¹贵州大学农学院，贵州 贵阳

²贵州省药用植物繁育与种植重点实验室，贵州 贵阳

³贵州省农业微生物特色重点实验室，贵州 贵阳

收稿日期：2022年3月29日；录用日期：2022年6月2日；发布日期：2022年6月10日

摘要

叶斑病是太子参叶部主要真菌病害，该病害的发生严重影响了太子参的品质及产量，为安全有效防治该病害，本研究通过施用诱抗剂及利用Illumina MiseqTM高通量测序技术，对诱抗剂的控病效果及叶际真菌群落结构进行研究。结果表明：各诱抗剂处理对太子参叶斑病均有一定的防效，最后1次施药后10 d，草酸(CS)、芸苔素内脂(YT)及碧护(BH)处理的诱抗效果分别为72.69%、70.18%、39.79%。从供试样品中共获得88,276条有效序列，经序列聚类分析获得993个OTUs，涵盖了子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)等7个菌门、17纲、41目、78科、85属、86种的真菌，各处理优势菌门均为子囊菌门(Ascomycota)，其次为担子菌门(Basidiomycota)；优势菌属为链格孢属(Alternaria)，其次为茎点霉属(Phoma)。与CK (清水对照)相比，YT、CS处理增加了Cladosporium、Sarocladium等有益菌属的相对丰度，各诱抗剂处理均不同程度降低了叶斑病致病菌属Alternaria及Phoma的相对丰度。α多样性分析结果表明各处理间Shanno、Simpson及Chao指数虽没有显著性差异，但与CK相比，诱抗剂处理一定程度上增加了太子参叶际真菌群落的多样性及丰富度。研究结果表明喷施诱抗剂可改变太子参叶际真菌群落结构组成，提高有益菌属含量，为太子参叶斑病绿色防治提供一定的理论依据。

关键词

太子参叶斑病，诱导抗病性，高通量测序，真菌群落多样性

Effects of Inducers on the Control Efficacy of Pseudostellaria heterophylla Leaf Spot and Fungal Community Structure of the Phyllosphere

Shuang Liang¹, Jie He¹, Zhi Zhao², Zhong Li^1,3*

¹College of Agriculture, Guizhou University, Guiyang Guizhou

²Guizhou Key Laboratory of Propagation and Cultivation on Medicinal Plants, Guiyang Guizhou

³Guizhou Provincial Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Guiyang Guizhou

Received: Mar. 29^th, 2022; accepted: Jun. 2^nd, 2022; published: Jun. 10^th, 2022

ABSTRACT

Leaf spot is the main fungal disease, which seriously affects the quality and yield of Pseudostellaria heterophylla. In order to control this disease safely and effectively, in this study, the inducers and Illumina MiseqTM high-throughput sequencing technology were used to study the control efficiency of the inducers and the leaf fungal community structure of the Pseudostellaria heterophylla. The results showed that: There was certain control efficiency on Pseudostellaria heterophylla leaf spot among all inducers treatments, and 10 days after the last application, the induced resistance effects of the treatments with Oxalic acid (CS), Brassinolide (YT) and Bihu (BH) were 72.69%, 70.18%, 39.79% respectively. A total of 993 OTUs were obtained by sequence cluster analysis in all samples, which were distributed in 7 phyla, including Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, etc, 17 classes, 41 phyla, 78 families, 85 genera, and 86 species. The dominant bacteria phyla in each treatment are Ascomycota, followed by Basidiomycota; the dominant genus is Alternaria, followed by Phoma. Compared with CK, YT and CS treatments increased the relative abundance of beneficial bacteria, such as Cladosporium and Sarocladium. Otherwhise, various inducers treatments have reduced the relative abundance of pathogenic bacterias, like Alternaria and Phoma. The results of α diversity analysis showed that although there were no significant differences in Shanno, Simpson and Chao indexes among the treatments, the inducers increased the diversity and richness of fungal community in the phyllosphere of Pseudostellaria heterophylla to a certain extent compared with CK. The research results showed that spraying inducers can change the composition of the fungal community structure in the leaf area of Pseudostellaria heterophylla, increasing the content of beneficial bacteria and providing a theoretical basis for the green control of Pseudostellaria heterophylla leaf spot.

