Medical Diagnosis 医学诊断, 2012, 2, 12-15 http://dx.doi.org/10.12677/md.2012.22003 Published Online June 2012 (http://www.hanspub.org/journal/md) The Molecular Cloning and Antitumor Activity Characterization of SUMO from Medicinal Fungus Agrocybe aegerita Yi Liang1, Juan Bai2, Hui Sun3 1Department of Clinical Immunology, Guangdong Medical College, Dongguan 2Henan College of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 3The College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan Email: liangyi@gdmc.edu.cn Received: May 18th, 2012; revised: May 25th, 2012; accepted: Jun. 10th, 2012 Abstract: Objective: The antitumor-associated gene of Agrocybe aegerita was cloned to identify the bioactivity. Method: cDNA library was constructed and the gene SUMO was obtained by random sequencing. The eukaryotic ex- pression vector was constructed to detect cell apoptosis and senescence activity. Result: The gene of SUMO was cloned with 606 bp and 103 amino acid residues. The expression in HeLa cells could induce the cell apoptosis instead of se- nescence. Conclusion: SUMO from medicinal fungus worth to be investigated for the discovery of new antitumor medicine. Keywords: Medicinal Fungus; SUMO; Antitumor Activity; Apoptosis 药用真菌杨树菇 SUMO 基因及抗肿瘤活性初步鉴定 梁 一1,白 娟2,孙 慧3 1广东医学院检验学院,临床免疫教研室,东莞 2河南中医学院,郑州 3武汉大学生命科学学院,武汉 Email: dianerliu@yahoo.com.cn 收稿日期:2012 年5月18 日;修回日期:2012 年5月25 日;录用日期:2012 年6月10 日 摘 要:目的:克隆杨树菇抗肿瘤相关蛋白基因,初步鉴定其活性。方法:构建 cDNA 文库,随机测序得到SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier)基因,通过构建真核表达质粒,并检测其在 HeLa 细胞中表达引起的细胞凋亡及衰 老的变化,初步鉴定其抗肿瘤活性。结果:得到全长为 606 bp的SUMO cDNA序列,编码 103 个氨基酸,将表 达SUMO 的真核表达质粒转染入 HeLa 细胞中,发现可引起肿瘤细胞的凋亡,但对细胞衰老无影响。结论:药 用真菌中 SUMO 等小泛素类蛋白酶系统值得进一步研究,有助于新型抗肿瘤药物前体的开发。 关键词:药用真菌;SUMO;抗肿瘤;凋亡 1. 引言 药用真菌因其独特的药理活性被越来越多的研 究者关注[1-3]。其中蛋白质组分占子实体干重约 10%~ 40%[4],但长期以来,仅有上百种蛋白/多肽被分离, 且多集中在对其氨基酸组成、活性分析等初步研究。 已有十多种药用真菌蛋白被报道具很强的抗肿瘤活 性(nM 级)[5,6],提示除多糖外,蛋白质是药用真菌中 另一类重要的抗肿瘤活性组分[7]。本文通过构建 cDNA 文库测序的方法,克隆到药用真菌杨树菇 Agrocybe aegerita小泛素样修饰物(Small Ubiquitin- Copyright © 2012 Hanspub 12 药用真菌杨树菇 SUMO 基因及抗肿瘤活性初步鉴定 like Modifier,SUMO)基因, 通过检测其表 达在真 核 细胞中引起的细胞凋亡和衰老的变化,初步鉴定其抗 肿瘤活性。 2. 材料与方法 2.1. 材料 杨树菇(Agrocybe aegerita)子实体由华中农业大 学食用菌研究所培育,品种为杨树菇 3号,采集之后 迅速冷冻于液氮罐中保存。RNA 提取试剂盒是 Qiagen 公司的 RNeasy Plant Mini Kit,SMART cDNA Library Construction Kit购于 Clontech 公司。