Hans Journal of Agricultural Sciences 农业科学, 2012, 2, 25-29 http://dx.doi.org/10.12677/hjas.2012.22005 Published Online June 2012 (http://www.hanspub.org/journal/hjas) Rapid Propagation of “Lv Ling” Walnut (Juglans regia L.) through Embryo-Induced Seedlings* Xixing Liu1, Yuhong Gu2, Baoguo Li1#, Guohui Qi1, Lu Liu2, Yanz he Hui1, Lixin Dong1, Liyuan Ma1 1College of Forestry, Agricultural University of Hebei, Baoding 2College of Life Science, A g r i c u l tural University of Hebei, Baoding Email: liuxixing1234@126.com, #lbg888@163.com Received: Apr. 13th, 2012 ; re vise d: A pr. 28th, 2012; accepted: May 2nd, 2012 Abstract: The mature embryo induced axillary buds were used as explants to investigate rapid propagation of precocious thin-shelled “Lv Ling” walnut in the MS basic medium with different concentrations of plant growth regulators. The results showed that MS + sucrose 30 g/L + agar 6 g/L was the most feasible medium for embryo germination, and MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + sucrose 30 g/L + agar 6 g/L was the best for induction and multiplicatio n of the ax illary buds in all tested treatments. The 50% of rooting rate was achieved by a two-stage rooting method, namely, the shoots were first cultivated in DKW + IBA 8.0 mg/L + sucrose 30 g/L + agar 6.0 g/L medium for 20 days under dark condition, then transferred to DKW + sucrose 30 g/L + agar 6.0 g/L medium under light condition. After transplanting to the field, 33.3% of the seedlings survived. Keywords: Walnut; Juglans; Embryo; Axillary Buds; Hormones “绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系的初步研究* 刘喜星 1,顾玉红 2,李保国 1#,齐国辉 1,刘 璐2,回彦哲 1,董丽欣 1,马丽媛 1 1河北农业大学林学院,保定 2河北农业大学生命科学学院,保定 Email: liuxixing1234@126.com, #lbg888@163.com 收稿日期:2012 年4月13 日;修回日期:2012 年4月28 日;录用日期:2012 年5月2日 摘 要:以早实薄皮核桃“绿岭”成熟种胚诱导出的腋芽为外植体,MS 为基本培养基,通过调节激 素种类和浓度配比,初步研究了“绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系。比较试验结果表明:最佳种 胚萌发培养基为 MS + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L;最佳腋芽诱导和增殖培养基为MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L。生根采用两步生根法:先在 DKW + IBA 8.0 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L暗培养 20 d,然后转入 DKW + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L培养基中进行光照培养, 生根率为 50%。