 Medical Diagnosis 医学诊断, 2012, 2, 1-5 http://dx.doi.org/10.12677/md.2012.21001 Published Online March 2012 (http://www.hanspub.org/journal/md) The Molecular Cloning and Bioactivity Characterization of Unknown Gene 1C10 from Medicinal Fungus Agrocybe aegerita Yi Liang1*, Lianxian Guo2*, Hui Sun3 1Department of Clinical Immunology, Guangdong Medical College, Dongguan 2Department of Occupational and Environmental Health, Guangdong Medical College, Dongguan 3The College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan Email: liangyi@gdmc.edu.cn Received: Feb. 29th, 2012; revised: Mar. 9th, 2012; accepted: Mar. 10th, 2012 Abstract: Objective: The antitumor-associated gene of Agrocybe aegerita was cloned to identify the bioactivity. Method: cDNA library was constructed and the gene 1C10 was obtained by random sequencing. The differential ex- pression of the gene was analyzed by high-throughout sequencing. The eukaryotic expression vector was constructed to detect cell apoptosis and senescence activity. Result: The gene of 1C10 was cloned with 728 bp and 107 amino acid residues. The high-throughout sequencing analyse showed that 1C10 was highly expressed in the fruiting body. The expression in HeLa cells could induce the cell apoptosis instead of senescence. Conclusion: 1C10 was identified to have antitumor activity by cDNA library and sequencing, which was fundation for further study. Keywords: Medicinal Fungus; Antitumor Activity; cDNA Sequence 药用真菌杨树菇未知基因 1C10 克隆及其抗肿瘤活性初步鉴定 梁 一1*，郭莲仙 2*，孙 慧3 1广东医学院检验学院临床免疫教研室，东莞 2广东医学院公共卫生学院劳动卫生与环境卫生教研室，东莞 3武汉大学生命科学学院，武汉 Email: liangyi@gdmc.edu.cn 收稿日期：2012 年2月29 日；修回日期：2012 年3月9日；录用日期：2012 年3月10 日 摘 要：目的：克隆杨树菇抗肿瘤相关蛋白基因，初步鉴定其活性。方法：构建 cDNA 文库，随机测序得到杨 树菇基因 1C10。高通量测序分析其在菌丝体和子实体的差异表达。构建真核表达质粒检测其在 HeLa 细胞中表 达引起的细胞凋亡及衰老的变化，初步鉴定其抗肿瘤活性。结果：得到全长为728 bp的杨树菇基因 1C10，编码 107 个氨基酸，高通量测序分析发现 其在子 实体中为高表 达。在真核细 胞中表 达会引起肿瘤 细胞的凋亡而 非衰 老。结论：通过构建 cDNA文库及测序初步鉴定出具抗肿瘤活性的杨树菇未知基因1C10，为进一步研究其活性 及机理奠定基础。 关键词：药用真菌；抗肿瘤活性；cDNA 序列 1. 引言 药用真菌因其独特的药理活性被越来越多的研 究者关注[1-3]。其中蛋白质组分占子实体干重约10%~ 40%[4]，但长期以来，仅有上百种蛋白/多肽被分离， 且多集中在对其氨基酸组成、活性分析等初步研究。 *equal author contribution. Copyright © 2012 Hanspub 1  药用真菌杨树菇未知基因 1C10 克隆及其抗肿瘤活性初步鉴定 已有十多种药用真菌蛋白被报道具很强的抗肿瘤活 性(nM 级)[5,6]，包括凝集素、核糖体失活蛋白、核糖 核酸酶、泛素类蛋白、抗真菌蛋白等，提示蛋白质是 药用真菌中另一类重要的抗肿瘤活性组分[7]。 相对于多糖，药用真菌的抗肿瘤活性蛋白研究不 足的原因，可能是由于药用真菌基因组信息缺乏，不 易克隆蛋白基因序列的缘故。目前随着高通量测序技 术的成熟，国内外学者也都致力于对药用真菌基因组 的测序工作。2006 年，来自 19 个大学的研究人员组 成的团队开始首次对食用菌平菇 Pleurotus ostreatus 基因测序组的测序，2007 年开始对双胞蘑菇Agaricus bisporus 的基因组测序，目前这些项目均已完成[8]， 极大地推动了药用真菌活性蛋白的研究工作。药用真 菌杨树菇活性蛋白在体内和体外试验中均表现出显 著的抗肿瘤活性[7]，本文通过构建 cDNA 文库测序的 方法，克隆药用真菌杨树菇Agrocybe aegerita具抗肿 瘤活性的未知基因，并对其进行初步活性鉴定。 2. 材料与方法 2.1. 材料 杨树菇(Agrocybe aegerita)子实体由华中农业大 学食用菌研究所培育，品种为杨树菇3号，采集之后 迅速冷冻于液氮罐中保存。RNA 提取试剂盒是 Qiagen 公司的 RNeasy Plant Mini Kit，SMART cDNA Library Construction Kit购于 Clontech 公司。真核表达载体 pGEFP-C1系本实验室保存，HeLa 细胞购于中国典型 培养物保藏中心(CCTCC)，转染试剂为 invitrogen 公 司的 Lipofectamine 2000。衰老相关 β-galactosidase 检 测试剂盒购自上海杰美生物公司，碘化丙锭PI 购于武 汉大风生物技术有限公司。 2.2. cDNA文库及基因测序 使用 RNeasy Plant Mini Kit提取杨树菇子实体总 RNA，按照 SMART cDNA Library Construction Kit说 明书构建cDNA 文库。即在合成cDNA 的反应中事先 加入的 3'末端带 Oligo (dG)的SMART 引物，由于逆 转录酶以 mRNA 为模板合成 cDNA，在到达 mRNA 的5'末端时碰到真核 mRNA 特有的“帽子结构”，即 甲基化的 G时会连续在合成的 cDNA末端加上几个 (dC)，SMART 引物的Oligo (dG)与合成cDNA 末端突 出的几个C配对后形成 cDNA 的延伸模板，逆转录酶 会自动转换模板，以 SMART 引物作为延伸模板继续 延伸 cDNA 单链直到引物的末端，这样得到的所有 cDNA 单链的一端有含Oligo (dT)的起始引物序列，另 一端有已知的 SMART 引物序列，合成第二链后可以 利用通用引物进行扩增。由于有5'帽子结构的 mRNA 才能利用这个反应得到能扩增的 cDNA，因此扩增得 到的 cDNA 就是全长cDNA。 对文库进行随机测序，得到的序列用 CodonCode Aligner软件去掉低质量序列、载体序列、重复序列等， 用Phrap拼接同源EST，并与 NCBI 非冗余蛋白库比 对(BLASTX)。 2.3. 转录组测序 提取样品总RNA 后，用带有 Oligo (dT)的磁珠富 集mRNA 。加入fragmentation buffer将mRNA 打断成 短片段，以mRNA 为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条 cDNA 链，然后加入缓冲液、 dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条 cDNA 链，在经过 QiaQuick PCR试剂盒纯化并加 EB 缓冲液洗脱之后做末端修复、加 poly(A)并连接测序接 头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后 进行 PCR扩增，建好的测序文库用 Illumina HiSeq™ 2000 进行测序。测序得到的原始图像数据经 base calling 转化为序列数据，结果以fastq 文件格式存储， 包括 reads 的序列以及reads 的测序质量。 2.4. 真核表达质粒构建及转染 通过引物 Forward：ccgaattccatggtcagttctgtcg， reverse：cggggtacctcatgcgatccatggtg，将 1C10 基因克 隆到真核表达载体 pGEFP-C1 上。HeLa 细胞按每孔约 3 × 104个细胞接种于6孔细胞培养板，37℃培养过夜， 待细胞密度为 80%~90%使用 Lipofectamine 2000转染 真核表达质粒。 2.5. PI染色及流式细胞仪分析 按照上述方法转染待质粒，继续培养 48 hr。