Keywords:Pseudostellaria heterophylla Leaf Spot, Induced Disease Resistance, High Throughput Sequencing, Diversity of Fungal Communities

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1. 引言

太子参[Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax]又名孩儿参、米参、童参等，系石竹科(Caryo phllaceae)孩儿参属(Pseudostellaria)植物 [1]，为我国1种传统中药材，有益气健脾、润肺生津的功效 [2]。叶斑病是太子参叶部主要真菌病害之一，近年来，由于规模化种植该病害发生较为严重，研究表明贵州省余庆县5月份田间病株率高达100%，6月初病情指数达83.5% [3]，施秉县田间发病率达80%以上 [4]，产量损失达50%。目前太子参叶斑病主要以化学防治为主，但不同地区报道的病原菌有所不同，增加了对该病害的防治难度。据报道，太子参叶斑病病原菌有茎点霉属真菌Phoma sp. [5]、叶点霉属真菌Phyllosticta commonsii [6]、壳针孢属真菌Septoria sp. [7]、壳二孢属真菌Ascochyta versabilis [8]。本项目组前期研究贵州省施秉县太子参叶斑病的优势病原菌为链格孢(Alteraria spp.)，由于叶斑病病原菌种类较多，常用的化学药剂难以奏效，此外长期使用化学药剂会产生抗药性、环境污染等问题，甚至影响环境微生物的平衡 [9]，因此寻求新的防治方法势在必行。相关研究表明病原菌的侵入通常会导致叶际微生物群落结构发生改变，而叶际微生物群落结构的稳定直接影响着植物健康 [10]，近年来高通量测序技术被广泛应用于探究病害和微生物群落多样性的研究中 [11] [12]，为植物病害防治提供了新的思路。有研究报道人为施加农药或微生物会改变植物叶际微生物群落结构组成 [13]，而施加化学农药对植物叶际微生物影响较大 [14]，杜威 [15] 等研究表明喷施化学农药不仅对叶际微生物影响较大，且会降低水稻叶片的抗氧化酶活性，而微生物菌剂对环境的兼容性良好，研究更为广泛，李审微等 [16] 研究表明枯草芽孢杆菌M-23能增加叶际有益菌的比例，降低柑橘砂皮病的病情指数；张春怡等 [17] 研究表明土壤消毒结合微生物菌剂能改变土壤真菌群落结构使茄子黄萎病得到有效防控。植物免疫诱抗剂作为生物防治的1种，其主要通过激发植物自身的免疫系统增强抗病和抗逆能力 [18]，由于诱抗剂不直接作用于病原菌，对于诱抗剂的喷施会对植物微生物的群落结构组成产生怎样的影响尚不明确。本研究在前期试验基础上，通过田间小区试验，探究了3种诱抗剂对太子参叶斑病的田间控病效果，并利用Illumina MiseqTM高通量测序技术分析诱抗剂处理后对太子参叶际真菌群落结构的影响，为诱抗剂控制太子参叶斑病的微生态机制提供参考。

2. 材料与方法

2.1. 供试作物、菌株及诱抗剂

供试植物为太子参(Pseudostellaria heterophylla)“施太1号”；供试病原菌为太子参叶斑病病原菌细极链格孢(Alteraria tenuissima)，由前期试验分离保存；芸苔素内脂(0.01的可溶性液剂)购自河南中浪农业科技有限公司，草酸(分析纯)购自天津市化工三厂有限公司，碧护(0.136%赤·吲乙·芸苔)购自德国阿格福莱农林环境生物技术股份有限公司。前期试验表明芸苔素内脂、草酸在一定浓度下对细极链格孢(Alteraria tenuissima)的菌丝生长及孢子萌发均无显著抑制作用，碧护有一定的抑制作用，但抑制率较低。

2.2. 试验设计及样品采集

试验地位于贵州省施秉县云台山太子参种植基地，海拔670 m，土壤肥力中等，前作为太子参。在前期试验基础上，试验地设置4个处理，分别为草酸0.4 g/L (CS)、芸苔素内脂1000倍液(YT)、碧护20,000倍液(BH)、以及清水作为对照，每处理约8 m²，各区组随机排列，每处理设置3次重复。于2020年3月25日第1次施药，以后每隔7 d施药1次，连续3次，各处理均为叶正反面均匀喷施，试验期间供试小区未使用任何杀菌(虫)剂。分别于最后1次施药后10 d、20 d、35 d进行田间叶斑病病害调查，每处理调查3个点，每个点调查60株，记录总叶数和各级病叶数，计算病情指数及诱抗效果。分别于最后1次施药后10 d、20 d、35 d采集各处理叶片，分别将CS、YT、BH及CK处理(以三个时间段分别编号为CK1、CK2、CK3；YT1、YT2、YT3；CS1、CS2、CS3；BH1、BH2、BH3)的样本送至北京诺禾致源股份有限公司进行高通量测序。采集方法为剪刀经酒精消毒后随机采集各处理的病叶，每个处理4个重复，装入灭菌采样袋中立即放入液氮中速冻，立即带回实验室放入−80℃冰箱内备用。

