 Bioprocess 生物过程, 2012, 2, 1-6 http://dx.doi.org/10.12677/bp.2012.21001 Published Online March 2012 (http://www.hanspub.org/journal/bp) Advance in Sequence Chemistry of High-Throughput DNA Sequencing by Synthesis* Jing Chen1, Pengfeng Xiao2 State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science and Medical Engineering, Southeast University, Nanjing Email: xiaopf@seu.edu.cn Received: Nov. 9th, 2011; revised: Nov. 21st, 2011; accepted: Dec. 5th, 2011 Abstract: High-throughput DNA sequencing, a revolutionized technology, greatly accelerated mining data from ge- nomes rapidly and cost-efficiently, thus have a profound impact on life sciences. Sequencing chemistry is a pivotal part of high-throughput DNA sequencing, and has been developed dramatically in recently years; a number of ingenious methods of novel sequencing chemistry by synthesis have been reported. In this paper, the development of high- throughput DNA sequencing chemistry by synthesis is reviewed. Keywords: Biochemistry; High-Throughput DNA Sequencing; DNA Sequencing-by-Synthesis; Sequencing Chemistry 高通量 DNA 合成测序化学研究进展* 陈 婧1，肖鹏峰 2 东南大学生物科学与医学工程学院，生物电子学国家重点实验室，南京 Email: xiaopf@seu.edu.cn 收稿日期：2011年11月9日；修回日期：2011 年11 月21 日；录用日期：2011年12月5日 摘 要：高通量DNA 测序是近年来发展起来的革命性技术，大大推动了快速、廉价获取基因组信息的能力，进 而对生命科学产生深刻的影响。测序化学是高通量DNA 测序的重要内容，且发展十分迅速；一些构思巧妙的新 颖测序化学方法被相继报道，本文综述了高通量DNA 测序化学的最新研究进展。 关键词：生物化学；高通量 DNA测序；合成测序；测序化学 1. 引言 高通量 DNA 合成法测序(DNA sequencing-by- synthesis (SBS))技术代表全基因组测序的巨大潜力 [1]，其测序化学的一个共同的策略是通过聚合酶反应， 即DNA 复制过程来实现的[2]。DNA 合成法测序技术 中最关键的步骤是如何实现有效的每次合成反应、以 及反应中对参与合成核苷酸类型的有效判读[3]：当核 苷酸完成有效合成后，要么通过反应实时释放出可识 别的分子(为了防止释放出可识别分子的相互干扰，每个 反应需要独立“反应池”)，或者标记可识别的分子从 而检测确定每个合成延伸过程中核苷酸掺入的情况 (标记可识别的分子掺入“固定”的合成链中，不造成 扩散，所有反应可在同一“反应池”完成)。合成测序 法可以分为单分子和多(拷贝)分子模板的方式。前者 称为单分子测序[4]，而后者是在同一区域[5]或者同一 微球上[6]扩增相同的模板，以获得数目众多的相同 DNA 片段作为合成测序的模板。检测可以是同步控制 的，即用以“停止–启动”相间隔的模式下促进识别 过程，这可以通过可逆封闭核苷酸底物或者简单地每 次只加一种核苷酸的方法来实现，或者是实时的，即 跟踪核苷酸的合成反应，快速识别合成过程中掺入的 *基金项目：国家自然科学基金资助项目(60971018)；江苏省自然科 学基金资助项目(BK2009273)。 