湖北中医药大学中医临床学院，湖北 武汉

收稿日期：2023年7月17日；录用日期：2023年8月12日；发布日期：2023年8月25日

摘要

目的：基于“脾开窍于口”探讨口周炎微环境与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)的相关性。方法：32只SPF级SD大鼠随机分为2组，空白组16只、模型组16只，模型组予以Hp菌液灌胃，造模4周。ELISA法检测Toll样受体4 (Toll-Like Receptor 4, TLR4)和NOD样受体蛋白3 (NOD-Like Receptor thermal Protein domain associated protein 3, NLRP3)在口周皮肤、口腔黏膜及胃组织中的表达水平，口周皮肤和口腔黏膜、胃组织中蛋白表达的相关性采用Pearson相关性分析。结果：与空白组相比，模型组小鼠口周皮肤、口腔黏膜、胃组织中TLR4和NLRP3表达水平均升高，差异有统计学意义(P < 0.001)。模型组口周皮肤TLR4和NLRP3表达水平与其在胃组织中含量呈正相关(r = 0.820，P < 0.001；r = 0.907，P < 0.001)，模型组口腔黏膜TLR4和NLRP3表达水平与其在胃组织中含量呈正相关(r = 0.546，P < 0.01；r = 0.641，P < 0.01)，差异均有统计学意义。结论：口周炎微环境与幽门螺杆菌有相关性，幽门螺杆菌感染会导致大鼠口周炎微环境改变。

关键词

脾开窍于口，幽门螺杆菌，口周炎微环境，相关性

Exploring the Correlation between Inflammatory Microenvironment of Perioral and Helicobacter pylori Based on “Spleen Opening at Mouth”

Xilin Xia, Ping Zhang^*

Clinical School of Chinese Medicine, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan Hubei

Received: Jul. 17^th, 2023; accepted: Aug. 12^th, 2023; published: Aug. 25^th, 2023

ABSTRACT

Objective: To explore the correlation between inflammatory microenvironment of perioral and Helicobacter pylori based on the theory of “spleen opening at mouth”. Method: 32 SPF grade SD rats were randomly divided into two groups: a normal group of 16 rats and a model group of 16 rats. The model group was given Hp bacterial solution by gavage for 4 weeks. ELISA was used to detect the expression levels of Toll like receptor 4 (Toll-Like Receptor 4, TLR4) and NOD like receptor protein 3 (NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3) in the perioral skin, oral mucosa, and gastric tissue. Pearson correlation analysis was used to investigate the correlation between protein expression in the perioral skin, oral mucosa, and gastric tissue. Results: Compared with the normal group, the expression levels of TLR4 and NLRP3 in the perioral skin, oral mucosa, and gastric tissue of the model group mice increased, the difference was statistically significant (P < 0.001). The expression level of TLR4 and NLRP3 in the perioral skin of the model group was positively correlated with its content in gastric tissue (r = 0.820, P < 0.001; r = 0.907, P < 0.001), and the expression level of TLR4 and in the oral mucosa of the model group were positively correlated with its content in gastric tissue (r = 0.546, P < 0.01; r = 0.641, P < 0.01), the differences were statistically significant. Conclusion: Helicobacter pylori infection is associated with the microenvironment of perioral inflammation. Helicobacter pylori infection can lead to changes in the microenvironment of perioral inflammation in rats.

Keywords:Spleen Opening at Mouth, Helicobacter pylori, Inflammatory Microenvironment of Perioral, Correlation

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1. 引言

口周炎性皮肤病例如口周皮炎、口周玫瑰痤疮等病因病机复杂，临床表现多样，病程日久迁延，给患者的生理及心理状态都造成了极大的影响。临床上我们发现，许多患有口周炎性皮肤病的患者都伴有不同的消化道症状，如反酸、食欲不振、纳差、间歇性胃痛、腹泻等。有学者研究发现口周皮炎患者Hp阳性率为85.7%，健康人Hp阳性率仅为13.3%；玫瑰痤疮患者Hp阳性率为88%，而健康对照组为65%，口周皮炎和玫瑰痤疮患者Hp阳性检出率显著高于正常人，推测口周炎症性皮肤病可能Hp感染具有相关性 [1] [2] 。中医藏窍理论认为“脾开窍于口”，《灵枢·脉度》 [3] 言：“脾气通于口，脾和则口能知五谷矣”，《诸病源候论·口舌疮候》 [4] 曰：“足太阴，脾之经也，脾气通于口”。根据“有诸形于内，必形于外”的整体生理病理辨证观，脾胃的病变在口唇也有相应的表现。基于这一理论，本文探究口周炎微环境与Hp感染之间的相关性，进一步探究Hp感染是否会引起口周炎微环境改变。

