贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳

收稿日期：2023年9月13日；录用日期：2023年9月22日；发布日期：2023年11月17日

摘要

目的：采用网络药理学的分析方法，探讨玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑疾病的作用机制。方法：通过TCMSP数据库收集玉蝴蝶祛斑膏潜在有效活性化合物，并通过Swiss Target Prediction数据库筛查其潜在有效活性化合物的人类潜在有效靶点蛋白；在DisGeNET、GeneCards、TTD等数据库筛查黄褐斑的疾病靶点蛋白；通过STRING数据库构建蛋白–蛋白互作网络数据，并利用Cytoscape软件进行可视化拓扑结构分析，将关键靶点蛋白通过DAVID数据库进行基因功能和通路富集分析。结果：筛选得到玉蝴蝶祛斑膏中潜在有效活性成分66个，所对应潜在靶点蛋白478个，与黄褐斑疾病相关疾病靶点蛋白120个。“成分–靶点”网络图提示槲皮素、黄芩素等是玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑疾病的关键成分。GO富集分析结果显示，共有225个条目与生物过程相关，共有40个条目与细胞组成相关，共有63个条目与分子功能相关；富集分析显示，参与治疗黄褐斑疾病的关键靶点蛋白主要与131条通路相关联，其主要涉及癌症通路、癌症蛋白聚糖通路等。其中癌症通路的P值最高。结论：文章利用网络药理学多成分、多靶点、多维度、多途径的分析方法，较为全面地阐明了玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑疾病的作用特点，初步揭示了玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑疾病的有效基础物质和作用机制，为后续研究提供思路与依据。

关键词

玉蝴蝶祛斑膏，网络药理学，黄褐斑，机制，化学成分，槲皮素

Mechanism of Yuhudie Macula-Removing in Treatment of Chloasma Based on Network Pharmacology

Yun Zhang, Xiangjun Mao, Zhiliang Fan, Rui Zhou, Yinluo Li, Bin Zhou, Zihan Wei, Yihui Chai^*, Liyan Zhang^*

School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang Guizhou

Received: Sep. 13^th, 2023; accepted: Sep. 22^nd, 2023; published: Nov. 17^th, 2023

ABSTRACT

Objective: To investigate the mechanism of Yuhudie Macula-removing in the treatment of chloasma by means of network pharmacological analysis. Methods: The potential active compounds of Yuhudie Macula-removing were collected by TCMSP database, and its human potential effective target protein of the potential active compounds was screened by Swiss Target Prediction database. The target proteins of chloasma were screened in DisGeNET, GeneCards, TTD and other databases. The protein-protein interaction network data was constructed by using STRING database, and the visual topological structure analysis was carried out by using Cytoscape software. The gene function and pathway enrichment of key target proteins were analyzed through the DAVID database. Results: 66 potential active ingredients, 478 potential target proteins and 120 target proteins related to chloasma disease were selected. The “component-target” network diagram indicates that quercetin and baicalein are the key components of Yuhudie Macula-removing in the treatment of chloasma disease. GO enrichment analysis showed that 225 items were related to biological processes, 40 items were related to cell composition, and 63 items were related to molecular function. Enrichment analysis showed that the key target proteins involved in the treatment of chloasma disease were mainly associated with 131 pathways, which mainly involved cancer pathways and cancer proteoglycan pathways. The cancer pathway has the highest P value. Conclusion: Using the multi-component, multi-target, multi-dimensional, multi-pathway analysis method of network pharmacology, this paper comprehensively elucidates the action characteristics of Yuhudie Macula-removing in the treatment of chloasma disease, and initially reveals the effective basic substances and mechanism of action of Yuhudie Macula-removing in the treatment of chloasma disease, providing ideas and basis for subsequent research.