太子参叶斑病分级标准：0级：无病斑；1级：病斑小而少，病斑面积占整个叶片面积的5%以下；3级：病斑小而多，或大而少，病斑面积占整个叶片面积的6%~10%；5级：病斑大而较多，病斑面积占整个叶片面积的11%~20%；7级；病斑大而多，或多个病斑连成大病斑，病斑面积占整个叶片面积的21%~50%；9级：病斑面积占整个叶片面积的51%以上。

病情指数：∑(病级叶数 × 代表数值)/叶数总和 × 发病最重级的代表值 × 100。

诱导效果：(对照病情指数 − 处理病情指数)/对照病情指数 × 100%。

2.3. 诱抗剂对太子参病叶真菌群落结构的影响

2.3.1. 样品DNA的提取及PCR扩增

采用CTAB法提取样品总基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度(A260/A280值在1.8~2.0间)，根据浓度用无菌水稀释至1 ng∙L⁻¹。采用ITS引物515F(5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)进行PCR扩增。PCR反应总体系为30 μL：包括2 × Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 15 μL，上下游引物各3 μL，gDNA (1 ng/μL) 2 μL，ddH₂O补足到30 μL。PCR扩增条件为98℃预变性1 min；98℃变性10 S，50℃退火30 S，72℃延伸30 S，30个循环；72℃延伸5 min。反应结束后用GeneJET胶回收试剂盒纯化产物。利用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒进行文库构建并使用IonS5XL测序系统进行上机测序等操作(以上步骤均由北京诺禾致源科技股份有限公司完成)。

2.3.2. 下机数据质控与统计分析

将下机数据导出fastq文件，为原始数据(Raw Reads)。根据barcode序列对各样本数据进行区分，其中barcode序列的允许错配数为0，最大引物错配数为2。然后用Cutadapt质控软件(V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)对数据进行质控，使用UCHIME (UCHIME Algorithm, http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)进行嵌合体过滤得到有效数据。用Uparse (version v7.0.1001)对所有样本的Effective Tags以97%的一致性(Identity)进行OTUs (Operational Taxonomic Units)聚类，用Mothur方法与SILVA (http://www.arb-silva.de/(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库对OTUs的代表序列进行物种注释分析(设定阈值为0.8~1)，得到每个样品的OTUs和分类谱系的基本分析结果，再使用Qiime软件(Version 1.9.1)对OTUs进行丰度、Alpha多样性指数等分析，同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析 [19]。以上分析均在北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

2.4. 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2007软件对高通量测序数据进行整理，将其复制至SPASS20.0软件数据处理窗口利用Duncan新复极差法进行单因素方差分析，显著水平P < 0.05。

3. 结果与分析

3.1. 供试诱抗剂对太子参叶斑病田间控治效果

最后1次施药后10 d，与CK相比，各诱抗剂处理均降低了太子参叶斑病的病情指数，其中CS处理诱抗效果最高，达72.69%，其次为YT处理，诱抗效果为70.18%，BH处理的诱抗效果低于40%，因此未列入第2次田间调查。最后1次施药后20 d，各处理诱抗效果均有所下降，其中CS处理其诱抗效果下降了7.27%，YT处理诱抗效果下降了2.47%。最后1次施药后35 d，各处理诱抗效果均低于30% (见表1)。

3.2. 测序数据统计及α多样性分析

数据经处理后，平均每样品测得90,385条tags，经过质控平均得到88,276条有效数据，质控有效数据量达64,878，序列经过过滤拼接，去除疑问序列及错误序列，将相似度大于97%的序列归为同一分类操作单元，共获得993个OTUs，这些OTUs对应的菌群涉及7个门、17个纲、41个目、78个科、85个属、86个种的真菌，各样品OTU数目在各分类单元的分布情况见表2。

