¹福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州

²广州市花都区人民医院，广东 广州

收稿日期：2022年2月17日；录用日期：2022年3月3日；发布日期：2022年3月10日

摘要

【目的】应用网络药理学的方法探讨畅脉乐I号胶囊(CML)治疗动脉粥样硬化(AS)的作用机制。【方法】通过TCMSP、Genecards、OMIM和DisGeNET数据库结合文献检索获取CML活性成分与靶点及疾病相关靶点，经Uniprot数据库对选取靶点标准化后利用jvenn筛选成分基因与疾病基因的交集基因，导入Cytoscape3.8.2软件构建活性成分–疾病靶点网络与靶点间蛋白–蛋白相互作用(PPI)网络；通过Metascape平台对交集基因进行基因本体(GO)富集分析以及京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。【结果】筛选出CML活性成分116个活性成分及480个成分靶点，AS疾病靶点2358个，主要活性成分为槲皮素、白藜芦醇、刺芒柄花素、木犀草素、异鼠李素、黄芩素、丹参酮II等。将药物靶点与疾病靶点取交集共得到182个交集基因，用交集基因构建PPI网络。这些基因主要与细胞对脂质的反应、对氧气水平的反应、对细胞因子的反应等生物进程有关，它们的分子功能主要与激酶结合、DNA结合转录因子结合、蛋白质同二聚化活性、蛋白质结构域特异性结合等相关，主要富集在膜筏、转录调节复合物、受体复合物等部位。【结论】CML通过多成分、多靶点以及多途径参与防治AS过程，其药效物质AGE-RAGE信号通路、FoxO信号通路、NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路等发挥效应，以上数据为CML进一步的临床应用及基础研究提供参考依据。

关键词

畅脉乐I号胶囊，动脉粥样硬化，网络药理学

Network Pharmacological Mechanism of Chang Mai-Le I Capsule in the Treatment of Atherosclerosis

Kuan Zhang¹, Ning Luo², Hua Ye¹

¹The Second Affiliated Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou Fujian

²Huadu District People’s Hospital of Guangzhou, Guangzhou Guangdong

Received: Feb. 17^th, 2022; accepted: Mar. 3^rd, 2022; published: Mar. 10^th, 2022

ABSTRACT

Objective: To apply the method of network pharmacology to explore the mechanism of Chang Mai-Le I Capsule (CML) in the treatment of atherosclerosis (AS). Methods: The active ingredient-target and disease-related targets of CML were obtained through TCMSP, Genecards, OMIM and DisGeNET databases combined with literature search, and the selected targets were standardized by Uniprot database and then screened by jvenn for the intersection of ingredient genes and disease genes, and imported into Cytoscape 3.8.2 software to construct the active ingredient-disease target network and target network. The intersecting genes were enriched for gene ontology (GO) and Kyoto Gene and Genome Encyclopedia (KEGG) pathways through the Metascape platform. Results: The 116 active ingredients and 480 component targets of CML were screened, and 2358 AS disease targets were identified, with the main active ingredients being quercetin, resveratrol, prickly mangosteen, lignan, isorhamnetin, baicalin and tanshinone II. A total of 182 intersecting genes were obtained by taking the intersection of drug targets and disease targets, and the intersecting genes were used to construct the PPI network. These genes were mainly related to biological processes such as cellular responses to lipids, responses to oxygen levels, and responses to cytokines. Their molecular functions were mainly related to kinase binding, DNA-binding transcription factor binding, protein homodimerization activity, and protein structural domain-specific binding, and were mainly enriched in sites such as membrane rafts, transcriptional regulatory complexes, and receptor complexes. Conclusion: CML is involved in the prevention and treatment of AS through multiple components, multiple targets and multiple pathways, and its pharmacological substances AGE-RAGE signaling pathway, FoxO signaling pathway, NF-κB signaling pathway and JAK-STAT signaling pathway exert effects. The above data provide a reference for further clinical application and basic research of CML.

