Hans Journal of Agricultural Sciences
Vol. 09  No. 06 ( 2019 ), Article ID: 30840 , 5 pages
10.12677/HJAS.2019.96063

Expression Stability Analysis of Internal Reference Genes in Insect States of Euzophera pyriella

Guanghuang Ma1, Ping Fu1, Yan Sun1, Shuyuan Kang1, Minglu Yang1,2

1College of Plant Science, Tarim University, Alar Xinjiang

2Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Alar, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Alar Xinjiang

Received: May 28th, 2019; accepted: June 12th, 2019; published: June 19th, 2019

ABSTRACT

Euzophera pyriella is one of the important pests in forestry and fruit trees in Xinjiang. In order to study the expression of some genes in this pest, 5 candidate internal reference genes such as β-actin, 18s rRNA, UBQ, GAPDH and β-tub were selected as the research objects. The relative expression of candidate internal reference genes was analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR. The expression stability was evaluated by Delta Ct, GeNorm, BestKeeper, NormFinder and RefFinder software or methods. The results showed that 18s rRNA and UBQ genes had good stability in insect states of Euzophera pyriella, and only BestKeeper software analyzed UBQ gene stability slightly better than 18s rRNA, followed by TUB and β-Actin, GAPDH expression stability was the worst.

Keywords:Euzophera Pyriella, Internal Reference Genes, Real Time Fluorescence PCR

香梨优斑螟不同虫态内参基因稳定性分析

马光皇1,符平1,孙妍1,康淑媛1,杨明禄1,2

1塔里木大学,新疆 阿拉尔

2农业农村部阿拉尔作物有害生物科学观测站,新疆 阿拉尔

收稿日期:2019年5月28日;录用日期:2019年6月12日;发布日期:2019年6月19日

摘 要

香梨优斑螟是新疆危害林果的重要害虫之一,为研究该害虫某些基因的表达情况,选取β-actin、18s rRNA、UBQ、GAPDH和β-tub等5种候选内参基因为研究对象,利用实时荧光定量PCR技术分析候选内参基因相对表达情况,以Delta Ct、GeNorm、BestKeeper、NormFinder和RefFinder软件或方法评价表达稳定性。结果发现:18s rRNA和UBQ基因在香梨优斑螟不同虫态中稳定性较好,只有BestKeeper软件分析UBQ基因稳定性略好于18s rRNA,其次是TUB和β-Actin,GAPDH表达稳定性最差。

关键词 :香梨优斑螟,内参基因,实时荧光PCR

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1. 引言

香梨优斑螟(Euzophera pyriella)属鳞翅目螟蛾科,是新疆林果业上的重要害虫之一 [1] ,主要分布在新疆塔城、博乐、伊宁、昌吉、哈密、叶鲁番、库尔勒和阿克苏等地,主要寄主有梨、苹果、无花果、枣、杏、巴旦杏、桃等 [2] 。部分产区被害率高达50%,危害严重的甚至会造成树体死亡,在阿克苏地区5年以上香梨园内香梨优斑螟危害株率达100%,常造成严重的经济损失 [3] [4] 。虽然香梨优斑螟在新疆是受到关注的害虫,但其发现时间较晚 [5] ,基因功能方面研究不够深入,在内参基因选择上还没有文献报道。

香梨优斑螟不同发育时期代谢差异很大,为了研究其目标基因的表达水平,选择β-actin、18s rRNA、UBQ、GAPDH和β-tub等5种管家基因 [6] ,参考实验室转录组数据库对应基因序列设计引物,以实时荧光PCR方法检测其在不同虫态表达的相对稳定性。

2. 材料与方法

2.1. 试虫

香梨优斑螟2017年5~6月采自塔里木大学校园果园,幼虫、蛹直接采集于梨树树干受害出,成虫是蛹室内羽化后收集,样品放入−80℃超低温冰箱保存备用。

2.2. 试剂

总RNA提取Trizol试剂、cDNA第一链合成HiFiScript试剂盒、SGExcel UltraSYBR Mixture试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)、三氯甲烷、75%乙醇及无RNase水。

2.3. 研究方法

2.3.1. 香梨优斑螟总RNA提取

香梨优斑螟不同虫态(雌或雄)样品单头作一处理,每处理设置三次重复。将样品放入2 ml离心管中,再加入1 ml TRIzon及2颗皓珠,置于组织研磨机中,设置50 Hz、60 S进行研磨,室温放置5 min;将0.2 ml三氯甲烷加入离心管中,剧烈震荡15秒,室温放置2~3分钟;4℃、12,000 rpm离心15 min,将水相(约0.6 ml)转移到RNase-free离心管;然后加入0.6 ml异丙醇,颠倒混匀,室温下放置10 min;4℃、12,000 rpm离心10 min,丢弃上清液;离心管中加入75%乙醇1 ml,洗涤沉淀;4℃、12,000 rpm离心3 min,小心吸取上清液;室温放置3分钟,晾干;加入50 μL RNase-free水,充分溶解RNA,将RNA保存在−80℃超低温冰箱备用或直接用于cDNA合成。

