刘芳^1,2,3，李贵才^1,2，丁宗梅⁴，秦凯⁵，陆松华^5*

¹南通大学，江苏省神经再生教育部重点实验室，江苏 南通

²南通大学，神经再生协同创新中心，江苏 南通

³南通大学，医学院，江苏 南通

⁴苏北人民医院，病理科，江苏 扬州

⁵南通大学附属海安医院，胸外科，江苏 海安

收稿日期：2021年7月16日；录用日期：2021年8月26日；发布日期：2021年9月3日

摘要

RBMX (也称为hnRNP G)是hnRNP家族的成员，最早被鉴定为表观分子量为43 kDa的核蛋白。本研究目的主要是检验RBMX在ESCC中是否是肿瘤抑制因子的假设。对食管鳞状细胞癌组织进行免疫组织化学和蛋白质印迹分析。采用Kaplan-Meier法来分析ESCC患者的生存率。通过构建RBMX的过表达质粒，研究了RBMX在TE1食管鳞状细胞癌细胞系增殖中的作用。通过CCK-8和流式细胞术测定RBMX对增殖和凋亡的调节。免疫组化分析显示RBMX表达与Ki67呈负相关。生存分析显示RBMX表达与总体生存率显著相关(P < 0.001)。RBMX在TE1细胞中的过表达可导致CyclinD1 (细胞周期蛋白D1)、CDK4和p27水平降低和细胞增殖能力的下降。此外，RBMX的过表达可以诱导TE1细胞凋亡。这些发现表明RBMX参与了食管鳞状细胞癌的增殖，并且RBMX表达水平的升高可能表示食管鳞状细胞癌患者的良好预后。

关键词

食管鳞状细胞癌，RBMX，细胞增殖，细胞凋亡

Study on the Correlation of RBMX in Esophageal Squamous Cell Carcinoma

—Effects of RBMX on the Proliferation and Apoptosis of Esophageal Squamous Cell Carcinoma

Fang Liu^1,2,3, Guicai Li^1,2, Zongmei Ding⁴, Kai Qin⁵, Songhua Lu^5*

¹Key Laboratory of Neuroregeneration of Jiangsu and Ministry of Education, Nantong University, Nantong Jiangsu

²Co-Innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University, Nantong Jiangsu

³School of Medicine, Nantong University, Nantong Jiangsu

⁴Department of Pathology, Northern Jiangsu People’s Hospital; Yangzhou Jiangsu

⁵Department of Thoracic Surgery, The Affiliated Hai’an Hospital of Nantong University, Hai’an Jiangsu

Received: Jul. 16^th, 2021; accepted: Aug. 26^th, 2021; published: Sep. 3^rd, 2021

ABSTRACT

RBMX (also known as hnRNP G), is a member of hnRNP family and was first identified as a nuclear protein with an apparent molecular weight of 43 kDa. The current study was designed to test the hypothesis that RBMX is a tumor suppressor. Immunohistochemical and western blot analyses were performed in esophageal squamous cell carcinoma tissues. Survival analyses were performed by using the Kaplan-Meier method. The role of RBMX in proliferation was studied in esophageal squamous cell carcinoma cell lines of TE1 by constructing the RBMX overexpression plasmid. The regulation of RBMX on proliferation and apoptosis was determined by Cell Counting Kit-8 assays and Flow Cytometry. Immunohistochemical analysis showed that RBMX expression was negatively associated with Ki67. Survival analysis revealed that RBMX expression was significantly associated with overall survival (P < 0.001). Over-expression of RBMX in TE1 cells resulted in decreased CyclinD1, CDK4 and p27 levels and the capability for proliferation. In addition, over-expression of RBMX induces the Apoptosis of TE1 cells. These findings suggest that RBMX is involved in the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma, and that elevated levels of RBMX expression may indicate a good prognosis for patients with esophageal squamous cell carcinoma.