Copyright © 2012 Hanspub 1  高通量 DNA 合成测序化学研究进展 核苷酸。前者最著名的例子是 454 的焦磷酸测序技术， 而后者则为 Solexa 测序技术最为典型。本文综述了近 年来高通量 DNA 测序化学的研究进展，尤其对一些 构思巧妙的新颖测序化学方法进行了重点介绍。 2. 基于独立“反应池”的高通量测序化学 2.1. 焦磷酸测序技术 最早实现高通量 DNA测序的报道是 2005 年454 公司[7] 采用焦磷酸测序化学技术[8] 的Genome Se- quencerTM 系统，该技术利用焦磷酸测序化学的优点， 即非标记的核苷酸允许原始 DNA 的合成，掺入后无 需化学去除步骤。因此，测序过程相对较快，且能实 现较长的读长，其阅读能力从最初只有100 bp，目前 平均已达到了 400 bp，很快能接近桑格技术目前的水 平，且第 400 个碱基的准确率能达到 99%。一次运行 所需时间为 10 小时，能获得 4~6亿个碱基的序列信 息。目前，Genome SequencerTM 系统已在生命科学研 究领域得到广泛应用，世界上几乎所有从事基因组测 序和相关结构功能研究的顶级实验室均配备了该类 设备。然而，圣路易斯市华盛顿大学医学院基因组测 序中心的负责人 Elaine Mardis表示，454 公司的基因 测序机器也有缺点。例如，在读取冗长的重复信息时 会出现准确性方面的问题[9]。最近 Wu 等人报道了一 种单个碱基延伸的焦磷酸测序技术来解决相同碱基 的重复片段问题的尝试研究[10]。他们首先合成了一套 3’端羟基封闭的dNTP 单体(图1)。这种单体在焦磷酸 测序体系中发生延伸反应后，由于 3’端羟基封闭而不 再进行后续碱基的延伸。而当该次碱基测定后，采用 化学或者光化学的方法将3’端羟基的封闭基团切除， 再进行下一个碱基的序列测定，由于该方法每次只延 伸一个碱基，即使相同碱基的均聚物片段，每个碱基 也只对应一个清晰的峰信号(图1)。通过这个方法得到 了比传统焦磷酸测序技术更清晰的序列。这种改良的 焦磷酸测序技术适合于芯片形式的高通量序列测定 模式，无疑是一种有益的尝试。 2.2. 离子半导体测序技术 dNTP 在DNA 聚合酶催化下发生聚合酶链式反 应，每合成一个 dNTP 便会产生相同摩尔数的焦磷酸 盐(PPi)，焦磷酸盐水解产生质子(H+)[11]，导致体系 pH Signal Intensity PPi Figure 1. Comparison of reversible terminator pyrosequencing using 3’-O-(2-nitrobenzyl)-dNTPs with conventional pyrosequencing using natural nucleotides 图1. 3’-O-烯丙基-dNTPs 的可逆终止焦磷酸测序法和使用常规 dNTPs 的传统焦磷酸测序法的结果比较。在可逆终止焦磷酸测序 法(a)中，均聚物的每个碱基均对应一个清晰的峰信号；而在的传 统焦磷酸测序法(b)中，每个均聚物只产生一个峰信号，很难准确 判断碱基数目的个数；(c) 3’-O-烯丙基-dNTPs 或者3’-O-(2-硝基 苯)-dNTP 的结构 值发生变化，且pH 值变化的程度产生焦磷酸盐的数 目相关，即与参加 dNTP合成的个数相关。因此，通 过检测延伸反应发生前后H+的变化，同样可以跟踪延 Copyright © 2012 Hanspub 2  高通量 DNA 合成测序化学研究进展 伸反应的情况。Life Technologies公司利用该原理发 展了离子半导体(Ion Torrent)测序技术[6,12]，即是通过 pH 敏感场效应晶体管阵列芯片检测DNA 聚合过程中 产生氢离子而实现DNA 序列的测定。Ion Torrent 测序 平台的核心是一块创新的半导体芯片，其中包含了数 百万个孔(反应池)和专有的大规模并行芯片传感器 (每个反应池对应一个检测器)。通过限制加入 dNTPs 的数量，即每次只加入单一的 dNTP来实施测序反应： 四个非修饰核苷酸(dATP，dGTP，dGTP，dTTP)按排 定的顺序，每次只加入一个，当加入的 dNTP 与模板 互补时，以单链 DNA 为模版的测序引物在 DNA polymerase 作用下发生合成反应，检测具有与参与合 成的 dNTP 数量具有定量关系的H+浓度(图2)。