Keywords:Yuhudie Macula-Removing, Network Pharmacology, Chloasma, Mechanism, Chemical Constituents, Quercetin

Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

黄褐斑(Chloasma)，最早出现在《黄帝内经》中，主要表现为面颊的黄褐色或咖啡色的色素沉着斑。现代医学按照皮肤颜色、皮损形状特点称其为“黄褐斑”、“蝴蝶斑”，斑迹形状大小不一，一般无自觉症状，是一类色素合成功能失调导致的局限性的慢性获得性的皮肤色素沉着疾病。调查发现，该病高发于妊娠期前后的女性，具体发病机制尚不明确，多数学者认为主要与体内激素失调有关 [1] [2] [3] [4] ，还与紫外线照射 [5] [6] 、皮肤光老化 [7] [8] [9] 等有关，目前治疗黄褐斑的药物会对患者的心理和生活质量造成较大的影响。因此，寻求安全有效的防御措施尤为重要和迫切。

玉蝴蝶斑膏(Yuhudie Macula-removing)，由柿叶20 g、木蝴蝶15 g、菟丝子2 g入组方而成；柿叶为柿树科植物柿Diospyroskaki L. f.的干燥叶，气微，味微苦涩，归肺经，具有活血止血、消渴及各种出血、臁疮的功效，方中用药量最大，起主要治疗作用，故为君药；木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶Oroxylumindicum (L.) Vent.的干燥成熟种子，气微，味苦，归肺胃经，用于肺热咳嗽、清肺理气、喉痹、木蝴蝶实佐君药除祛色斑之外，对于湿热余滞亦能起到良好的效用；菟丝子为旋花科植物菟丝子Cuscutachinensis Lam.的干燥成熟种子，气微，味甘，归肝脾经，具有补益肝肾、消风祛斑的功效。菟丝子为补肝、脾、肾三经之要药，有调节脏腑的功能，达到润肤美白的作用，佐药。

目前虽有大量的文献报道中药治疗黄褐斑的原理与机制，但对于外用制剂的研究较少，并且对于玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑疾病的作用机理尚不明确。网络药理学是挖掘国内外医药领域相关数据，通过网络平台建立药物疾病之间的关系，进行网络药理学数据分析，并构建网络互作结构分析、拓扑结构分析 [10] [11] 。在整体上构建药物–成分–靶点–通路的关系和阐述药物作用机制，为玉蝴蝶祛斑膏的研究提供新思路。本研究利用网络药理学独特的研究方法，探讨玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的主要有效化合物和有效潜在靶点蛋白，为玉蝴蝶祛斑膏药物的研发和临床治疗提供理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 玉蝴蝶祛斑膏活性化合物的收集与筛选

以中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)为主，中国知网(CNKI, https://www.cnki.net/)为辅，以菟丝子、玉蝴蝶、柿叶为关键词，收集玉蝴蝶祛斑膏全方3味中药化合物。以DL ≥ 0.18作为筛选条件，得到玉蝴蝶祛斑膏的潜在有效活性化合物。

2.2. 玉蝴蝶祛斑膏“化合物–靶点蛋白”网络的构建

通过Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)分别查找玉蝴蝶祛斑膏中柿叶、木蝴蝶和菟丝子潜在有效活性化合物的SMILE号，去重后利用Swiss Target Prediction数据库 (http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)进行潜在有效活性靶点蛋白的预测，将三个药味所含潜在有效活性化合物所预测的潜在有效活性靶点蛋白合并、去重，采用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)标准化所得潜在有效活性靶点蛋白，这些靶点蛋白即为玉蝴蝶祛斑膏的关键靶点蛋白，标准化后得到靶点蛋白的基因名称和UniProt编号。采用Cytoscape 3.9.1软件构建玉蝴蝶祛斑膏潜在有效化合物及潜在有效靶点蛋白网络，并对其进行网络拓扑结构分析和可视化分析。

2.3. 黄褐斑疾病靶点的获取

以“chloasma”、“melanosis”、“chloasmas”等为关键词，在DisGeNET (https://www.disgenet.org/)、GeneCards (https://www.genecards.org/)、TTD (Therapeutic Target Database, http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM (https://www.omim.org/)、PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/)、Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca/)中进行检索。合并以上数据库所获得黄褐斑疾病靶点蛋数据，去重，最后将黄褐斑疾病靶点蛋白名称输入UniProt数据库中以获取基因名称和UniPro编号。

2.4. 黄褐斑关键靶点筛选及蛋白–蛋白互作网络的构建

利用微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)绘制玉蝴蝶祛斑膏潜在有效活性成分靶点蛋白和黄褐斑疾病靶点蛋白韦恩图，韦恩图中交集的共同靶点蛋白可能是玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑疾病的关键靶点。通过STRING数据库(https://cn.string-db.org/)构建靶点蛋白–靶点蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction, PPI)网络模型，将PPI网络分析结果导入Cytoscape 3.9.1软件进行拓扑学分析并可视化PPI网络。