Keywords:Esophageal Squamous Cell Carcinoma, RBMX, Cell Proliferation, Cell Apoptosis

Copyright © 2021 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

食管癌是世界上第八大常见癌症，也是第六大癌症死亡原因 [1]。食管鳞状细胞癌(ESCC)是主要的组织学亚型，占所有食管癌病例的95%以上 [2]。由于预后不良和高死亡率，ESCC被认为是最具侵袭性的恶性肿瘤之一 [3]。ESCC病患者通常表现为局部晚期，这对于传统的治疗方法来说是难以治愈的 [4]。食管癌的研究取得了许多突破，手术仍然是这种恶性肿瘤的最佳治疗选择 [5]。虽然食管癌的临床诊断和治疗技术在不断更新进步 [6] [7]，但ESCC病患者的预后仍然很差，5年生存率仅为15%至25% [8]。因此，生物标志物的鉴定和食管癌相关分子机制的研究对于改善ESCC患者的预后非常重要，有助于我们对食管癌发病机制的理解。

RNA结合蛋白(RBPs)似乎在基因表达调控中起着重要作用，已知其生物学功能是参与mRNA前剪接和转录后调控机制 [9]。RBMX (又称hnRNP G)是hnRNP家族的成员，最早被鉴定为表观分子量为43 kDa的核蛋白 [10] [11]。RBMX被鉴定为Y染色体链基因RBMY的附属同源物，其负责精子发生 [11] [12]，并与肝癌的进展有关 [13]。它在几乎所有器官中的表达无处不在，表明RBMX在各种细胞的过程中具有基本功能。据报道，RBMX是人类口腔鳞状细胞癌中的肿瘤抑制剂 [14]，部分通过增强已知的肿瘤抑制剂硫多辛相互作用蛋白基因来诱导人癌细胞的肿瘤抑制活性 [15]。无处不在的RBM蛋白已被鉴定为一个新的RNA结合凋亡调节剂家族 [16]。在乳腺癌中，所有X染色体RBM基因的表达与凋亡Bax基因的表达显著相关 [17]。此外，它还发现乳腺癌中RBMX和CD105，血管内皮生长因子呈显著负相关 [18]。

2. 材料与方法

2.1. 患者和组织样本

本实验选用食管鳞状细胞癌石蜡标本87例购买自上海芯超生物科技有限公司，为2009.1至2010.12期间手术切除的标本，随访期4.6~6.5年，病理诊断结果确定，有临床相关完整的病理相关资料。蛋白的提取的新鲜食管鳞状细胞癌癌组织与此组织相关癌旁组织标本6例，均由南通大学附属医院提供，体内切除0.5 h内转移入低温冰箱(−80℃)存储。患者的主要临床和病理特征，包括年龄、性别、肿瘤分级、转移、肿瘤大小和浸润情况，见表1。标本根据国际抗癌联盟的TNM分类系统进行分类。患者以男性居多，占60.92%。肿瘤分为“良好”(n = 23)、“中度”(n = 32)或“差”(n = 32)分化。随访时间为5年，范围为1~56个月(中位数 = 37个月)。所有87名患者均获得知情同意。

表1. 87例ESCC标本临床病理参数，RBMX和KI67之间的表达

NOTE: Statistical analyses were performed by the Pearson χ2 test. *P < 0.05 was considered significant.

2.2. 细胞培养

人ESCC细胞系TE-1购自中国医学科学院(上海，中国)。细胞在补充有10%胎牛血清的RPMI 1640中于37℃在含有5% CO₂的湿化培养箱中培养。

2.3. 蛋白质印迹分析

组织或细胞在冷的RIPA缓冲液中裂解(Beyotime Biotechnology, China)。使用布拉德福蛋白质测定试剂盒((Bio-Rad, Hercules, CA, USA)测定蛋白质浓度。将等量的蛋白质加样在10%的SDS-PAGE上。然后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。然后将膜封闭在5%的无脂牛奶中，随后在4℃下与针对RBMX、PCNA、Cyclin D1、CDK4、p27、p53、Casase-8、Bax、Bcl2和β-actin的一抗一起孵育过夜(Cell Signaling Technology, USA)。用PBST洗涤三次后，将膜与合适的二抗一起孵育。使用增强化学发光试剂检测蛋白质(Beyotime Biotechnology, China)。使用图像软件(ImageJ)测量蛋白质密度。

2.4. CCK-8测定

使用CCK-8 (cell counting Kit-8)测定法测定细胞增殖。简而言之，细胞以2 × 10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板上，并在37℃和5% CO₂下培养箱过夜。在指定的时间向每个孔中加入CCK-8试剂(Beyotime Biotechnology)，细胞进一步培养4小时。使用微孔板读数器读取490纳米处的吸光度。