通过 使用由大约 1.68 μm × 1.3 μm的微孔反应池构成的阵 列，每个反应池固定含 DNA模板直径为 1 μm的微珠， 且底部有独立的传感器和电极，用来跟踪检测反应池 中的测序反应类型：当 dNTP 流经反应池时，如加入 的dNTP 与模板互补，杂交在单链 DNA模版的测序 引物便在 DNA polymerase作用下发生合成反应，并 随之产生具有定量关系的 H+，从而改变反应池 中的 pH 值，而 pH值的变化(∆pH)将导致反应池底部金属 –氧化物–传感层表面电势的变化，同时进一步引起 底部场效应晶体管终端的电压(∆V)的变化。与焦测序 技术相比，同样采用无修饰的核苷酸，且测序化学原 理更简单真实，能够在 2小时内获取从10 Mb 到1 Gb 以上的高准确序列。 Figure 2. Ion Torrent platform sequencing principle in single reaction cell 图2. Ion Torrent 测序平台单个反应池延伸反应及其测序检测原 理：当 dNTP 流经反应池并发生延伸反应，产生的 H+，从而改 变反应池中的 pH值(∆pH)，并将导致反应池底部金属–氧化物– 传感层表面电势的变化，同时进一步引起低部场效应晶体管终端的 电压(∆V)的变化。如果本次加入 dNTP发生 1个碱基的延伸， 则终端电压(∆V)的改变数值有一个确定数值(左)；如果本次加入 dNTP 发生 2个核苷的合成，则终端电压(∆V)的改变数值是发生 是1个核苷合成改变值的 2倍(右)。依照四个碱基单体(dATP， dGTP，dGTP，dTTP)每次加入一个单体的顺序不断循环，便实现 了每个反应池中模板序列的测序碱基不断增加 2.3. 荧光焦磷酸测序技术 2011 年哈佛大学化学与化学生物学系将末端磷 酸标记的荧光核苷酸与可重复密封的微反应器相结 合，开发出一种并行边合成边测序的新技术，其测序 原理见图 3[13]。该技术利用焦磷酸测序和半导体测序 中的优点，且克服了瞬时发光或电化学信号的检测需 要持续监控而限制通量，且往往不如荧光检测灵敏这 些不足。这种方法使用末端磷酸标记的荧光核苷 (TPLFNs)和焦磷酸测序流程，综合了可扩展性和快速 运行时间的特点。此外，微反应器流动室平台的试剂 消耗少，也很容易整合到传统微流体设备中进行样品 制备。他们使用的反应池是直径约5 μm的“微孔” 反应池阵列，固定DNA 模板的微珠为直径平均为2.8 μm，以保证每个反应池中只有一个(或者没有)微珠， 使其模板的唯一性得到保证。在微反应器中，依次加 入四个标记末端磷酸标记的荧光核苷中的一个，然后 密封微反应器：在 DNA 模板指导下，测序引物延伸 后的荧光图像被记录。他们证实了在10 分钟的循环 测序时间内，读长达 30 个碱基，且原始准确率约为 99%。 Figure 3. The structure of terminal phosphate-labeled fluorogenic nucleotides (TPLFNs) and the fluorogenic pyrosequencing chemistry 图3. 末端磷酸标记的荧光核苷(TPLFNs)结构与测序原理：在DNA 聚合酶的作用下，延伸引物以非荧光、四磷酸标记荧光核苷为底物 进行延伸合成反应，释放非荧光、荧光标记的焦磷酸盐，后者在磷 酸化酶的降解作用下产生荧光产物 Copyright © 2012 Hanspub 3  高通量 DNA 合成测序化学研究进展 这种荧光焦磷酸测序既保持了焦磷酸测序的好处，如 快速周转、单色检测等，又具有并行化的检测灵敏度 和简便性。值得称道的是该测序平台不需要像焦磷酸 测序和离子半导体测序平台中对每个“反应器”构 件对应的检测器，而是用一个成像设备完成所有“反 应器”测序反应的检测，因而更具有价格优势。 3. 基于平面平台的高通量测序化学 当同一时间只有一种类型的 dNTP 被合成上去， 由于被加入的 dNTP 类型可以事先知道，那么仅仅通 过相对简单的单色荧光检测就能判断合成是否发生。 但其不足包括下述二个因素：一是这种核苷酸3’端的 羟基往往是活性的，并不能限制测序引物链每次只进 行一个核苷酸的合成。因此，荧光光学法检测就不仅 需要判断合成是否进行，还需要建立合成核苷个数与 信号强度的定量关系；第二，每次只加入一种类型核 苷酸的合成反应，容易引起需要其它三种类型核苷因 为底物的缺失而造成的非特异合成，产生测序错误 [14-16]。