2.5. 基因本体论GO及KEGG分析

通过DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，对所获得玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑疾病的关键靶点蛋白进行GO基因本体论分析，其分析包括三部分构成，分为生物过程板块、分子功能板块以及细胞组成板块，限定P < 0.01且FDR < 0.05的筛选结果，对生物过程P值前20的结果采用微生信平台(https://www.bioinformatics.com.cn/)以三合一双侧条形图的形式进行可视化展现；通过KEGG富集分析，对所获得玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑疾病的关键靶点进行通路分析，限定P < 0.01且FDR < 0.01的筛选结果，使用微生信平台以气泡图的形式进行可视化呈现富集结果。

3. 结果

3.1. 玉蝴蝶祛斑膏活性化合物的筛选结果

通过TCMSP数据库及CNKI平台的收集与筛选，以菟丝子、木蝴蝶、柿叶为关键词，收集玉蝴蝶祛斑膏全方3味中药所含潜在有效活性化学成分。以DL ≥ 0.18作为筛选条件对所收集到的潜在有效活性化合物进行筛选，得到柿叶潜在有效活性成分11个，木蝴蝶潜在有效活性成分46个，菟丝子潜在有效活性成分16个。合并去重后共得到66个潜在有效活性成分，具体信息见表1。

这提示着玉蝴蝶祛斑膏具有多成分的治疗特点。

表1. 玉蝴蝶祛斑膏有效活性成分

3.2. 玉蝴蝶祛斑膏“药物成分–靶点”网络的构建

将上述三个化合物的66个潜在有效活性化合物，通过Swiss Target Prediction数据库，查找233个人类潜在有效活性靶点蛋白存在于柿叶中，373个人类潜在有效活性靶点蛋白存在于木蝴蝶中，294个人类潜在有效活性靶点蛋白存在于菟丝子中。其中有8个潜在有效活性化合物未能找到相关潜在有效活性靶点蛋白，合并，去重得到478个潜在有效活性靶点蛋白，其化合物–靶点蛋白网络，详细信息见图1。

图1. 玉蝴蝶祛斑膏“化合物–靶点蛋白”网络

该“化合物–靶点蛋白”网络图共536个节点(其中包括58个潜在有效化合物节点和478个潜在有效靶点蛋白节点)和3655条边组成，在所获得的玉蝴蝶祛斑膏的66个潜在有效化合物中，现有数据仅找出58个潜在有效化合物有相对应的潜在有效靶点蛋白，有8个潜在有效化合物未找到相对应的潜在有效靶点蛋白，故玉蝴蝶祛斑膏的“化合物–靶点蛋白”图中只显示58个潜在有效化合物节点和478个潜在有效靶点蛋白节点。经过网络拓扑结构分析，左侧圆节点为三个药味所包含的潜在有效活性化合物，右侧圆节点为潜在有效活性化合物所对应的靶点蛋白，潜在有效化合物的平均度值为63.02，其中高于该平均度值的潜在有效化合物有23个。其中，来自于柿叶、木蝴蝶与菟丝子的共有成分槲皮素(Quercetin)的节点度最高，度值为312，降序依次为来自柿叶、菟丝子中的山柰酚(Kaempferol)，度值为208，柿叶、木蝴蝶与菟丝子中的β-谷甾醇(Beta-sitosterol)，度值为132，潜在有效靶点蛋白的平均度值为7.65，有183个潜在有效靶点蛋白的度值高于该平均度值，其中节点度最高的为芳香化酶A1 (Cytochrome P450 19A1, CYP19A1)，靶向44个潜在有效活性化合物，降序依次为细胞周期蛋白依赖性激酶1 (Cyclin-Dependent Kinase 1, CDK1)，靶向39个潜在有效活性化合物，乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)，靶向38个化合物，表2仅列出度值最高的前20项潜在有效活性化合物和潜在有效活性靶点蛋白。该数据有效表明了玉蝴蝶祛斑膏具有多成分、多靶点的网络药理学分析的特性。