诱导生根的组培苗移栽到大田后成活率为 33.3%。 关键词:核桃;核桃属;胚;腋芽;激素 1. 引言 核桃(Juglans regia L.)为胡桃科核桃属多年生落 叶果树,与扁桃、板栗、腰果并称为世界 4大干果, 果实具有较高的营养价值及良好的医疗保健功能,日 益受到广大消费者的青睐[1]。我国是核桃原产地之一, 栽培历史悠久,分布广泛,种质资源丰富[2]。“绿岭” 核桃是河北农业大学李保国教授等在河北绿岭果业 *基金项目:国家林业公益性行业科研专项(201004093)、河北省科 技支撑项目(11230115D)。 #通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 25 “绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系的初步研究 有限公司从“香玲”核桃中选育出的优良变异品种, 具有壳薄、优质、早实和丰产的优良特性,深受果农 欢迎,但苗木繁育跟不上该品种的产业发展需求。核 桃组织培养是迅速繁殖种苗、保存和选育优良品种的 重要手段。关于核桃组织培养,前人已有研究[3-17], 但是,薄皮核桃的组培研究相对较少,利用“绿岭” 核桃成熟种胚诱导出的腋芽为外植体开展腋芽快繁 以往未见报道。因此,本研究以“绿岭”核桃成熟种 胚诱导出的腋芽为外植体,利用固体组织培养技术, 对“绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁途径进行研究, 既可望提高“绿岭”核桃种胚的繁殖速度和增殖系数, 又对核桃种质资源保存和苗木的快速繁殖提供一定 的参考意义。 2. 材料与方法 2.1. 材料 以“绿岭”核桃(J. regia “Lv Ling”)的成熟干燥坚 果为材料,其青皮果实于 2010 年9月5号采自河北 省邢台市临城县绿岭果业有限公司示范园。 2.2. 方法 2.2.1. 灭菌 将“绿岭”青皮核桃用刀剥掉青皮得到坚果,坚 果先用自来水冲洗干净,再用 30%的次氯酸钠(含3% 有效氯)清洗 1遍,用蒸馏水冲洗 3遍,再用75%的酒 精清洗 1遍,最后用蒸馏水冲洗 3遍,放在通风干燥 无菌处晾干备用。 接种前,取“绿岭”核桃坚果,放入超净工作台 内的大烧杯中。先用 30%的次氯酸钠消毒 5 min,无 菌水冲洗 3次,每次 1 min,然后用 75%的酒精消毒 30 s,无菌水冲洗 3次,每次 1 min。最后用核桃钳子 小心夹开坚果取出胚,将胚置于培养皿中,用 75%的 酒精消毒 1 min,无菌水冲洗 3次,每次 1 min。滤纸 吸干水分后将胚接种于培养基上。 2.2.2. 种胚萌发培养基的筛选 在MS + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L的培养基中 分别添加不同浓度(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)的IBA(吲 哚丁酸),不同浓度(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)的NAA(萘 乙酸)(表1),以筛选最适宜胚萌发培养的激素浓度。 先将胚暗培养 7 d,再光照培养。每个处理接种 10 个 胚,3次重复。接种第 10 d统计萌发数,计算种胚萌 发率。接种第 30 d统计成苗率。 萌发率(%) = (萌发种胚数/接种种胚数) × 100% 成苗率(%) = (成苗数/接种种胚数) × 100% 2.2.3. 腋芽萌发培养基的筛选 将种胚萌发长成的组培苗切成带有 1~2 个腋芽的 茎段,长约2 cm。选用生长基本一致的茎段,分别接 种于 MS + 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤) 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L培养基和 MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L培养基上。每个处理接种 10 个茎段,3次重复。 每2周继代 1次,接种第 20 d 统计腋芽萌发数,计 算腋芽萌发率,接种第 30 d 统计增殖系数。 腋芽萌发率 = (萌发腋芽数/接种腋芽数) × 100% 增殖系数 = (萌出的腋芽茎段数/组培苗的株数) × 100% 2.2.4. 生根培养基的筛选 将腋芽诱导的茎段先接在 DKW + IBA 5.0 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂6.0 g/L和DKW + IBA 8.0 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L培养基上,暗培养 12 d和20 d,转入 DKW + 蔗糖 30 mg/L + 琼脂 6 g/L培养基中。 3周后统计生根数,计算生根率。每处理接种 10 个茎 段,3次重复。 