代表合成测序巨大潜力的方法应该是：四种类 型的核苷酸同时加入反应中进行合成反应，以保障所 有的测序引物都有反应底物，降低错误合成的几率； 此外，每次合成还要求只延伸一个核苷酸，即测定一 个核苷序列，以避免需要建立复杂、有时甚至是模糊 不清的核苷合成个数与荧光强度的定量关系。图 4给 出了循环终止测序法使用的核苷酸单体结构，其分子 特征为：核苷酸单体的 3’端羟基被保护基团临时封 闭，每种单体在相应的碱基位置连接一个对应的荧光 基团；通过温和的反应可以将相应的基团切割，清除 荧光基团、活化 3’端羟基，以进行下一个核苷的测序 反应。循环终止测序法的好处法在于：1) 四个核苷酸 可以同时参与合成反应；2) 可以大规模并行进行；3) 不需要独立的“反应池”，具有更高的通量；4) 相同 碱基的重复片段可以通过终止法一个一个地进行阅 读。这类方法实施面临的重大挑战是：更为复杂的 3 端羟基临时封闭的标识核苷酸分子需要具有快速，有 效的脱保护动力学，在 DNA聚合酶的作用下显示出 有效的合成动力学，以及标记物所具有的特性(如荧光 基团具有良好的荧光特性等)。因为测序长度受控于 “整个”循环合成反应的效率(包括聚合反应和去封 闭反应的效率)。此外，其封闭基团在它掺入到延伸引 物后，还必须在温和条件下得以切除，否则可能很不幸 Figure 4. The structure of 3’-blocked reversible terminators- 2’-deoxythymine triphosphate (T) labelled with a removable fluorophore (Each of the four nucleotides have an equivalent structure to the one shown here, except for the different base and a corresponding base-specific fluor) 图4. 3’端羟基可逆封闭、修饰可切割荧光的 2’-胸腺嘧啶三磷酸(T) 核糖位置核苷的结构(不同碱基标记相应的荧光基团) 地干扰 DNA 聚合酶，核苷，寡核苷酸杂交的模板， 或者固相载体而影响循环测序反应的进行。目前主要 有三类 3’端羟基可脱保护的封闭基团：即 3’-O-烯丙 基基团，3’-O-叠氮甲基和 3’-O-氰乙基基团，且这三 类封闭基团均能通过化学反应将 3’ 临时保护基团和 荧光基团清除。 3.1. 3’-O-烯丙基保护的标记荧光核苷酸合成测 序 Ju 等人第一个报道了荧光标记的3’-O-烯丙基修 饰的 dNTP 合成方法[17-19]，并合成出一套测序反应单 体试剂。四个单体可以同时进行延伸测序反应，并在 本次测序完成之后，需要两个脱保护步骤来活化3’ 端 的羟基和清除荧光基团：用紫外光裂解荧光基团和钯 催化反应切割烯丙基团以恢复3’ 端的羟基。前面提 到，利用 355 nm的激光下辐射 10秒后荧光基团将被 裂解；Na2PdCl4的三苯基膦三磺酸盐溶液在 70℃下处 理30~90 秒，则3’端的烯丙基基团被切除，从而进行 下一个循环的测序反应。他们测定了14 个碱基的长 度。值得注意的是烯丙基基团的切割条件相对苛刻， 很难适合延伸引物非固定的合成测序模式。 3.2. 3’-O-叠氮甲基修饰核苷的合成测序 哥伦比亚大学的 Ju 研究组[20,21]报道了一种非荧 光标记的 3’-O-叠氮甲基封闭的脱氧核苷配合可切割 荧光基团标记的双脱氧核苷进行合成法测序列。该方 法很像传统的 Sanger 测序法中的延伸过程，被荧光标 记ddNTPs 合成的引物被永远终止继续延伸，而被合 成的 3’-O-叠氮甲基封闭的脱氧核苷在 3’端封闭基团 被脱保护后可以继续延伸：用 100 mM 的三(2-羰基乙 Copyright © 2012 Hanspub 4  高通量 DNA 合成测序化学研究进展 Copyright © 2012 Hanspub 5 基)磷盐酸盐(TCEP，pH 9.0)充满反应腔，并维持 65 ℃ 反应 10 分钟将参加延伸反应的荧光标记ddNTPs 中的 荧光基团和 3’-O- 叠氮甲基封闭的脱氧核苷中的保护 基团切割，以进行循环合成测序列，其序列测定长度 达到 30多个碱基。在上述 3’-O-叠氮甲基基团封闭的 脱氧核苷、配合可切割荧光基团标记的双脱氧核苷进 行合成法序列测定中，荧光基团标记的双脱氧核苷完 成该次测序后，其测序引物即被终止，换句话说，也 就是测序模板在不断减少，因而后续提供的测序信号 的强度也在不断减少，这将导致测序长度受到限制。 