2. 材料与方法

2.1. 实验动物

SPF级雄性SD大鼠32只，8周龄，体质量200 g ± 20 g，购于苏州西山生物技术有限公司，合格证号SCXK (辽) 2020-0001。饲养于湖北中医药大学SPF级动物饲养中心，室温保持在22℃ ± 2℃，相对湿度为55%~60%，按照正常昼夜节律调整光照的时间。实验过程中对实验动物的处置均遵从《湖北省实验动物管理条例》《关于善待实验动物的指导性意见》等法规规定，本实验经湖北中医药大学实验动物伦理委员会批准(动物实验伦理审批号：HUCMS202107003)。32只大鼠适应性喂养7天后，随机分为空白组和模型组各16只。模型组禁食12 h，予以配置好的抗生素溶液(阿莫西林100 mg/kg + 甲硝唑40 mg/kg) 10 ml∙kg⁻¹∙d⁻¹连续灌胃3天清除胃内杂菌，第4天禁食16 h禁水4 h后，先以5% NaHCO₃ 2 ml灌胃，1 h后予以Hp菌液1.5 mL灌胃，再禁食禁水4 h；第2天正常饮食饮水；2天为1次循环，共6次 [5] 。空白组以等量生理盐水代替Hp菌液灌胃，正常饮食水。此后14天模型组不予灌胃操作，予以正常饮食水，以助于Hp定植。14天后，大鼠禁食水24 h，2%苯巴比妥钠麻醉大鼠，心尖取血，离心留取血清保存备用，在冰袋上切取大鼠全胃、口周皮肤和口腔内两颊黏膜备用。取下的口周皮肤和口腔黏膜一分为二，1块用于组织形态学观察，1块用于ELISA检测。全胃沿着胃小弯直至幽门处剪开，取下全肌壁2块，1块投入尿素酶试剂中，1块用于组织形态学观察；再取1块胃窦黏膜组织，保存于−80℃冰箱，用于ELISA的检测。

2.2. 仪器与试剂

大鼠Toll样受体4 (TLR4)、大鼠隐热蛋白(NLRP3)、大鼠幽门螺杆菌(HP)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(江苏酶免实业有限公司，货号MM-0221R1、MM-1028R1、MM-71474R1)。Hp菌株为悉尼标准菌株(Sydney Strain 1, SS1)，含有细胞毒素相关蛋白(Cytotoxin-associated gene A, CagA)基因和空泡毒素(Vaculating toxin-associated gene A, VacA)基因。生物显微镜(日本Olympus公司，型号BX53)；电热恒温培养箱(日本ASONE公司，型号ICV-450)；离心机(湘仪公司，型号H1650-W)；Flexstation 3多功能酶标仪(Molecular Devices公司，型号FlexStation 3)。

2.3. 方法

2.3.1. 一般情况

在造模阶段对两组大鼠的口周皮肤、口腔黏膜、皮毛、活动量、进食量、体重、粪便性状等一般情况进行动态观察。

2.3.2. Hp定植情况

快速尿素酶实验检测：将胃组织投入尿素酶试剂中，室温下1 min后观察试剂颜色，若试剂由黄色变为红色或者紫红色，提示造模成功。ELISA检测：检测血清是否含有幽门螺旋杆菌IgG抗体，阳性代表造模成功。

2.3.3. HE染色

将大鼠口周皮肤、口腔黏膜及胃组织用4%多聚甲醛溶液固定之后进行脱水、包埋、石蜡切片，常规苏木精–伊红(Hematoxylin-Eosin, HE)染色，显微镜下观察病理学改变。

2.3.4. ELISA检测口周皮肤、口腔黏膜及胃组织匀浆上清液中的TLR4和NLRP3含量

提取口周皮肤、口腔黏膜及胃组织块匀浆上清液，用BCA蛋白浓度测定法检测蛋白浓度；准备TLR4和NLEP3 ELISA试剂盒，用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗的微孔中依次加标本或标准品、生物素化抗体、HRP标记的亲和素。向每个孔中加入90 μL TMB显色，TMB在HRP的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算标本中TLR4和NLRP3含量。

2.4. 统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件分析数据，计量资料采用均数 ± 标准差( $\bar{x}\pm \text{s}$ )表示，若满足正态分布和方差齐性，采用独立样本t检验，若不满足则采用Wilcoxon两样本秩和检验；口周皮肤和口腔黏膜与胃组织中蛋白表达的相关性采用Pearson相关性分析，如资料不符合正态分布，用Spearman秩相关分析评估两组数据的相关性。其中P < 0.05具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 一般情况改变

空白组的大鼠毛发光泽度好，饮水和饮食正常，体重增长正常，粪便正常，无明显异味；模型组大鼠口周皮肤和口腔黏膜外观未见明显改变，毛发光泽度较差，稀疏易脱落，反应较迟钝，精神不济，不喜活动，身体常呈蜷缩状，饮水和饮食减少，大便质稀臭秽。