生根率 = (生根茎段数/接种茎段数) × 100% 2.2.5. 组培苗的炼苗移栽 组培苗生根约 40 d后,将生根苗的瓶盖打开,在 光照培养箱(温度为 25℃、光照强度为 2000 lx,光周 期为 16 h/d)里炼苗 2~3 d。然后取出小苗,移栽于沙: 土(1:1)基质中。在光照培养箱里培养15 d后,在室温 下炼苗 5 d,然后于 5月18 日移栽到大田。先盖上遮 阳网(遮光度为 80%),注意保持土壤湿润,5 d后撩起 一侧,再过 2 d后撩起另一侧,直到把 4侧都撩起为 止,然后选择阴天去掉遮阳网。在光照培养箱培养第 15 d时记录成活苗数,计算成活率Ⅰ;移栽到大田第 30 d时记录成活苗数,计算成活率Ⅱ。 成活率 = (成活株数/移栽株数) × 100% 2.2.6. 培养条件 以上所有培养基高压灭菌前的pH 值均为 5.8~ 6.0,在121℃下高压灭菌20 min。培养温度为 25℃ ± Copyright © 2012 Hanspub 26 “绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系的初步研究 2℃,光周期为 16 h/d,光照度为 2000~2500 lx。 3. 结果与分析 3.1. “绿岭”核桃种胚萌发的诱导 不同培养基下“绿岭”核桃种胚萌发和成苗的情 况如表 1所示。处理1、处理3和处理 4种胚萌发率 最高为 93.3%,处理 9的种胚萌发率最低为 67.7%, 二者差值为 25.6%;处理 1和处理 3成苗率最高为 90.0%,处理 2、处理 7和处理 9成苗率最低为 43.3%, 二者差值为 47.7%。 不同培养基下“绿岭”核桃种胚萌发诱导的生长 情况如表 2所示。由表 2可知处理 1的种胚生长情况 优于其他处理的生长情况。 Table 1. Embryo germination and seedling growth of “Lv Ling” walnut 表1. “绿岭”核桃种胚萌发和成苗的情况 处理 Treatment 培养基 Medium 萌发率(%) Germination rate 成苗率(%) Seedling rate 1 MS 93.3 90.0 2 MS + IBA 0.5 mg/L 83.3 43.3 3 MS + IBA 1.0 mg/L 93.3 90.0 4 MS + IBA 1.5 mg/L 93.3 66.7 5 MS + IBA 2.0 mg/L 83.3 66.7 6 MS + NAA 0.5 mg/L 83.3 50.0 7 MS + NAA 1.0 mg/L 83.3 43.3 8 MS + NAA 1.5 mg/L 83.3 83.3 9 MS + NAA 2.0 mg/L 67.7 43.3 注:表中的培养基均加入 30 g/L的蔗糖和 6 g/L的琼脂。 Table 2. Embryo germination and induction of “Lv Ling” walnut 表2. “绿岭”核桃种胚萌发诱导的生长情况 培养时间 (天) Culture time (d) 7 21 28 处理 1的生 长状况 Treatment 1 胚根迅速伸 长,上胚轴开 始伸长 苗高约 3 cm, 叶片未展开, 主根长约 2~3 cm,呈乳白色 幼苗高 3~4 cm,复叶 2~3 片,多数已生侧根 处理 2~9 的 生长状况 Treatment 2 to 9 胚根很短 苗高约 2 cm, 叶片未展开, 茎基有少量 愈伤 幼苗高约 3 cm,复叶 2~3 片,主根较短呈锥 状,茎基有少量愈伤, 少数有侧根 注:处理 1~9 分别为MS;MS + IBA 0.5 mg/L;MS + IBA 1.0 mg/L;MS + IBA 1.5 mg/L;MS + IBA 2.0 mg/L;MS + NAA 0.5 mg/L;MS + NAA 1.0 mg/L; MS + NAA 1.5 mg/L;MS + NAA 2.0 mg/L。表中的培养基均加入 30 g/L的蔗 糖和 6 g/L的琼脂。 综合种胚萌发率、成苗率和种胚的生长情况来 看,在本试验范围内,最适的“绿岭”核桃种胚萌发 培养基为 MS + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L。 3.2. “绿岭”核桃组培苗茎段腋芽萌发的诱导 “绿岭”核桃组培苗茎段腋芽萌发和增殖的情况 如表 3所示。由表3可知,接种在 MS + 6-BA 1.0 m g/L + NAA 0.2 m g/L培养基上的茎段,培养15 d 后,腋芽 开始萌动,萌发率为 60%,增殖系数为 2.12;接种在 MS + 6-BA 2.0 m g/ L + NAA 0.2 mg/L培养基上的茎段, 培养 10 d 后,腋芽开始萌动,腋芽萌发率为 80%,增 殖系数为 3.54。两者萌发率相差 20%,增殖系数相差 1.42。20 d以后,腋芽萌出的小茎尖长 1~2 cm ( 图1)。 综合萌发率、增殖系数和茎段腋芽的萌发状况可得出 最适宜腋芽诱导和增殖的培养基是MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L。 