表1. 供试诱抗剂对太子参叶斑病的田间防治效果

Alpha多样性用于分析样品内(within-community)的微生物群落多样性，包括Shannon、Simpson、Ace指数和Chao指数。其中Shannon、Simpson为多样性指数，反映种群的多样性；Ace、Chao为丰富度指数，用于反映种群的丰富度，各数值越大，说明其相应的群落丰富度、均匀度和多样性越高。在最后1次施药后10 d，与CK相比，各诱抗剂处理的多样性指数与丰富度指数均没有显著性差异，表明诱抗剂处理对太子参叶际真菌群落结构没有显著性影响，其中CS处理的多样性指数最高，表明该时间段CS处理下真菌群落多样性最高，分布最均匀；CK的丰富度指数最高，表明该时间段CK处理物种最丰富；最后1次施药后20 d CK处理的多样性指数和丰富度指数均最高；最后1次施药后35 d BH、YT处理的多样性指数高于CK；YT、CS处理的丰富度指数高于CK (见表3)，但处理间均没有显著性差异。综合来看诱抗剂处理与CK相比没有显著性差异，但一定程度上增加了物种多样性及丰富度。各处理覆盖度指数(Coverage index)均到达了0.999以上，表明测序结果合理。

表2. 各处理太子参叶际真菌群落各级别分类单元数量

表3. 不同组别真菌群落Alpha多样性指数(OTU level)

3.3. 不同样品真菌物种Venn图分析

Venn图(见图1)直观地展现了不同处理样品间共有的和特有的OTU数量，特有的OTU数量越多，表明该处理下群落结构越丰富，于最后1次施药后10 d，CS处理特有的OTU数最多，为83，表明该时间段内，CS处理特有的微生物种类最多，物种群落结构最丰富；最后1次施药后20 d，CK2处理特有的OTU最多，为124；最后1次施药后35 d，BH、CS处理特有的OTU均高于CK，预示着该时间段诱抗剂处理含有较多的特有微生物种类，物种更为丰富。

图1. 维恩图显示了特有的和共有的OTU

3.4. 不同诱抗剂处理对太子参叶际真菌群落结构的影响

各处理不同时间段在门水平上真菌群落组成差异明显(见图2)，共检测到8个菌门，包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、毛霉菌门(Mucoromycota)、Mortierellomycota、Monoblepharomycota、Olpidiomycota、Rozellomycota，其中占主要地位的为Ascomycota和Basidiomycota，对比诱抗剂处理和CK处理的样品真菌群落组成，整体上看没有明显影响，但在各菌门中所占比例不一。最后1次施药后10 d、20 d，CK的Ascomycota含量均最高，相对丰度分别为56.79%、65.04%，最后1次施药后35 d CS3的Ascomycota含量最高，为78.91%，3个时间段BH处理的Ascomycota含量均最低；最后1次施药后10 d CS1的Basidiomycota丰度最高，为39.36%，20 d时YT2的Basidiomycota的相对丰度最高，为22.26%，35 d时BH3的Basidiomycota相对丰度最高，为7.84%。

图2. 不同组别门水平上的相对丰度

属水平上，相对丰度处于前10的属有链格孢属(Alternaria)、茎点霉属(Phoma)、Papiliotrema、枝孢属(Cladosporium)、葡萄孢属(Botrytis)、Udeniomyces、Cadophora、帚枝霉属(Sarocladium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、曲霉属(Aspergillus) (图3)，各属在不同处理中均有分布，但所占比例不同。最后1次施药后10 d CK1的优势菌属为Alternaria，相对丰度为27.97%，其次为Cryptococcus (8.98%)；YT1与CK1相比有所差异，优势菌属为Sarocladium，相对丰度为15.28%，其次为Botrytis (7.32%)；CS1的优势菌属为Botrytis，相对丰度为15.74%，其次为Udeniomyces (15.58%)；BH1的优势菌属为Botrytis (8.44%)、其次为Sarocladium (5.35%)。最后1次施药后20 d，以Alternaria含量变化较大，CS2、BH2的优势菌属变为Alternaria，且含量较第1时间段增加，相对丰度分别为27.15%、17.92%，其Phoma含量变化不大。YT2处理的优势菌属为Cladosporium (18.74%)，其次为Alternaria (13.78%)。CK2的优势菌属为Phoma，相对丰度为30.84%。最后1次施药后35 d各处理的优势菌属变化较为明显，CK3、CS3、BH3的优势菌属均为Phoma，相对丰度分别为20.87%、53.12%、14.72%，YT3的优势菌属为Alternaria (19.97%)，其次为Cladosporium (12.78%)，其他各属在各样品中的含量均较低，相对丰度在0.03%~5.88%之间。为了进一步研究属水平物种的系统进化关系，通过多序列比对得到top 100属的代表序列构建的系统发育树，可更加直观地看出各个菌门中优势菌属情况(见图4)。