2.5. 免疫组织化学

将组织切片(1 µm)切割，置于APES预处理的载玻片上，脱蜡，通过分级酒精再水合，并在3%过氧化氢中淬灭。抗原回收通过在10 mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中以高功率(750瓦)微波加热进行，每循环5分钟。冷却至室温下用正常血清封闭2 h后，切片与抗人RBMX及Ki-67兔多克隆抗体(稀释1:150；美国Abcam)。为评估RBMX及Ki-67，随机选择了五个高倍镜视野。每场计数超过500个细胞。通过阳性染色肿瘤细胞的百分比和染色强度来确定两个观察者。RBMX及Ki-67阳性百分比评分如下：0 (5%阳性肿瘤细胞)；1 (5%~30%阳性肿瘤细胞)；2 (30%~60%阳性肿瘤细胞)；3 (>60%阳性肿瘤细胞)。染色强度分级如下：0 (阴性)、1 (弱)、2 (中等)和3 (强)。免疫染色分数计算为阳性分数4染色强度分数的百分比，范围从0分到9分。0分被认为是负数；1~3分被认为是弱表达；4~6分被认为是中等表达；7~9分被认为是强表达。对于统计分析，0~3被视为低表达组，而7~9被视为过表达组。

2.6. 质粒构建和转染

购自GENECHEM (中国上海)合成的RBMX的过表达质粒，cDNA靶向序列：RBMX，正义链 = 5-GAGGA tccccgggtaccgcgccacca tggcggccgacggc-3和 反义链 = 5-TCACCA tggtggcgaccgggctgacactaactgagcca-3；和阴性对照(NC)， 正义链 = 5uucuccgaacguguccgudtdt-3，反义链 = 5-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3。根据制造商的说明，用超高效蛋白进行细胞转染。

2.7. 细胞周期分析和细胞凋亡分析

通过流式细胞术分析了RBMX对TE1细胞周期的影响。转染的细胞在预冷的PBS中洗涤，并重新悬浮在5 ml 70%乙醇中，然后固定过夜。然后收集乙醇悬浮的细胞，洗涤，用含250毫克核糖核酸酶A的50毫克/毫升碘化丙锭在室温下黑暗中染色30分钟，随后用流式细胞仪和细胞探索软件进行分析。

根据商品说明书，使用PEAnnexin V凋亡检测试剂盒通，过流式细胞仪分析来测量细胞的凋亡(BD Biosciences, CA, USA)。简而言之，用RBMX过度表达或NC转染48小时后收集1 × 10⁵ TE1细胞在室温下以3000转离心5分钟。细胞在冷的PBS中洗涤一次，轻轻重新悬浮在100毫升结合缓冲液中，并在室温下与Annexin V-PE和7AAD在黑暗中孵育15分钟。然后向细胞悬浮液中加入400 ml结合缓冲液，使用流式细胞仪软件进行分析。

2.8. 统计分析

通过PASW18统计软件进行统计分析。采用χ²检验分析Ki-67和RBMX表达与临床病理特征的关系。使用Kaplan-Meier方法构建总生存曲线，并使用对数秩检验评估差异的统计学意义，差异显著(P < 0.05)。

3. 研究结果

3.1. RBMX在ESCC的表达及其与临床病理资料的相关性

为了确定RBMX的表达水平与ESCC之间的相关性，我们使用免疫组织化学染色来检测87例ESCC样本中RBMX和Ki67的表达。免疫组织化学(IHC)结果如图1所示。发现RBMX的免疫反应定位于肿瘤细胞核和胞浆，在高分化ESCC组织中高表达，在低分化ESCC组织中低表达。临床病理参数、RBMX和Ki67表达之间的关系见表1。分析结果表明，RBMX在ESCC的表达与组织学分级(P < 0.001)、肿瘤大小(P = 0.002)和淋巴结转移显著相关，而与年龄、性别和侵袭性无关。此外，在所有ESCC病例中，RBMX的表达与Ki67的表达呈负相关。基于增殖活性发现RBMX表达与ki-67呈负相关(P < 0.01，图2)。

图1. RBMX和KI67在组织切片中的免疫组织化学染色。(A)和(D)显示RBMX和KI67在组织学分级分化良好的组织中的染色。(B)和(E)显示RBMX和KI67在组织学分级中等分化组织中的染色。(C)和(F)显示RBMX在组织学分级低分化组织中的染色(放大400倍)

图2. 在 ESCC中 Ki-67与RBMX的表达关系。ki-67和RBMX的散点图与Spearman相关系数之间的相关性用回归线表示(P < 0.01)