真核表达载体 pGEFP-C1系本实验室保存,HeLa 细胞购于中国典型 培养物保藏中心(CCTCC),转染试剂为 Invitrogen 公 司的 Lipofectamine 2000。衰老相关 β-galactosidase 检 测试剂盒购自上海杰美生物公司,碘化丙锭 PI 购于武 汉大风生物技术有限公司。 2.2. cDNA文库及基因测序 使用 RNeasy Plant Mini Kit提取杨树菇子实体总 RNA,按照 SMART cDNA Library Construction Kit说 明书构建 cDNA 文库。对文库进行随机测序,得到的 序列用 CodonCode Aligner 软件去掉低质量序列、载 体序列、重复序列等,用 Phrap 拼接同源 EST,并与 NCBI 非冗余蛋白库比对(BLASTX)。 2.3. 真核表达质粒构建及转染 通过引物 Forward: ccgaattccatgtctgacaccgagc, re- verse: acgcgtcgacctaatgagggacatgaag,将 SUMO 基因克 隆到真核表达载体 pGEFP-C1上。HeLa细胞按每孔约 3 × 104个细胞接种于6孔细胞培养板,37℃培养过夜, 待细胞密度为 80%~90%使用 Lipofectamine 2000转染 真核表达质粒。 2.4. PI染色及流式细胞仪分析 按照上述方法转染待质粒,继续培养 48 hr。使 用 荧光显微镜检测转染效率。细胞用 PBS重悬洗涤 1次, 75%乙醇重悬后,加RNase A (终浓度 0.25 mg/ml) 37℃ 孵育 1 hr ,终浓度 50 mg/ml的碘化丙啶 4℃避光染色 30 min,流式细胞计数仪检测荧光强度分布(激发波长 488 nm)。 2.5. 衰老相关 β-galactosidase 检测 按照上述方法转染质粒,使用β-galactosidase衰 老相关试剂盒里对细胞进行染色,细胞呈现蓝色部位 为衰老细胞特异性酶(β-半乳糖苷酶)活性位点。 3. 结果 3.1. SUMO基因序列及数据分析 杨树菇 cDNA 文库构建成功,随机测序获得杨树 菇Agrocybe aegerita SUMO序列(如图1所示),长 606 bp。用 NCBI的ORF Finder程序分析其开放阅读框, 5’-非翻译区为 137 bp,3’-非翻译区 157 bp,其 中 末 尾 有30 bp的poly-A。含有长 312 bp的开放阅读框(包括 一个终止密码子),编 码103 个氨基酸,氨基酸序列分 析显示其含有 SUMO 的特征序列。 杨树菇 SUMO 氨基酸序列用 BLASTP 搜索找出其 相似度较高的氨基酸序列,然后用 Clustal W2比对序 ,如图 2所示。Agrocybe aegerita SUMO与Coprinopsis 列 Figure 1. The SUMO gene from Agrocybe aegerita and the deduced amino acid sequence 图1. 杨树菇 Agrocybe aegerita SUMO基因序列及氨基酸序列 Copyright © 2012 Hanspub 13 药用真菌杨树菇 SUMO 基因及抗肿瘤活性初步鉴定 Figure 2. The amino acid sequence comparison of SUMO. “*” meant identical residues, “:” meant conserved substitutions, “.” meant semi- conserved substitutions 图2. 几种SUMO 氨基酸序列比对结果。“*”表示完全相同的氨基酸残基,“:”表示保守替换,“.”表示非保守替换 cinerea SUMO(登录号 BAF64517.1)、Bigelowiella natans SUMO(登录号 AAP34642.1)和Paracoccidioides bra- siliensis SUMO(登录号 XP_002794493.1)的相似性分别 为76.7%、43.7%和45.6%。 3.2. 真核表达质粒构建及转染 PCR 扩增连在 cDNA 文库构建质粒载体 pDNR- lib 上的SUMO 基因,扩增结果如图3(a),将基因克 隆到 pEGFP-C1 载体上,酶切鉴定结果如图 3(b)。真 核表达载体构建完成后,用 pEGFP-C1空载体作为对 照,以相同的量转染入 6孔板的 HeLa 细胞,48 小时 后通过标签GFP 在荧光显微镜下检测转染效率,图 3(c)表明转染效率可达 80%以上。 3.3. PI染色及流式细胞仪检测 HeLa 细胞凋亡 使用碘化丙啶染色以及流式细胞仪分析发现, SUMO 基因的表达可引起 HeLa 细胞亚二倍体峰细胞 群也就是凋亡细胞数目的增多,如图 4(a)所示。转染 空质粒对照凋亡峰只有 2.47% ± 0.13%,而 SUMO 基 因的表达诱导细胞出现23.76% ± 0.96%的亚二倍体 峰,说明 SUMO 可显著诱导细胞出现凋亡。 3.4. 衰老相关 β-galactosidase 活性实验 转染质粒 48小时后,使用衰老相关 β-galactosidase 检测试剂盒对细胞进行染色,光学显微镜观察,如图 5(a)所示。每个样品随机选取 4个视野,计算SA-β-Gal 呈阳性反应的细胞比例,统计结果如图 5(b)所示,转 染SUMO 基因(4.06% ± 1.5%)与对照组(3.86% ± 0.32%) 相比没有显著性差异。 4. 