4. 讨论

近年来，植物免疫诱抗剂在植物病害的防控上取得了较大进展，主要集中于诱抗剂的筛选 [20]、诱抗剂诱导抗病性的生理生化机制和分子机制等方面的研究 [21] [22]，而对于诱抗剂是否会影响植物叶际真菌群落结构的组成还尚未清楚。本研究在前期基础上选择了3种诱抗剂进行研究，田间病害调查结果显示

图3. 不同组别属水平上的相对丰度

图4. 前100属水平物种系统发育树

这3种诱抗剂对太子参叶斑病均有一定的控制效果，以草酸0.4 g/L及芸苔素内脂1000倍液处理效果最好，碧护20,000倍液处理较差，最后1次施药后10 d其诱抗效果分别为72.69%、70.18%、39.79%。高通量测序结果中，Alpha多样性指数表明最后1次施药后10 d，CS的物种多样性指数高于CK，说明喷施草酸后增加了太子参叶面物种多样性，最后1次施药后20 d各处理物种多样性及丰富度指数均低于CK，可能的原因是突然大量喷施刺激物，影响了一些微生物在叶面的定植，导致其物种数目降低，该结果与Zhang等 [23] 喷施生防菌后相似。最后1次施药后35 d，约为5月中旬，是太子参叶斑病发病高峰期，各处理的物种多样性及丰富度均高于CK，表明诱抗剂处理能有效调节太子参叶面群落结构组成，增加真菌群落丰富度和多样性。

物种群落组成结果表明子囊菌门及担子菌门是各处理共有的优势菌门，与大多植物叶斑类病害结构相似，如新疆枣黑斑病、烟草赤星病等 [10] [24]，其中子囊菌门真菌常引起植物根腐、茎腐、果(穗)腐、枝枯和叶斑等病害 [25]。与CK相比，本研究中诱抗剂处理在最后1次施药后10 d、20 d均不同程度降低了子囊菌门的相对丰度。在属水平上，Alternaria和Phoma为优势菌属，且均可引起多种植物的叶斑病，其中茎点霉属是太子参叶斑病的致病菌，本研究前期多次分离鉴定贵州省施秉县太子参叶斑病为链格孢属真菌，期间并未分离到茎点霉属真菌，表明链格孢属真菌为该地的优势菌株。在最后1次施药后10 d，CK1的Alternaria含量显著高于其他处理，相对丰度为27.97%，YT1、CS1、BH1相对丰度均低于5%。CS1的Cladosporium、Udeniomyces、Cryptococcus相对丰度均高于其他处理，据研究表明这几种属1般不侵染植物引起病害，其中Cladosporium还能促进植物生长 [26]，且对其他植物内生真菌有拮抗作用 [27]，YT1的Sarocladium、Papiliotrema含量最高，经研究表明Sarocladium能防治多种农林害虫，也是1种抑制多种植物病原真菌生长的拮抗真菌 [28]，而Papiliotrema大多为有益菌。在最后1次施药后20 d，CK2的Alternaria含量较CK1有所降低，而Phoma含量增加到30.84%，其他各处理Phoma含量均低于3%，表明各处理降低了Phoma的含量，可能是由于诱抗剂的喷施抑制了茎点霉菌的生长。最后1次施药后35 d，太子参叶斑病达到发病高峰期，YT3的Alternaria含量最高，达19.97%，其次为CK3，CS3的Phoma含量最高，为53.12%，且CS3、YT3、BH3处理的Phoma含量增加，可能的原因是各处理药效降低，也有可能是该属真菌主要在太子参叶斑病发病后期在叶片定植。

本项研究结果表明诱抗剂能降低太子参叶斑病的病情指数，且能改变叶面真菌群落结构，能增加某些有益菌属的含量，降低致病菌属含量，但其诱抗剂防治太子参叶斑病的机理是否与其叶面真菌群落结构的改变有着直接的联系还需要进一步进行研究。此外诱抗剂的诱导抗病机理是由多种因素共同决定的，下一步有待于完善对细菌群落结构的改变以及分子机理等方面的研究。

文章引用

梁 霜,何 洁,赵 致,李 忠. 诱抗剂对太子参叶斑病防效及叶际真菌群落结构的影响
Effects of Inducers on the Control Efficacy of Pseudostellaria heterophylla Leaf Spot and Fungal Community Structure of the Phyllosphere[J]. 生物过程, 2022, 12(02): 89-98. https://doi.org/10.12677/BP.2022.122010

参考文献