Keywords:Chang Mai-Le I Capsule, Atherosclerosis, Network Pharmacology

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是导致心脑血管疾病如急性冠状动脉综合征及脑卒中的病理基础 [1] ，已成为严重危害人类健康的主要疾病之一。AS通常保持“临床沉默”，大多数急性脑血管事件均是由于易损斑块(vulnerable plaque, VP)破裂及继发血栓形成所致 [2] 。如何促进VP稳定，延缓AS进程，从而减少急性心血管事件的发生是当今心血管疾病研究领域的重点方向。目前，在治疗AS方面主要以他汀类西药为主要治疗药物，虽能显著降低心血管事件的发生率，但患者长期使用有肝脏损害的风险以及横纹肌溶解等副作用发生的风险，导致AS患者依从性差，疗效欠佳 [3] 。长期临床实践证明，中医药在防治AS等疾病方面具有多靶点调节、毒副作用小、疗效显著等优点。因此，加强中医药防治AS的研究具有重要意义。

根据疾病受累部位及临床表现，AS可归于“痰浊”“胸痹”“眩晕”“真心痛”“中风”等中医病名 [4] ，中医学者大多认为其主要病机为痰瘀互结、化热成毒、损伤络脉，因此临床应用中药处方排兵布阵时常选用补气类中药配合濡养脉络的药物，同时兼以活血化瘀药物配伍使用，兼顾活血、健脾、调肝等。基于中医理论，我院心内科团队拟定了化瘀、祛痰、通络补肾的治法，进而组成畅脉乐处方，经院制剂室加工后制成胶囊剂型——畅脉乐I号胶囊(CML) (闽药制字Z05104025)，临床应用已经二十载，在防治AS方面取得显著疗效，但其作用机制尚未阐明。

网络药理学在挖掘药物与疾病之间存在的潜在相关性上具有一定优势，且其基于“疾病–基因–靶点–药物”的可视化网络构建也与中药复方多成分、多靶点的特点高度契合。因此，本研究拟采用网络药理学技术对CML防治AS的机制进行研究，为后续的动物实验及细胞实验提供参考数据。

2. 材料与方法

2.1. CML活性成分及靶点筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP) [5] (https://tcmsp-e.com/)，选择“herb name”，依次输入CML中所含药味进行检索，根据ADME参数进行对其有效成分进行筛选，筛选的条件设为口服利用度(OB) > 30%，类药性(DL) > 0.18 [6] ，并基于TCMSP靶点预测模型对筛选的活性成分潜在作用靶点进行预测；由于天麻和何首乌两味中药在TCMSP中未收录，因此，通过检索已发表相关文献，归纳其有效成分，通过SwissADME [7] 画出成分结构图，得到SMILES值，根据GI absorption为HIGH且类药性中至少有两项达到“yes”为条件进行筛选，筛选后的有效成分根据SMILES值应用Swiss Target Prediction [8] 预测其靶点。在Uniprot蛋白质数据库 [9] (https://www.uniprot.org)将化合物作用的蛋白质靶点转化为基因简称。

2.2. AS相关靶点搜集

以“Coronary atherosclerosis”、“atherosclerosis”为关键词，从TCMSP、Genecards疾病基因数据库 [10] (https://www.genecards.org/)、OMIM数据库 [11] (https://www.omim.org/)、DisGeNET数据库 [12] (https://www.disgenet.org/home/)中搜集相关疾病靶点。DisGeNET的结果通过设定Scoregda进行筛选，Genecards的结果通过设定Relevance score进行筛选。合并数据库的筛选结果并去除重复值，通过Uniprot数据库将靶点标准化。

2.3. CML“ingredient-AS”网络构建

为明确CML活性成分与AS靶点之间的关系，利用jvenn [13] 在线工具(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)绘制韦恩图，获得活性成分靶点与AS疾病靶点的交集靶点。将CML活性成分与交集靶点整理为network文件及type文件，分别导入Cytoscape3.8.2 [14] 软件进行可视化网络构建，根据连接度(degree)值过滤CML中重要的成分及靶点，并分析两者存在的相互关系。

2.4. CML活性成分与AS靶点PPI网络构建

应用String数据库构建蛋白质互作(protein-protein interaction，PPI)网络。

2.5. CML活性成分AS靶点GO和KEGG通路富集分析

应用Metascape [15] 平台对交集靶点进行GO及KEGG分析，分析CML活性成分抗AS主要的生物学进程与代谢通路。

3. 结果

3.1. CML活性成分筛选与靶点获取

通过ADME参数OB和DL结合相关文献的补充，最后筛选得到116个活性成分和480个靶点，见表1。

表1. CML活性成分(degree值排名前20)