2.3.2. 香梨优斑螟总RNA检测

吸取1uL RNA溶液在微量核酸测量仪检测RNA浓度,利用1%的琼脂糖电泳检测RNA完整性。

2.3.3. 第一链cDNA的合成

根据cDNA第一链合成HiFiScript试剂盒进行操作,逆转录产物置于−20℃冰箱保存。

2.3.4. 候选内参基因的选择及引物设计

利用primer 6.0设计根据相应基因序列片段候选内参基因引物,基因序列来源于实验室香梨优斑螟转录组数据库,内参基因引物由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。

Table 1. General information of primer sets designed based on the gene

表1. 候选内参基因引物信息列表

2.3.5. 实时荧光PCR扩增

cDNA稀释十倍后作为PCR反应模板,采用SGExcel UltraSYBR Mixture试剂盒,反应体系为25 μL,其中cDNA 1 μL,Mixture 12.5 μL,上下游引物各0.5 μL,ddH2O至25 μL。

反应条件为预变性95℃ 10 min;变性95℃ 15 s,60℃延伸和退火30 s,40个循环。

2.4. 数据分析

利用Excel将不同虫态或性别样品获得Ct值根据软件需求格式整理,采用BestKeeper [7] 、NormFinder [8] 、GeNorm [9] 、Delta Ct [10] 和RefFinder [11] 方法分析候选内参及因的稳定性。

3. 结果与分析

3.1. 总RNA完整性分析

微量核酸测量仪测定总RNA浓度显示香梨优斑螟总RNA的A260/A280平均值为1.98,1.0%琼脂糖非变性凝胶电泳呈现条带中18S条带最亮,表明所提取RNA完整性较好(图1)。

3.2. 内参基因表达分析

由6种内参基因在香梨优斑螟雌雄的低龄幼虫、大龄幼虫、蛹和成虫中的Ct值在8.97~33.80之间,其中16S rRNA基因的表达丰度(Ct值为8.97~15.87)明显高于其他候选内参基因,GAPDH基因的表达丰度(Ct值为16.6~33.8)波动最大。

注:从左至右分1~2为低龄雌幼虫,3~5是雄成虫,6~8为蛹。

Figure 1. Extraction of total RNA agarose electrophoresis from

图1. 香梨优斑螟提取总RNA琼脂糖电泳图

根据Delta Ct、BestKeeper、GeNorm、NormFinder和RefFinder方法对RT-qPCR数据进行候选内参的稳定性综合评价。采用Delta CT法以标准差的大小对基因的表达稳定性进行排序,候选基因稳定性由高到低为18s rRNA > UBQ > β-tub > β-actin > GAPDH,在香梨优斑螟不同发育阶段18S的表达稳定性是最高的,但各基因表达的Delta CT标准差变化不大(图2(A))。以geNorm分析的候选内参基因在不同样品中的表达稳定性(M)在2.22-4.06之间,M值均大于1.5,不符合表达稳定性要求(图2(C))。NormFinde分析结果是18s rRNA内参基因表达最稳定,其次是UBQ内参基因(图2(D)),而BestKeeper分析发现UBQ内参基因表达最稳定,其次是18s rRNA内参基因(图2(B))。利用RefFinder综合分析排名为18s rRNA > UBQ > β-tub > β-actin > GAPDH (图2(E))。

Figure 2. Expression stability analysis of internal reference genes of Euzophera pyriella in insect states

图2. 内参基因在香梨优斑螟不同虫态表达稳定性

4. 结论与讨论

所选择内参基因一般是受环境因素或不同处理之表达水平相对稳定的管家基因 [12] ,其表达量或在基因组中的拷贝数接近恒定。由于内参基因在不同组织及试验条件下表达水平有差异,因此需要选择不同的管家基因作为内参 [13] ,理想的内参基因Ct值常介于15~30之间 [14] 。蓖麻蚕幼虫、蛹、成虫、卵各发育时期的β-actin表达稳定 [15] ,在香梨优斑螟的各虫态中β-actin基因稳定性较差,而与丝光绿蝇不同历期和纹细蛾成虫不同组织研究结果相似,认为18S rRNA基因可以作为内参基因 [16] [17] 。综合评价认为香梨优斑螟在不同发育历期和性别方面的基因稳定性为18s rRNA > UBQ > β-tub > β-actin > GAPDH。

基金项目

国家大学生创新项目(项目编号:201610757008)和国家自然科学基金(项目编号:31560512)资助。

文章引用

马光皇,符 平,孙 妍,康淑媛,杨明禄. 香梨优斑螟不同虫态内参基因稳定性分析
Expression Stability Analysis of Internal Reference Genes in Insect States of Euzophera pyriella[J]. 农业科学, 2019, 09(06): 427-431. https://doi.org/10.12677/HJAS.2019.96063

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