3.2. RBMX在ESCC组织中表达下调

为了验证免疫组织化学结果的特异性，使用蛋白质印迹分析6对新鲜的ESCC组织。以β-actin作为对照，通过光度测定定量RBMX的表达。免疫印迹分析检测RBMX和PCNA的表达，结果与免疫组化一致。在这些情况下，ESCC组织中RBMX的表达水平明显低于邻近的非肿瘤组织(图3)。

图3. 在ESCC组织中RBMX的表达。(A) RBMX在6个有代表性的食管肿瘤组织和邻近非肿瘤组织配对样本中的表达。(B) 条形图通过光度测定定量显示了上述的RBMX蛋白与β-actin的比例。(与邻近非肿瘤组织相比，P < 0.01)

3.3. 在ESCC病例中RBMX的表达与生存率的关系

生存分析仅限于87例病例，获得了完整的随访数据和RBMX表达结果。通过使用高水平和低水平的RBMX评估RBMX对ESCC患者的总生存期的预后价值。Kaplan-Meier分析显示，RBMX低表达与总生存期短有相关性(P < 0.01，图4)。使用多变量Cox比例风险模型分析表明，RBMX蛋白可以作为ESCC患者总生存期的一个独立预后指标(P = 0.001，表2)。

图4. 根据RBMX表达的总生存率存活曲线。根据RBMX评分，将患者分为高RBMX表达者(评分 ≥ 4)和低RBMX表达者(评分 < 4)。低表达RBMX组患者的总生存率明显降低

表2. Cox回归分析87个样本中各种潜在的影响预后的因素

NOTE: Statistical analyses were performed by the Cox test analysis; *P < 0.05 was considered significant.

3.4. RBMX的过表达抑制ESCC细胞增殖

为了探索RBMX对ESCC的潜在影响，我们通过转染pcdnagv 144 CMV-EGFP-MCS-SV40-新霉素表达载体增加了RBMX在TE1细胞中的表达。通过蛋白质印迹分析验证了转染子后TE1细胞中RBMX的有效表达(图5(A)和图5(B))。接下来研究RBMX的过表达对ESCC细胞增殖的影响。CCK-8分析显示RBMX过度表达显著降低了TE1细胞的增殖能力(图5(C))。进一步分析RBMX过度表达后对细胞周期相关蛋白的影响，发现RBMX过表达后可下调CyclinD1、CDK4和p27的表达(图5(F))。我们发现，在RBMX过表达的细胞中，G1期的百分比(阴性对照组为51.66%，RBMX过表达组为71.29%)增加，S期百分比(阴性对照组为32.64%，RBMX过表达组为16.53%)降低(图5(D))。此外，G2期细胞百分比降低(阴性对照组为15.70%，RBMX过表达组为12.18%)。这些结果表明RBMX的过度表达可能阻滞细胞周期的G1/S期。

图5. RBMX过度表达降低细胞增殖。(A)和(B)过表达质粒转染TE1细胞48 h后通过蛋白质印迹检测RBMX蛋白表达；(C) CCK-8检测提示RBMX过度表达后TE1细胞增殖较对照组减少；(D)和(E)细胞周期分析显示，在RBMX过表达组中G1期的百分比增加(P < 0.05)，而在RBMX过表达细胞中S期(P < 0.05)和G2期(P < 0.05)的百分比与对照细胞相比降低；(F) 细胞周期相关蛋白的蛋白质印迹分析显示Cyclin D1和CDK4和p27在TE1细胞中过度表达后表达降低

3.5. RBMX过表达可诱导TE1细胞的凋亡

由于RBMX蛋白是一种新的p53靶基因产物，它在DNA双链断裂修复的保真度中起重要作用 [19]，如上所述，我们检测了p53在表达野生型p53的TE1细胞系中的表达。RBMX过表达质粒转染后48小时，RBMX蛋白表达水平显著提高。蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白。结果显示，RBMX过表达增加了p53、Bax和caspase-8的蛋白水平，降低了Bcl-2的表达(图6(A)和图6(B)。此外，Annexin V分析被用来检测RBMX的过表达可以诱导TE1细胞凋亡。显然，在RBMX过表达的细胞中，与对照相比，在细胞中可以观察到较低细胞的早期和晚期凋亡(5.67%至3.4%，和0.29%至0.21%，所有P ≤ 0.05) (图6(C))。这提示RBMX过表达可以诱导p53依赖性的食管癌细胞的凋亡。

