甾类激素生物合成(Steroid hormone biosynthesis)、阿尔兹海默症(Alzheimer disease)、钙离子(Calcium signaling pathway)等信号通路。甾类激素生物合成信号通路富集靶点最多，说明该信号通路与乌灵菌粉抗AD作用较为密切，因此后续实验选择甾类激素生物合成信号通路进行验证探讨。

图4. 乌灵活性成分潜在AD作用靶点的KEGG分析

4.6. GO富集分析结果

GO基因生物过程富集如图5所示，具有生物学过程20条，细胞成分9条，分子功能9条。BP主要涉及细胞对氮化合物的反应、对氧气水平的反应、cAMP的分解过程等；CC主要涉及细胞质的核周区域、膜筏、树突等；MF主要涉及3'，5'环腺苷酸磷酸二酯酶活性、类固醇脱氢酶活性、氧化还原酶活性等。

图5. GO基因生物过程富集

4.7. 分子对接结果

使用Discovery Studio 2019软件对乌灵菌粉十种主要活性成分及高频靶蛋白ACE、HSD17B1、NOS2和BACE1分别进行对接，获得结合能，如表2所示。

表2. 10种化合物和4种AD蛋白的对接打分

从表2可以看出，化合物A9和A10具有较好的广谱抗AD活性，我们以A10为例，进一步分析了其对接作用力，如图6所示。

图6. 化合物A10与四种AD相关蛋白的对接模拟图

从图6我们可以看出，化合物A10与这四种关键AD蛋白具有很好的相互作用模式。化合物A10喹啉骨架上的氧原子可以与活性位点氨基酸Gln259，Tyr498，Leu22，Thr203，Thr231，Thr329形成氢键相互作用力；喹啉骨架上的氢原子可以与活性位点氨基酸His361，Glu377，Leu463，Leu464，Asp228形成氢键相互作用力；苯环结构上的羟基与活性位点氨基酸Ser333，Ala334，Gln165，Cys200，Gly202形成氢键作用力。此外，化合物A10与活性位点氨基酸还具有Pi-Pi或Pi-Cation相互作用力。这些作用力进一步的表明化合物A10具有较好的抗AD活性，即乌灵菌粉具有很好的抗AD活性。

5. 结论

本文基于网络药理学的方法对乌灵菌粉所含有的化合物进行了抗AD活性筛选，靶点分析和相关靶点通路预测，筛选得到10个活性物质和32个潜在的抗AD靶点蛋白以及相关靶蛋白信号通路。结果表明乌灵菌粉具有抗阿尔兹海默症的功效，可能是通过ACE、HSD17B1、NOS2和BACE1靶蛋白调控甾类激素生物合成信号通路。

文章引用

孙 娟,陈 建,冯国富,姚 瑶. 基于网络药理学探讨乌灵菌粉抗阿尔兹海默症的作用机制
Study on the Mechanism of Action of Wuling against Alzheimer’s Disease Based on Network Pharmacology[J]. 药物资讯, 2022, 11(05): 394-401. https://doi.org/10.12677/PI.2022.115051

参考文献