使 用 荧光显微镜检测转染效率。细胞用 PBS重悬洗涤 1次， 75% 乙醇重悬后，加 RNase A (终浓度 0.25 mg/ml) 37℃孵育1 hr，终浓度 50 mg/ml的碘化丙啶 4℃避光 Copyright © 2012 Hanspub 2  药用真菌杨树菇未知基因 1C10 克隆及其抗肿瘤活性初步鉴定 Copyright © 2012 Hanspub 3 染色 30 min，流式细胞计数仪检测荧光强度分布(激发 波长 488 nm)。 2.6. 衰老相关 β-galactosidase 检测 按照上述方法转染质粒，使用 β-galactosidase衰 老相关试剂盒里对细胞进行染色，细胞呈现蓝色部位 为衰老细胞特异性酶(β-半乳糖苷酶)活性位点。 2.7. 统计学方法 应用统计软件 SPSS13.0 进行数据分析，组间比 较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t 检验， p < 0.05有统计学意义。 3. 结果 3.1. 1C10基因序列及数据分析 杨树菇 cDNA 文库构建成功，随机测序获得杨树 菇Agrocybe aegerita 1C10序列(如图 1所示)，长 728bp。用 NCBI 的ORF Finder 程序分析其开放阅读 框，5’-非翻译区为 28 bp，3’-非翻译区 376 bp ，其中 末尾有 18 bp的poly-A。含 有 长324 bp的开放阅读框 (包括一个终止密码子)，编码 107 个氨基酸。使用 BLASTP 搜索数据库，未找到相似度较高的氨基酸序 列这一结果表明1C10 序列是杨树菇中全新基因。 3.2. 1C10基因在杨树菇菌丝体和子实体的差异 表达 分别提取杨树菇菌丝体和子实体的总 RNA，在华 大基因研发中心使用 Illimina HiSeq 2000进行测序。 原始测序结果进行去除杂质和组装处理，得到尽可能 长的非冗余 Unigene。将 1C10 基因与Unigene 进行比 对，分别得到其在菌丝体和子实体中的 reads 数分别 为5和342，如表1所示。为消除基因长度和测序量 差异对计算基因表达的影 响[9]，使用 RPKM 法对 Unigene 的表达量进行统计，在菌丝体和子实体中分 别为 0.7471和50.8093。这说明 1C10基因在菌丝体和 子实体中均有表达，但在子实体中为高表达。 3.3. 真核表达质粒构建及转染 PCR 扩增连在 cDNA 文库构建质粒载体 pDNR-lib 上的 1C10 基因，扩增结果如图2(a)，将基 因克隆到pEGFP-C1 载体上，酶切鉴定结果如图 2(b)。 真核表达载体构建完成后，用pEGFP-C1 空载体作为 对照，以相同的量转染入6孔板的 HeLa细胞，48小 时后通过标签GFP 在荧光显微镜下检测转染效率，图 2(c)表明转染效率可达 80%以上。 3.4. 1C10表达对HeLa 细胞的影响 使用碘化丙啶染色以及流式细胞仪分析发现， 1C10 基因的表达可引起 HeLa细胞亚二倍体峰细胞群 也就是凋亡细胞数目的增多，如图 3(a)所示。转染空 质粒对照凋亡峰只有 2.24%，而 1C10 基因的表达诱 导细胞出现 24.6%的亚二倍体峰，说明 1C10 的表达 可显著诱导细胞出现凋亡。 转染质粒 48 小时后，使用衰老相关 β-galactosi- dase 检测试剂盒对细胞进行染色，光学显微镜观察， 每个样品随机选取 4个视野，计算 SA-β-Gal 呈阳性反 应的细胞比例，统计结果如图 3(b)所示，转染1C10 基因与对照组相比没有显著性差异。 4. 讨论 药用真菌中蛋白组分的研究十分不足，重要原因 之一在于其基因信息的缺乏。由于其繁殖特点(有性或 无性繁殖，菌丝的异宗结合，不同遗传背景的菌丝纽 结成子实体等特点)，使得基因克隆非常困难，因此，构 建cDNA 文库结合表达序列标签分析将有助于获得大 量基因信息，从而推动对药用真菌抗肿瘤蛋白的研究。 1C10 基因在数据库中未检索到相似度较高的基 因，属杨树菇新基因。通过高通量测序的Unigene 表 Table 1. The differential expression of 1C10 in mycelium and fruiting body of Agrocybe aegerita 表1. 1C10基因在杨树菇菌丝体(M)和子实体(F)中的差异表达分析 Identity (%) E-value Unigene length M rawreadsF raw readsM_ RPKMF_ RPKM Log2 (F_ RPKM/ M_RPKM) 95.61 0 808 5 342 0.7471 50.8093 6.08 M: mycelium, F: fruiting body.  