3.2. Hp定植情况

空白组和模型组随机各抽取4只大鼠胃组织进行快速尿素酶实验，结果显示空白组4只为阴性，模型组4只为阳性，见图1。模型组16只大鼠ELISA检测血清含有幽门螺旋杆菌IgG抗体，判定造模成功。

图1. 快速尿素酶实验

3.3. 口周皮肤、口腔黏膜及胃黏膜组织病理学情况

空白组大鼠口周皮肤组织结构良好，无炎性细胞浸润；模型组大鼠皮肤组织增厚，棘层肥厚，毛细血管增生，可见轻度炎性细胞浸润，见图2。空白组大鼠口腔黏膜上皮形态正常，结构完整、清晰；模型组大鼠口腔黏膜上皮破损、脱落，棘层增厚，棘细胞水肿，基底层有少量炎细胞浸润，见图3。空白组大鼠胃组织结构正常，胃黏膜上皮细胞排列整齐，固有层腺体排列规律，无炎细胞浸润；模型组大鼠胃窦部有炎症表现，胃黏膜上皮排列紊乱，坏死脱落，固有层腺体排列紊乱，内可见淋巴细胞和中性粒细胞浸润，见图4。

3.4. 两组大鼠口周皮肤、口腔黏膜及胃组织TLR4和NLRP3表达水平比较

与空白组相比，模型组大鼠口周皮肤、口腔黏膜及胃组织TLR4和NLRP3表达水平均升高，差异有统计学意义(P < 0.001)，见表1，表2。

图2. 两组大鼠口周皮肤组织病理学比较(HE，×100)

图3. 两组大鼠口腔黏膜组织病理学比较(HE，×100)

图4. 两组大鼠胃黏膜组织病理学比较(HE，×200)

表1. 两组大鼠不同部位TLR4表达水平比较(n = 16， $\bar{x}\pm \text{s}$ ，ng/mL)

表2. 两组大鼠不同部位NLRP3表达水平比较(n = 16， $\bar{x}\pm \text{s}$ ，M (P25~P75)，pg/mL)

3.5. 口周皮肤和口腔黏膜与胃组织中蛋白表达相关性采用Pearson相关性分析

3.5.1. 口周皮肤和口腔黏膜与胃组织中TLR4蛋白表达水平的相关性分析

空白组口周皮肤和口腔黏膜TLR4表达水平与胃组织TLR4表达水平无相关性(r = −0.036，P = 0.898；r = 0.282，P = 0.308)，模型组口周皮肤和胃组织的TLR4表达水平呈正相关，模型组口腔黏膜和胃组织的TLR4表达水平呈正相关，差异均有统计学意义(P < 0.01)，详见表3、图5。

图5. 口周皮肤和口腔黏膜与胃组织中TLR4蛋白表达水平的相关性

表3. 模型组口周皮肤和口腔黏膜与胃组织中TLR4和NLRP3表达相关性(n = 16)

注：相关系数r，^#；P值，^*。

3.5.2. 口周皮肤和口腔黏膜与胃组织中NLRP3蛋白表达水平相关性分析

空白组口周皮肤和口腔黏膜NLRP3表达水平与胃组织NLRP3表达水平无相关性(r = −0.198，P = 0.480；r = −0.044，P = 0.875)。模型组口周皮肤和胃组织的NLRP3表达水平呈正相关，模型组口腔黏膜和胃组织的NLRP3表达水平呈正相关，差异均有统计学意义(P < 0.01)，详见表3、图6。

图6. 口周皮肤和口腔黏膜与胃组织中NLRP3蛋白表达水平的相关性

4. 讨论

Hp是1983年Robin Warren和Barry Marshall在慢性胃炎患者的胃黏膜中发现的一种革兰氏阴性细菌，是胃炎与消化性溃疡的主要致病原因，长期感染还会引起胃黏膜萎缩和肠上皮化生，导致胃癌、胃相关性淋巴瘤等恶性病变 [6] [7] ，全世界有超过50%的人正在遭受其感染 [8] ，我国Hp感染的总体患病率为44.2% [9] ，除了胃肠道的疾病以外，近年来有许多国内外研究表明，Hp还与口周炎性皮肤病如口周皮炎、口周痤疮、口周玫瑰痤疮等有相关性，患有口周炎性皮肤病的患者伴有更高的Hp感染率 [1] [10] [11] 。盛文婷等 [12] 对152例口周皮炎患者和30例正常人进行14C尿素呼气试验，其中口周皮炎患者组Hp阳性率为86.18%，空白组Hp阳性率为46.67%，口周皮炎患者组和空白组Hp阳性率比较有显著性差异，差异有统计学意义，这提示口周皮炎的发生发展与Hp感染可能有关联性。Szlachcic等 [13] 用尿素酶实验和13C尿素呼气试验检测实验组60例玫瑰痤疮患者以及对照组60例无玫瑰痤疮但有类似实验组患者胃肠道疾病患者感染Hp情况，发现玫瑰痤疮患者中Hp阳性率占比88%，而对照组为65%，差异有统计学意义(P < 0.05)，在对53例玫瑰痤疮患者进行了1周的Hp根除治疗后，51例患者玫瑰痤疮症状消失，提示玫瑰痤疮的发病可能与Hp感染相关。有学者认为口周炎症的产生可能跟Hp在口腔和消化道中移行对口腔及皮肤的损伤和破坏有关 [14] ；还有学者认为口周皮炎的发生可能与Hp释放的一些血管活性毒素物质有关，这些物质进入周围循环系统，损害血管内皮，并刺激机体产生大量炎性介质，引起皮肤红斑和毛细血管扩张 [15] ；有学者认为Hp毒力决定簇中的CagA蛋白是一种免疫原，可刺激胃黏膜上皮细胞分泌大量的IL-8，IL-8诱导中性粒细胞活化，黏附在血管内皮导致血管损伤 [16] 。