3.3. “绿岭”核桃组培苗腋芽萌发茎段生根的 诱导 “绿岭”核桃组培苗腋芽萌发茎段生根的过程如 图2所示,由图 2可见,茎段基部先出现小根尖,然 后发育成主根,随后又长出侧根。在 DKW + IBA 5.0 mg/L + 蔗糖30g/L + 琼脂 6.0 g/L培养基上暗培养 12 d的茎段基部形成愈伤少,生根率为 10%;而暗培养 20 d的茎段基部愈伤较多,生根率为 30%。在 DKW + IBA 8.0 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L培养基上暗 培养 12 d的茎段基部有愈伤,基部叶片也有愈伤化现 象,生根率为 20%;而暗培养 20 d的茎段基部长的愈 伤较多,生根率为 50%。因此,在本试验范围内,适 宜生根培养的方法是先在 DKW + IBA 8.0 mg/L + 蔗 糖30 g/L + 琼脂6.0 g/L暗培养 20 d,然后转入 DKW + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6.0 g/L培养基中进行光照培养。 Table 3. Axillary buds germinati on an d mult i p lica t ion o f “Lv Ling” walnut 表3. “绿岭”核桃腋芽萌发和增殖的情况 培养基 Medium 萌动时间 Germination time 萌发率(%) Germination rate 增殖系数 Multiplication coefficient MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 m g/L 培养 15 d后 60 2.12 MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 m g/L 培养 10 d后 80 3.54 注:表中的培养基均加入 30 g/L的蔗糖和 6 g/L的琼脂。 Copyright © 2012 Hanspub 27 “绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系的初步研究 Copyright © 2012 Hanspub 28 注:左右图分别为 MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L和MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L培养基上 接种培养第 20 d 腋芽的诱导及生长情况。培养基均加入 30 g/L的蔗糖和 6 g/L的琼脂。 Figure 1. Axillary bud growth from in vitro cultured seedling’s stem segment of “Lv Ling” walnut 图1. “绿岭”核桃组培苗茎段腋芽生长的情况 注:从左往右分别为组培苗茎段在生根培养基中接种 28 d、35 d、46 d的照片。 Figure 2. Root induction and growth of in vitro cultured seedling’s axillary bud of “Lv Ling” walnut 图2. “绿岭”核桃组培苗腋芽萌发茎段的生根过程 3.4. 移栽 将生根的组培苗移栽于沙:土(1:1)基质中,光照培 养箱里培养 15 d时成活率为 80%。移栽到大田的组培 苗,在遮阳网下长得好,去掉遮阳网后叶片有暂时萎 蔫现象,适应条件后有的正常生长,有的植株叶片变 干枯。移栽到大田后成活率为33.3%,较低,这可能 同保定地区 5月温度高、湿度小的不良气候相关,不 利于组培苗移栽成活。 4. 结论与讨论 在植物组织培养中,基本培养基、激素浓度和品 种是影响茎段快繁的重要因素。田爱梅、王国强[3]研 究表明新疆大牧马核桃室外实生苗和山西太谷实生 晚实核桃室内苗的茎段在改良 DKW + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.1 mg/L + 抗坏血酸 5 mg/L培养基上腋芽萌发 效果好,而山西太谷实生晚实核桃成年树的茎段在改 良DKW + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.01 mg/L + 抗坏血 酸5 mg/L培养基上腋芽萌发效果好。刘兰英[4]将“ 薄 壳香”核桃嫁接苗茎段接种在 1/2 DKW + 6-BA 1~2 mg/L + IBA 0.01 mg/L + 抗坏血酸 2~5 mg/L培养基 上,培养 7~10 d时腋芽开始萌动生长。苗玉青等[5] 将“温 185”薄皮核桃枝条接种到 DK W + 6-BA 1 mg/L + IBA 0.01 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂7 g/L培养基 上,腋芽萌发率为 60%,且较粗壮。