表2. 玉蝴蝶祛斑膏“化合物–靶点蛋白”网络拓扑学参数

3.3. 黄褐斑疾病靶点的获取、关键靶点的筛选及PPI网络的构建

通过数据库检索，GeneCards检索到黄褐斑相关靶点954个、PHarmGKB数据库检索到黄褐斑相关靶点201个、DisGeNET检索到黄褐斑相关靶点48个、OMIM检索到黄褐斑相关靶点10个、Drugbank检索到黄褐斑相关靶点4个、TTD检索到黄褐斑相关靶点3个。合并所获得的黄褐斑疾病靶点蛋白，去重，得到黄褐斑疾病靶点基因1084个。将玉蝴蝶祛斑膏化合物的478个靶点与黄褐斑疾病靶点的2084个靶点导入Venny 2.1软件得到玉蝴蝶祛斑膏化合物与黄褐斑疾病的120个共同靶点，即视为玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的关键靶点，见图2。

图2. 玉蝴蝶祛斑膏化合物靶点–黄褐斑靶点韦恩图

将120个关键靶点导入STRING数据库中，结果进一步导入Cytoscape 3.9.1软件进行拓扑学分析并构建PPI网络，见图3。

图3. 关键靶点PPI网络

该PPI网络图包含120个节点和1414条边。节点颜色的深浅表示度值大小，其节点颜色越深，其所对应节点度值越大，反之越小；节点大小表示度值大小，其节点越大，其所对应节点度值越大，反之越小；经过网络拓扑学结构分析和优化，关键靶点蛋白的节点平均自由度为23.57，平均介数为0.0082，平均接近中心性为0.52以及平均最短路径长度的均值为1.97。其中有21个关键靶点蛋白的节点自由度、介数以及接近中心性数均高于均值，并且这21个关键靶点蛋白的节点平均最短路径长度低于均值，表3仅列出度值最高的前20项关键靶点蛋白数据，提示着这些关键靶点蛋白可能在黄褐斑疾病的治疗中起到关键性作用。

表3. 玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的关键靶点拓扑学参数

3.4. GO富集分析结果

将120个关键靶点蛋白通过DAVID数据库的GO本体论分析，共得到328个富集条目(P < 0.01, FDR < 0.05)，其中BP获得225个条目，主要涉及激素应答、细胞对有机物的反应、氧化反应、规律性细胞死亡的正调控、蛋白酶正向调节、细胞增殖的调控、调节蛋白质磷酸化和炎症反应等；CC获得40个条目，主要涉及膜筏、膜侧、色素粒、细胞基质、胞外区、细胞质和线粒体等；MF获得63个条目，主要涉及氧化还原酶活性、RNA聚合酶II转录因子活性、转录酶活性、ATP结合和NADP结合等。分别选取BP、CC和MF根据P值最小前20的条目，见图4。该富集结果提示着玉蝴蝶祛斑膏在治疗黄褐斑过程中通过参与调控多种生物学过程而发挥作用。

图4. 关键靶点的GO条目

3.5. KEGG富集分析

通过分析发现，120个靶点集中显著富集在131条通路上(P < 0.01, FDR < 0.01)，选取P值排名最小的前20条富集通路，见表4、图5，主要涉及癌症通路(Pathways in cancer)、癌症蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、内分泌信号通路(Endocrine resistance)等。这提示着玉蝴蝶祛斑膏可能通过作用于多条通路来发挥治疗黄褐斑疾病的作用。

表4. 玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑关键靶点的通路表

图5. 通路富集分析气泡图

4. 讨论

《灵柩·邪气藏府病形篇》云：“十二经脉、三百六十五络，其气血皆上于面，而走空窍”。说明黄褐斑属肝郁气滞者，宜疏肝理气，通络活血为主；属脾虚湿蕴者，宜健脾益气，祛湿化斑为主。根据发病的表现，其治疗应综合考虑病因、症候、标本兼治，可通过益气填精、化瘀消斑的功效来治疗黄褐斑疾病。本文利用网络药理学多成分、多靶点的科学分析方法探讨中药新药玉蝴蝶祛斑膏黄褐斑的作用机制。