药用真菌杨树菇未知基因 1C10 克隆及其抗肿瘤活性初步鉴定 Figure 1. The gene from Agrocybe aegerita and the deduced amino acid sequence 图1. 杨树菇Agrocybe aegerita 1C10基因序列及氨基酸序列 Figure 2. The construction and the transformation of the plasmid pEGFP-C1-1C10. (a) The PCR result of 1C10; (b) The result of enzyme digestion of the plasmid pEGFP-C1-1C10; (c) The trans- formation of the plasmid pEGFP-C1-1C10. The plasmid with GFP-tag was transformed into HeLa cells, and after 48 h the result was observed and pictured by fluorescence microscope (pEGFP- C1-C was the control) 图2. pEGFP-C1-1C10真核质粒构建及转染。(a) 1C10基因扩增; (b) pEGFP-C1-1C10 质粒酶切鉴定结果; (c) pEGFP-C1-1C10质粒转 染，带有 GFP 标签的质粒转染 HeLa细胞, 48小时后荧光显微镜观 察并照相(pEGFP-C1-C)为空载体对照 达差异分析发现，1C10基因在子实体中有高表达，菌 丝体中表达量较低。在真核细胞中1C10 表达可以引 起HeLa 细胞的凋亡，该分子的活性及作用机制值得 进一步研究。 cDNA 文库构建的质量很大程度上反应在重组 cDNA 片段的序列完整性，要从文库中分离获得目的 基因完整的序列和功能信息，要求文库中的重组 cDNA 片段足够长以便尽可能地反应出天然基因 Figure 3. The effect of the expression of 1C10 on HeLa cells. (a) The plasmids were transformed into HeLa cells, and after 48 h, the cells were detected by PI staining and flow cytometry. pEGFP- C1-C was used as blank control, and the statistical data was col- lected by three experiments performed. ** indicated that p value < 0.01; (b) The cells was stained for 16 h by the senescence associated β-galactosidase detection kit, and the percentage of positive cells was statistically collected in the four microscopic fields random selected 图3. 检测1C10 基因表达对 HeLa 细胞的影响。(a) 转染质粒 48 小时后，PI 染色结合流式细胞仪检测细胞。pEGFP-C1-C 为转入 空质粒对照，三次流式试验的统计学数据，**表示p < 0.01; (b) 使 用衰老相关 β-galactosidase检测试剂盒染色 16 小时，随机挑选 4 个视野计数阳性反应即衰老细胞比例的统计数据 的结构。本文使用基于SMART 技术构建文库的方法， 根据其原理应该是全长的cDNA。由测序结果也看到 本实验中构建的cDNA文库比较成功，测序得到的246 条EST 序列，大部分(>70%都可以找到 ORF，以 及5’ 上游的终止密码子以及 3’的polyA 序列，说明 SMART 技术是比较成熟的适用于构建全长 cDNA 文库的方 法。 本文通过cDNA 文库构建及测序，快速对杨树菇 大量基因信息进行分析，并进一步通过构建真核表达 质粒，转染入 HeLa 细胞中，初步筛选到多个具有抗 肿瘤活性的基因，包括泛素蛋白酶系统相关分子，及 本文的 1C10 等分子，说明该方法对快速大量地研究 Copyright © 2012 Hanspub 4  药用真菌杨树菇未知基因 1C10 克隆及其抗肿瘤活性初步鉴定 未知基因种群的活性蛋白具有优势，值得重视。 5. 致谢 感谢国家自然科学基金(No. 81102850)，广东省医 学科研基金(A2011434)，东莞市高等院校科研项目 基 金(No. 2011108102049)及广东医学院博士启动基金项 目(XB1106)给予本研究的支持。 参考文献 (References) [1] A. 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