Solexa 公司集上述两组核苷优点于一身，开发出 的3’-O-叠氮甲基-2’脱氧核苷三磷酸(dNTPs) 已成功 用于商业化测序仪[5]。这类核苷的结构如图5所示： 核苷 3’端的羟基被可脱保护的叠氮甲基封闭，同时的 在连接荧光基团的连接臂上同样有一个可以被切割 的叠氮甲基基团。很明显，这类核苷延伸后的切割产 物均能够参与下一个碱基序的测定，无疑对增加测序 序列长度有好处。这样的结构设计将四个核苷同时进 行合成反应，避免了单个核苷反应可能引起的测序错 误。由于 3’-O-叠氮甲基-2’脱氧核苷三磷酸与非修饰 的核苷相比，其结构更为复杂，使用普通的聚合酶可 能影响其合成效率，而当这类标记核苷酸的合成效率 较低，将导致非同步延伸现象的累积越来越严重，进 而影响测序长度。他们使用9˚N DNA聚合酶来进行 该类核苷的延伸反应，以提高其合成效率，增加测序 长度。当用四色荧光标记的这类核苷完成一个测序反 应，利用三(2-羰基乙基)膦移除荧光基团，同时活化 出3端的羟基基团和切割荧光基团，以进行下一个循 环的延伸测序反应，目前以这套试剂为测序化学的 Illumina genome analyzer能够将序列长度达到 100 bp。 3.3. 3’-O-氰乙基保护的标记荧光核苷合成序列 2011年Knapp 等人报道了一类与 3’-O-叠氮甲基 具有同样功能的 3’-O-氰乙基可脱保护标记荧光核苷 的合成[22]。文章详细介绍了该类核苷的合成方法，其 最终产物的核苷结构如图6所示：核苷 3’端的羟基被 可脱保护的氰乙基封闭，同时的在连接荧光基团的连 接臂上同样有一个可以被切割的氰乙基基团：当用四 色荧光标记的这类核苷完成一个测序反应，并成像确 定各个模板对应的该次碱基信息后，同时活化出 3’的 羟基基团和切割荧光基团，以进行下一个循环的延伸 测序反应。他们使用 1:1 的四丁基氟化铵/四氢呋喃 Figure 5. Structure of the reversible terminator 3’-O-azidomethyl 2’-deoxythymine triphosphate (T) labelled with a removable fluorophore and the removal of the fluorophore and terminator group 图5. 荧光标记的3’-O-叠氮甲基-2’-胸腺嘧啶三磷酸(T)用三(2-羰基乙基)膦处理脱去荧光基团和解除 3’封闭基团。除了每个碱基和对应标记 的荧光基团不同外，其余三个核苷(A、G、C)具有类似结构 Figure 6. Structure of the reversible terminator 3’-O-(2-cyano-ethyl)-2’-deoxythymine triphosphate (T) labelled with a removable fluoro- phore and the removal of the fluorophore and terminator group 图6. 荧光标记的3’-O-氰乙基-2’-胸腺嘧啶三磷酸(T)用四丁基氟化铵/四氢呋喃和无水二甲亚砜的混合物脱去荧光基团和解除 3’封闭基团。 除了每个碱基和对应标记的荧光基团不同外，其余三个核苷(A、G、C)具有类似结构  高通量 DNA 合成测序化学研究进展 和无水二甲亚砜的混合物在45℃处理 15 分钟完成了 对荧光基团和 3’-O-2-氰乙基基团的切割，同时顺利完 成了下一个该类核苷的延伸反应。 4. 结论 高通量 DNA 测序技术是国际上近几年发展起来 的，已经成为生物和医学领域中发展最快、影响最大、 应用最为广泛的前沿高技术研究领域。高通量DNA 测序技术平台的核心是测序化学，新的测序化学方法 有可能催生成本更低、测序速度更快、准确度更高、 或者测序长度更长等特征的高通量 DNA测序技术平 台。本文综述了高通量 DNA合成测序化学的近年来 的最新研究进展，对理解和进一步深入研究高通量 DNA 测序技术提供借鉴。 5. 致谢 本实验由国家自然科学基金( 60971018) ，江 苏省 自然科学基金项目资助。特此感谢。 参考文献 (References) [1] J. Shendure, H. L. 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