NLRP3炎症小体由NLRP3、接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated Speck-like protein containing a CARD, ASC)和前半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1 (Pro-cysteine-requiring aspartate protease-1, pro-caspase-1)组成。ASC是一种连接NLRP3和pro-caspase-1的接头蛋白，上游信号刺激ASC后，ASC会招募pro-caspase-1自身剪切活化，激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1 (Cysteine-requiring aspartate protease-1, caspase-1)，活化后的Caspase-1切割白细胞介素-1β前体和白细胞介素-18前体，裂解成白细胞介素-1β (Interleukin-1β, IL-1β)和白细胞介素-18 (Interleukin-18, IL-18)释放到细胞外，快速激活固有免疫 [17] [18] 。TLR4是TLRs (Toll Like Receptors)家族的关键成员之一，主要分布在B淋巴细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞等细胞表面，可与内源性配体和外源性配体特异性结合 [19] 。TLR4的典型外源性配体脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)能够和细胞膜表面蛋白共表达形成LPS-TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路，其胞外域介导LPS的识别和受体二聚化，再与髓样分化因子88结合，使IL-1受体相关激酶磷酸化激活核因子κB (Nuclear factor kappa-B, NF-κB)，释放TNF-α、IL-1β、白细胞介素-10、白细胞介素-6 (Interleukin-6, IL-6)等一系列炎症因子进入外周循环血中，诱发全身炎症反应 [20] ；NF-κB还能够促进NLRP3炎性小体的组装与Caspase-1的活化，活化后的Caspase-1通过切割人D蛋白其N端片段，在胞质膜中形成跨膜孔隙，使炎症细胞内容物渗出，产生大量IL-1β和IL-18，进一步促进IL-6、IL-2、IL-8等细胞因子与趋化因子的活化释放，引起级联“瀑布效应”，从而导致一种失控的炎症反应 [21] 对皮肤造成损伤。黄俐妍等 [22] 发现Hp阳性组NF-κB、TLR4、MyD88蛋白表达均高于Hp阴性组，提示Hp感染可能通过激活患者TLR4/NF-κB信号通路，引起IL-6、IL-8、TNF-α等细胞因子水平的升高。

本次实验结果显示，与空白组相比，模型组小鼠口周皮肤、口腔黏膜、胃组织中TLR4、NLRP3表达水平均升高，模型组口周皮肤和口腔黏膜TLR4和NLRP3表达水平与其在胃组织中含量呈正相关，而空白组口周皮肤和口腔黏膜TLR4和NLRP3表达水平与胃组织中的含量没有这种相关性，提示Hp感染可能激活LPS-TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路，诱发了口周炎症反应，这也印证了中医“脾开窍于口”这一理论，虽然Hp定植在胃，但除了消化系统疾病外，它还会引起口周炎微环境的改变，进而可能导致口周炎症性皮肤病的产生。因此在治疗口周皮炎、口周玫瑰痤疮等皮肤病时，可以推荐患者进行Hp检测，若Hp为阳性，在治疗过程中可结合抗Hp四联疗法，可以收获较好疗效。

综上所述，本研究初步证实Hp感染会导致大鼠口周炎微环境改变，但本实验为前期预实验，样本量较小，信号通路检测指标较少，下一步计划增加样本量，完善相关检测指标，进一步探究Hp感染引起口周炎微环境改变的作用机制。

文章引用

夏习林,张 平. 基于“脾开窍于口”探讨口周炎微环境与幽门螺杆菌相关性
Exploring the Correlation between Inflammatory Microenvironment of Perioral and Helicobacter pylori Based on “Spleen Opening at Mouth”[J]. 中医学, 2023, 12(08): 2373-2380. https://doi.org/10.12677/TCM.2023.128356

参考文献