注：1-赤芍；2-丹参；3-葛根；4-郁金；5-黄芪；6-天麻；7-何首乌。

3.2. AS靶点搜集

通过关键词检索，在DisGeNET数据库设定Score_gda ≥ 0.8、Genecards数据库设定Relevance score > 10为过滤条件筛选AS潜在靶点，并结合OMIM数据库、TCMSP数据库进行补充，合并数据后删除重复值后共获得AS疾病靶点2358个。

3.3. CML“ingredient-AS”网络构建

CML活性成分靶点与AS的交集靶点182个，韦恩图见图1。将交集靶点导入Cytoscape3.8.2软件中，构建CML“ingredient-AS”可视化网络，如图2所示。该网络包含289个节点(node)，1268个边(edge)。节点代表CML中的活性成分，而边表示线两个节点之前的关系。图形颜色由“蓝–绿–黄–橙”表示degree由小到大，右侧环形区域内长方形靶点为设定degree > 5筛选的关键靶点。

图1. 药物靶点与疾病靶点韦恩图

图2. CML “ingredient-AS”网络

3.4. CML活性成分与AS靶点蛋白质互作网络构建

利用String数据库构建PPI网络，由CML活性成分靶点与AS靶点提取到的交集基因可得到182个节点和4203个关系线(图3)。

图3. PPI网络

3.5. GO和KEGG通路富集分析

通过Metascape平台对交集基因进行基因本体论(GO)分析与京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，GO分析包括的生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)。富集结果选取Log10(P)值排名前20的结果将其进行可视化(图4)，条形颜色由黄到棕代表Log10(P)值从小到大，纵轴代表富集信息。

图4. KEGG通路(A)和GO富集(B)

4. 讨论

CML由黄芪、制首乌、天麻、丹参、郁金、赤芍、葛根组成，方中黄芪补中益气，通畅血脉，制首乌功擅补肝益肾、填精养血，固肾乌发以治本，共为君药，丹参活血化瘀，通脉调经为臣，郁金理肝气祛痰，葛根升阳、强心，赤芍凉血散瘀止痛，全方补肾益气以治本，化瘀通脉以治标，标本兼顾，攻补兼施，共同达到肾精充足、痰散瘀化、络道通畅的目的，在临床除了用于AS防治外，还可用于中风后遗症，疗效显著。

基于其良好的临床效果，我院团队也积极对CML展开了研究并发现其具有减小斑块面积、改善血流动力学、减轻血管内皮损伤等作用 [16] [17] [18] [19] 。陈美华主任等通过彩超分别检查服用CML半年的颈部AS患者，发现其颈动脉内–中膜厚度(IMT)减小及斑块消退；其后又通过临床试验发现，畅脉乐胶囊联合氟伐他汀疗效较单用氟伐他汀治疗颈部AS疗效显著，且更安全、副反应小；林建著等通过细胞实验证明CML可以减少内皮损伤，近期谢胜伟等又发现CML可通过抑制大鼠Wnt信号通路中Wnt1、β-catenin、dvl-1的表达改善血管内皮损伤进而减轻AS程度。虽然对于CML在AS方面的研究现已取得一定成果，但仍有许多问题亟待解决。因此拟通过网络药理学的手段挖掘CML的活性成分、作用靶点及机制，为进一步优化其胶囊制剂的质量标准以及全面阐明CML作用机制提供前期数据。

4.1. CML活性成分分析

由表1和图2可知，CML中治疗AS的活性成分主要贡献前10者依次为：槲皮素、白藜芦醇、刺芒柄花素、木犀草素、山奈酚、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、柚皮素、异鼠李素、黄芩素、丹参酮II，主要来源于黄芪、首乌，佐证了黄芪和首乌作为君药在临床治疗中的重要性，也体现了补肾益气为本的组方特点，而活血药丹参虽然贡献值低于黄芪，但是其活性成分整体占比较高，用于辅佐君药发挥作用，同时其他各药也均有不同成分在治疗AS中产生药效，体现了中医治疗的整体性原则。