图6. RBMX过表达可诱导TE1细胞凋亡。(A)和(B) 蛋白质印迹分析显示细胞凋亡的相关蛋白，在TE1细胞中过表达RBMX后，p53、Bax和Caspase-8的表达增加，而Bcl-2的表达降低；(C)和(D) RBMX过度表达诱导TE1细胞凋亡(P < 0.05)

4. 讨论与展望

研究表明，RBMX的表达在人类口腔癌和口腔鳞状细胞癌中具有肿瘤抑制的活性 [14] [20]。然而，在ESCC中RBMX表达的，以及在ESCC中RBMX表达与临床病理因素之间的关系还没有被确定。在我们的研究中，我们首次报道了RBMX对ESCC细胞生长的抑制作用。ESCC的细胞和组织显示RBMX的异常表达。这首先通过免疫组织化学得到证实，其显示ESCC组织中RBMX蛋白的水平与ESCC组织的分化等级有相关性。RBMX表达的下调与分化(P = 0.000)和肿瘤大小(P = 0.004)有相关性。RBMX表达下调的患者组织分化差，肿瘤体积大，无瘤生存期短。这些结果表明，RBMX可能在人类ESCC进程中发挥重要作用。由于大多数抑制剂可以通过影响细胞周期进程来影响细胞生长，因此使用细胞周期分析和cck-8分析来研究RBMX在细胞增殖中的作用。结果表明，RBMX过表达组的G1期比例要高于对照组，S期和G2期比例低于对照组。与对照组相比，RBMX过表达后TE1细胞的增殖下调，提示RBMX可能抑制TE1细胞的增殖。蛋白质印迹检测细胞周期蛋白相关蛋白的表达，包括Cyclin D1、CDK4和p27。Cyclin D1和CDK4也可产生复杂的磷酸化Rb，这是通过控制G1相限制点来调节细胞增殖的一个关键因素 [21]。Cyclin D1过度表达已在许多癌症中观察到，并已被证明与癌细胞增殖有关 [22] [23] [24]。我们发现细胞中过表达RBMX后，Cyclin D1和CDK4表达水平降低，这与G1百分比增加和S和G2减少有关。因此，我们猜测RBMX可能是控制了ESCC细胞周期的关键调节因子。

先前的研究表明RBMX是RBM蛋白的一员，据报道它是一个新的凋亡调节剂家族 [16] [18]。RBMX蛋白是一种新的p53靶基因产物 [19]。所有X染色体RBM基因的表达与人乳腺癌中促凋亡基因Bax的表达显著相关 [18]。为了证实RBMX在人类ESCC发展中的潜在作用，我们构建了RBMX过表达的质粒，并转染了表达野生型p53的TE1细胞，以供进一步研究。首先，我们通过蛋白质印迹检测了凋亡相关蛋白如p53、Bcl-2、Bax和Caspase-8的表达，发现过表达RBMX后可以上调p53、Bax和Caspase-8的表达，下调Bcl-2的表达。我们还使用Annexin V试剂盒检测了TE1细胞过表达RBMX后对细胞凋亡的影响。我们的结果表明，与流式细胞术检测的细胞凋亡阴性对照组相比，RBMX过表达的细胞凋亡群体显著增加(分别为5.67%和3.4%，P < 0.05)。野生型p53在细胞周期、分化和凋亡中也起着重要作用 [25]。上述结果可能解释了RBMX对人ESCC细胞分化的作用机制。总之，本研究检测了RBMX在人食管鳞状细胞癌中的表达及其临床病理学意义。组织中RBMX的测定有望以后可用于人类食管鳞状细胞癌发生的早期诊断。

基金项目

国家自然科学基金 (31830028, 31771054)，江苏省教育厅自然科学重点科研项目(19KJA320006)，江苏省卫计委2015年度医改试点单位科研课题(编号：YG2015)，扬州市十三五科教强卫重点人才(编号：RCC201857)。

文章引用

刘 芳,李贵才,丁宗梅,秦 凯,陆松华. RBMX在食管鳞状细胞癌中的相关性研究——RBMX对食管鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响
Study on the Correlation of RBMX in Esophageal Squamous Cell Carcinoma—Effects of RBMX on the Proliferation and Apoptosis of Esophageal Squamous Cell Carcinoma[J]. 生物过程, 2021, 11(03): 54-65. https://doi.org/10.12677/BP.2021.113007

参考文献