4.1. 潜在有效成分分析

玉蝴蝶祛斑膏由柿叶、木蝴蝶和菟丝子组方而成，具有养颜、护肤、祛斑的功效。本研究以TCMSP数据库为基础，分别以柿叶、木蝴蝶及菟丝子等关键词收集到的化学成分在一定程度上可以代表玉蝴蝶祛斑膏全方所含的化学成分。通过“药物成分–靶点”网络拓扑学分析，汇总玉蝴蝶祛斑膏潜在活性成分66个，其中自由度较高的化学成分有槲皮素、山奈酚、白杨素、黄芩素、金丝桃苷和野黄芩素等。有研究表明，黄酮类化合物具有很好的抗氧化活性 [12] [13] [14] ，其槲皮素、山奈酚在体外具有显著的抗氧化活性，在一定条件下可作为抗氧化剂的使用 [15] [16] ，有学者通过LPS诱导的小鼠巨噬细胞释放NO、TNF-α、IL-6等炎症因子，研究黄芩素对DPPH和超氧阴离子的清除作用，实验结果表明，黄芩素主要通过清除过量的DPPH自由基和超氧阴离子而发挥抗氧化的作用 [17] 。研究表明，金丝桃苷能显著抑制自由基脂质过氧化，增强机体抗氧化能力，加速机体对自由基的清除作用 [18] 。

4.2. 成分靶点分析

网络拓扑分析结果显示，玉蝴蝶祛斑膏的潜在成分对应478个靶点，其中与黄褐斑疾病靶点相关的共同靶点有120个，通过构建PPI网络发现，TNF、AKT1、SRC、EGFR、MAPK3等的度值较大，可能是玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的关键靶点。TNF可诱导多种细胞内信号并具有细胞增殖、代谢等多种生物活性，通过降低TNF-α的炎性级联反应，能够抑制皮肤表皮黑色素细胞的活性，并且能够有效降低黑素瘤细胞的络氨酸酶的活性，以达到显著减少黑色素的合成，在治疗黄褐斑等皮肤疾病上有显著的优势 [19] [20] 。AKT1可调节细胞增殖、代谢等生物过程，过程中PI3K和AKT信号通路能够被许多细胞刺激而激活，并促进自由基的表达，发挥抗氧化作用 [21] 。

4.3. 生物富集分析

通过GO功能富集分析可知，玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的生物进程主要涉及激素应答、细胞对有机物的反应、氧化反应、规律性细胞死亡的正调控、蛋白酶正向调节、细胞增殖的调控、调节蛋白质磷酸化和炎症反应等。通过KEGG功能富集分析可知，玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的生物学进程主要以T细胞、B细胞以及巨噬细胞为代表的免疫细胞为主导，涉及白介素-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、TNF肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、破骨细胞分化(Osteoclast differentiation)、自然杀伤细胞介导的细胞毒性(Natural killer cell mediated cytotoxicity)、TRP通道炎性介质调节(Inflammatory mediator regulation of TRP channels)等。黄褐斑的发病机理复杂、多样，单一靶点的药物难以取得较好的疗效，因此寻找一种多成分、多靶点的药物已成为未来治疗黄褐斑的一大优势。

5. 总结

玉蝴蝶祛斑膏可能是通过作用于TNF、AKT1、SRC等多种靶点，调节癌症通路、癌症蛋白聚糖、Toll样受体信息通路内分泌阻力、前列腺癌、Rap1信息通道、C型凝集素受体信息通道、白细胞介素-17信息通道、催产素信息通道、环磷酸腺苷信息通道、破骨细胞分化细胞接受器信息通道、催乳素受体信息通道、血管内皮生长因子信号通道等途径，从而控制细胞凋亡、控制炎症反应、调整身体免疫功能，以防治黄褐斑。本研究结果表明，用玉蝴蝶祛斑膏防治黄褐斑具有多成分、多靶点、多途径协同作用的优点，为进一步的试验研究和临床运用奠定思路和参考基础。

文章引用

张 云,茅向军,范志梁,周 瑞,李银洛,周 斌,魏子涵,柴艺汇,张丽艳. 基于网络药理学探讨玉蝴蝶祛斑膏治疗黄褐斑的作用机制
Mechanism of Yuhudie Macula-Removing in Treatment of Chloasma Based on Network Pharmacology[J]. 药物化学, 2023, 11(04): 250-261. https://doi.org/10.12677/HJMCe.2023.114030

参考文献