曾斌等[6]将新疆 野生核桃田间实生苗茎段接种到 DKW + 6-BA 1 mg/L 培养基上腋芽萌发效果好。张进等[7]研究表明室内“汾 阳”核挑实生苗茎段腋芽萌发最佳激素组合为改良 DKW + 6-BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L + IBA 0.02 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 7 g/L。李明军等[8]研究发现 1/2 MS + 6-BA 0.5~4 mg/L + NAA 0.01~0.5 mg/L不同组 合均能促进黑核桃腋芽或顶芽的萌发与生长。王琴[9] 将温室栽培的“华亭”绵核桃、“武威”薄皮核桃的 实生苗单芽茎段分别接种在 DKW + 6-BA 0.5 mg/L + IBA 0.05 mg/L和DKW + 6-BA 0.5 mg/L + IBA 0.01 mg/L 培养基上,平均增殖新生芽数分别为 9.5和5.5。 宋锋惠等[10]将黑核桃树上的当年生幼嫩枝条、室内花 “绿岭”核桃种胚组培苗腋芽快繁体系的初步研究 盆栽培的顶芽已半木质化的黑核桃幼苗带 2~3 个芽的 茎尖和茎段接种到 1/2 MS(改良) + 6-BA 1. 5 mg/L + NAA 0.05 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 5 g/L的诱导培 养基中,增殖倍数为 2倍左右。本研究先将“绿岭” 核桃成熟种胚接种在 MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂 6 g/L 培养基上,然后将组培苗茎段接种在 MS + 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L培 养基上,腋芽萌发率为 80%,增殖系数在 2.12~3.54 之间,这与其他人的研究结果不同。基于以往研究和 本试验的结果,可总结出:在进行核桃实生苗茎段、 田间枝条、组培苗茎段诱导腋芽萌发的研究中,可以 尝试以改良 DKW、1/2 DKW、DKW、MS、1/2 MS 为基本培养基,在培养基中附加0.5~2 mg/L的6-BA、 0.01~0.05 mg/L的IBA 和0.01~0.5 mg/L的NAA。 核桃属于较难生根的树种,生根是核桃离体快繁 的重要环节,目前多采用两步诱导生根法,在进行核 桃组培苗茎段生根的培养中,以改良DKW、1/4 DKW、1/2 DKW、DKW 为基本培养基,先在附加 IBA 1~10 mg/L的培养基中暗培养 8~20 d,然后在无激素 的培养基上光照培养 15~30 d诱导生根。田爱梅、王 国强[3]得出新疆大牧马核桃、山西太谷实生晚实核桃 组培苗茎段在改良 DKW + IBA 5 mg/L培养基上培养 7 d后转入无激素的改良DKW 培养基中生根率为 50.1%。刘兰英[4]发现“薄壳香”核桃组培苗茎段在 1/2 DKW + NAA 2 mg/L + IBA 2 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L培养基上培养 8~10 d后转到用培养液浇灌 的蛭石培养基中,其成活率为 70%。苗玉青等[5]研究 表明“温185”薄皮核桃组培苗茎段在 1/2 DKW + IBA 1 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 7 g/L培养基上培养 30 d,生根率达 70%以上。曾斌等[6]采用间接诱导生根法, 用50 mg/L IBA浸渍处理新疆野生核桃试管苗基部 60 min,然后在无激素的1/2 DKW培养基中先黑暗培养 2周,再在 16 h/d光照下培养,试管苗生根率达96% 以上。裴东等[11]研究结果可知 6个早实核桃品种试管 嫩茎在 1/4 DKW + IBA 5~10 mg/L的培养基中黑暗培 养10~15 d,再转移至不含 IBA 的DKW 培养基中, 嫩茎生根率为 60.5%~89.7%。王清民等[12]把“新早丰” 试管嫩茎先在 1/4 DKW + IBA 5 mg/L培养基上暗培 养10~15 d,然后转到无激素的 1/4 DKW培养基中光 培养 14~20 d,生根率为73%~83%。本研究表明“绿 岭”核桃组培苗茎段先在 DKW + IBA 8.0 mg/L中暗 照 培养 20 d,然后转入无任何激素的 DKW 培养基中进 行光照培养,生根率为 50%。生根率较低,可能与品 种、培养基的类型和暗培养的天数有很大关系,因此, “绿岭”核桃组培苗茎段的生根培养有待进一步研究 和优化。 5. 致谢 作者感谢张雪梅、李杰、齐昆、胡志伟、张彦卿、 魏常燕等在本研究过程中提供的热心帮助和支持;同 时感谢河北绿岭果业有限公司在试验取材过程中提 供的各种方便。 参考文献 (References) [1] 李保国, 齐国辉. 绿色优质薄皮核桃生产[M]. 北京: 中国林 业出版社, 2007: 48-49. 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