讨论 SUMO 蛋白是一类蛋白质修饰物家族,在调节蛋 白稳定及功能方面其关键作用。本文克隆了药用真菌 杨树菇 SUMO 基因,发现 SUMO表达在真核 HeLa 细胞中可引起细胞的凋亡(图4),对细胞衰老没有显著 性影响(图5)。从杨树菇的近源种 Agrocybe cylindracea 中分离出类泛素短肽具有刺激巨噬细胞,抑制细胞增 殖和核糖核酸酶活性[8];平菇中分离出的 N端序列与 Figure 3. The construction and the transformation of the plasmid pEGFP-C1-SUMO. (a) The PCR result of SUMO; (b) The result of enzyme digestion of the plasmid pEGFP-C1-SUMO; (c) The transformation of the plasmid pEGFP-C1-SUMO. The plasmid with GFP-tag was transformed into HeLa cells, and after 48 h the result was observed and pictured by fluorescence microscope (pEGFP-C1-C was the control) 图3. pEGFP-C1-SUMO真核质粒构建及转染。(a) SUMO基因扩 增;(b) pEGFP-C1-SUMO质粒酶切鉴定结果;(c) pEGFP-C1- SUMO 质粒转染,带有 GFP 标签的质粒转染 HeLa 细胞,48 小时 后荧光显微镜观察并照相(pEGFP-C1-C 为空载体对照) Copyright © 2012 Hanspub 14 药用真菌杨树菇 SUMO 基因及抗肿瘤活性初步鉴定 Figure 4. The pro-apoptotic effect of the expression of SUMO on HeLa cells. (a) The plasmids were transformed into HeLa cells, and after 48 h, the cells were detected by PI staining and flow cy- tometry. pEGFP-C1-C was used as blank control, and the left line indicated the sub-G1 peak; (b) The statistical data was collected by three experiments performed. * indicated that P value < 0.01 图4. 流式细胞仪检测 SUMO基因引起的 HeLa 细胞凋亡。(a) 转 染质粒 48 小时后,PI 染色结合流式细胞仪检测细胞。pEGFP-C1-C 为转入空质粒对照,图中左侧横线表示亚二倍体峰;(b) 三次试验 的统计学数据,*表示 P < 0.01 Figure 5. The senescence-induced effect of the expression of SUMO on HeLa cells detected by SA-β-Gal staining. (a) The plasmids were transformed into HeLa cells, and the cells were stained for 16 h by the senescence associated β-galactosidase detection kit. Blue cells indicated the positive signals which were senescence cells; (b) The percentage of positive cells was statistically collected in the four microscopic fields random selected, and P > 0.05 图5. SA-β-Gal 染色检测衰老细胞。(a) 转染后,使用衰老相关 β-galactosidase 检测试剂盒染色16小时,光学显微镜 200×,其中 蓝色为阳性反应,即出现衰老的细胞;(b) 每个样品随机挑选 4个 视野计数的统计数据。P > 0.05 泛素高相似性的糖蛋白具有抑制HIV,抑制蛋白翻译 和核糖核酸酶活性[9];马勃菌中分离的 N端序列与泛 素高相似性的蛋白短肽具有抑制增殖,及有丝分裂的 活性[10]。说明药用真菌中的泛素类蛋白酶系统中的分 子十分值得进一步研究,尤其是肿瘤细胞会产生更多 的癌蛋白以及非正常蛋白质分子,比正常细胞对泛素 类蛋白酶系统的药物反应更灵敏,因此研究此类蛋白 更有助于我们开发靶向型的抗肿瘤药物。 5. 致谢 感谢国家自然科学基金(No. 81102850),广东省教 育厅育苗工程项目(No. LYM11070),东莞市高等院校 科研项目基金(No. 2011108102049)及广东医学院博士 启动基金项目(XB1106)给予本研究的支持。 参考文献 (References) [1] A. T. Borchers, C. L. Keen and M. E. Gershwin. 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