槲皮素是多种慢性炎症疾病的靶点如心脑血管疾病、糖尿病等，其在抗AS方面的活性很早就被证实 [20] 。AS所涉及的炎症机制非常复杂，泡沫细胞在其进展过程中发挥了不可或缺的作用。研究发现：槲皮素可减轻ApoE^-/-小鼠AS病变和脂质积累并通过巨噬细胞中Gal-3-NLRP3促炎信号通路，阻止泡沫细胞的形成，发挥抗AS作用 [21] 。氧化应激诱导的内皮细胞损伤是AS重要始动的因素，白藜芦醇可以通过TyrRS-PARP1途径减轻人脐静脉内皮细胞氧化损伤 [22] 。泡沫细胞的形成取决于脂质摄取和外排之间的内稳态，这主要由巨噬细胞清净受体决定，如SRA。刺芒柄花素可以增强AS斑块的稳定性，同时减少泡沫细胞的形成，该过程通过调控KLF4-SRA轴来实现 [23] 。异鼠李素具有抗氧化、保护内皮细胞、抑制内皮细胞与单核细胞黏附、降低脂质沉积、抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移及抗血栓等多种心血管保护作用，在防治AS方面发挥重要作用 [24] 。黄芩素可能是通过激活AMPK/Mfn-2轴，同时抑制下游MAPKs/NF-κB信号转导，延缓AS进程 [25] [26] 。此外，丹参酮IIA、木犀草素、山奈酚、柚皮素也均被证实在防治AS过程中发挥一定作用 [27] [28] [29] [30] 。

4.2. GO和KEGG通路富集分析

通过GO分析，主要涉及对激素的反应、对无机物的反应、细胞对脂质的反应、对异种刺激的反应、对氧气水平的反应、对细胞因子的反应等生物进程，它们的分子功能主要与激酶结合、DNA结合转录因子结合、蛋白质同二聚化活性、蛋白质结构域特异性结合、蛋白激酶活性、氧化还原酶活性、细胞因子受体结合、磷酸酶结合、蛋白酶结合等相关，并且主要富集在膜筏、转录调节复合物、受体复合物、囊泡腔、蛋白激酶复合物、内质网腔、细胞器外膜等部位。

通过KEGG分析共富集通路193条，结果显示，菟丝子治疗PCOS伴IR主要涉及以下几个信号通路：AGE-RAGE信号通路、FoxO信号通路、NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路等。AGE-RAGE信号通路的激活会导致氧化应激和炎症反应，进而出现血管并发症。实验证明：在持续高血糖诱导下，血管壁中糖基化终末产物(AGEs)的积累，通过与细胞膜上的晚期糖基化终末产物受体(RAGE)结合发挥生物效应 [31] 。RAGE在人血管内皮细胞及ApoE^−/−小鼠中也高表达，敲除RAGE可以改善ApoE^−/−小鼠AS病变 [32] 。RAGE的下游信号通路包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化、NF-κB p65亚基的磷酸化和上皮细胞向间充质细胞的转分化。这种广泛的信号传导的后果包括慢性血管炎症、活性氧(ROS)的产生和血管平滑肌细胞(VSMCs)在血管壁的迁移，加重AS病变的形成并提高斑块的风险。因此，抑制RAGE并随后抑制与氧化应激和促炎作用相关的下游信号通路可能有利于AS的改善 [33] 。多项实验证实：叉头框蛋白-O1 (FoxO1)是多种底物受体分子，作为磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B (Akt)、沉默信息调节因子2相关酶1 (Sirt1)等信号通路的下游通路在改善AS的过程中发挥重要作用 [34] [35] 。Janus激酶/信号转导及转录激活因子(JAK-STAT)调控血管内的炎症反应过程，激活的JAK/STAT途径在调节VSMC和内皮细胞的激活、增殖、分化中具有关键作用 [36] 。

5. 结论

综上所述，CML治疗AS的主要成分可能是槲皮素、白藜芦醇、刺芒柄花素、木犀草素、异鼠李素、黄芩素、丹参酮II等，涉及到的关键通路有AGE/RAGE、FoxO、NF-κB、JAK-STAT等信号通路，CML可能通过以上途径调控AS进程，但统计结果仍存在一定局限性：本实验的数据均来自现有的数据库和实验数据，部分数据库存在更新不及时，存在数据陈旧或覆盖不全的可能，且参考文献的实验结果也大多来自动物实验或细胞实验，可能有一定假阳性率或假阴性率等，后续将通过实验对以上结果进行验证。

基金项目

福建省自然科学基金项目(2021J01871)。

文章引用

张 宽,罗 柠,叶 华. 畅脉乐I号胶囊治疗动脉粥样硬化的网络药理学作用机制
Network Pharmacological Mechanism of Chang Mai-Le I Capsule in the Treatment of Atherosclerosis[J]. 医学诊断, 2022, 12(01): 27-37. https://doi.org/10.12677/MD.2022.121006

参考文献