¹贵州中医药大学法医学教研室，贵州 贵阳

²贵州省法医中药毒理学特色重点实验室，贵州 贵阳

³贵州中医药大学司法鉴定所，贵州 贵阳

收稿日期：2023年4月22日；录用日期：2023年5月23日；发布日期：2023年5月30日

摘要

鹿血是十分珍贵的中药材，具有促进新陈代谢、增强体质和抗衰老等作用，在我国作为药用已有一千多年的历史，由于鹿血来源稀少且药用价值珍贵，在经济利益驱使下，市场上出现假冒(猪、牛、羊等)或伪劣的鹿血制品，由于传统中药鉴定方法在鹿血的鉴定中具有较大的局限性，因此为确保鹿血质量，用于开发鉴别鹿血及常见家畜的血液制品的现代分子生物学检测技术，将为鹿血及其制品的质量保证和产业高质量发展提供坚实的技术基础，故开展本课题的研究。

关键词

鹿血，伪品，微卫星序列，鉴别技术

Research Status of Deer Blood Identification Technology

Shuang Liu¹, Yifan Wang¹, Xinyi Yang¹, Defang Liu^1,2,3, Chunhua Huang^1,2,3, Shuhuan Zhang^1,3, Didong Lou^1,2,3*

¹Department of Pathology and Forensic Medicine, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang Guizhou

²Guizhou Provincial Key Laboratory of Forensic Traditional Chinese Medicine Toxicology, Guiyang Guizhou

³Judicial Expertise Institution of Forensic Medicine, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang Guizhou

Received: Apr. 22^nd, 2023; accepted: May 23^rd, 2023; published: May 30^th, 2023

ABSTRACT

Deer blood is a very precious Chinese medicine, which can promote metabolism, enhance health and anti-aging. As medicinal drugs in our country, the history has been for more than a thousand years. Due to the scarcity of deer blood sources and precious medicinal value, driven by economic interests, counterfeit (pig, cattle, sheep, etc.) or shoddy deer blood products appear on the market. Because the identification method of traditional Chinese medicine has great limitations in the identification of deer blood, in order to ensure the quality of deer blood, the development of modern molecular biological detection technology for identification of deer blood and common livestock blood products will provide a solid technical basis for the quality assurance of deer blood and its products and the high quality development of the industry, and also the research of this subject is carried out.

Keywords:Deer Blood, Fake, STR, Identification Technology

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1. 引言

鹿是国家级保护动物，同时也是我国重要的药用经济动物 [1] ，在我国民间一直有“鹿身百宝”之说，服用鹿制品对人体不仅有保健作用最重要的是它的药用价值，鹿类中药材是我国传统的滋补类药材，主要包括：鹿血、鹿茸、鹿心、鹿鞭等 [2] [3] ，其中鹿血的应用最为广泛。鹿血为鹿科动物梅花鹿或马鹿的膛血或茸血 [4] ，性热，味甘咸，归肝经和肾经，壮肾阳，强筋骨，入肾经，是十分珍贵的中药材，在我国作为中药材已经有很长的历史，最早在《千金翼方·食治》中有记载：大补虚损、行血却瘀、益精血、解痘毒、药毒，治虚损腰痛、心悸失眠、肺痿吐血、崩中带下等功效 [5] 。具有行血祛瘀、养血益精等作用 [6] ；临床上多用于促进新陈代谢、提高免疫力和增强体质 [7] ；另外在补血、延缓衰老和抗疲劳等方面也有良好的效果 [8] 。鹿血的药用价值一直以来得到广泛认可及深入开发，产品系列不断的丰富，目前市场上含有鹿血的产品已有十几个品种，包括鹿血片、鹿血晶、鹿血粉和鹿茸口服液等，产生的市场价值十分巨大。

尽管鹿血的化学成分及其功效已经被广泛报道，但是鹿血的化学成分与功效之间的关系还不明确，功效成分尚不清楚，在中医药理论指导下，利用现代提取、分离、纯化及鉴定技术与方法，阐释鹿血中的药效化学成分，将为临床使用鹿血产品提供科学的依据，为研制以鹿血为原料的产品提供技术支持和保障，近年来关于动物种属鉴别的技术有很多(见表1)，徐岩等 [9] 应用PCR-RFLP方法对梅花鹿与马鹿的鹿茸进行鉴别。郭月秋等 [10] 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对鹿与牛、鸡、羊、猪等动物的全血进行鉴别，结果显示五种动物的电泳谱带有差异，进一步证明聚丙烯酰胺凝胶电泳可以鉴别鹿血和其它动物血。在能达到实验目的的同时也存在一些弊端，由于人们对鹿血的药用价值逐渐重视，也使鹿血的鉴别技术也在不断提升。

由于鹿血来源稀少且药用价值珍贵，在市场上会出现很多关于鹿血的假冒伪劣产品，包括鹿血掺假、鹿血多样性差等问题。鹿血掺假主要是以：一是用其他常见动物血冒充鹿血；二是在鹿血产品中掺入其他常见动物血以次充好来降低鹿血的纯度 [19] 。所以市场急需鉴定鹿血产品真伪的技术方法，以及可为鹿种群遗传多样性调查提供有效的遗传学参数。由于没有现成的分子标记鉴定技术，借鉴法医生物检材及个体识别技术在法医物证鉴定中的应用，开发有效的分子标记将有助于鉴别鹿血产品的真伪及鹿种群遗传多样性调查。

表1. 动物种属鉴别文献统计

2. 传统鹿血鉴别方法

2.1. 外观性状鉴别方法

参照行业团队标准T/CAAA 045-2020和T/CAAA 046-2020，可以对鹿血粉进行外观形状的鉴别。方法：将鹿血粉在自然光下观察纯正的鹿血粉为粉末状且有光泽颜色为深棕色，假的鹿血分则颜色发黑无光泽 [20] 。缺点：这种鉴别方式是专业人员经验的积累但结果不准确。(此种鉴别方法是不是只有一篇报道，建议找2~3篇，这样更具有说服力)

2.2. 物理鉴别方法

物理鉴别法是最初从事鹿业人员常用的鉴别方法。方法：将微量鹿血粉撒人水中，真的鹿血粉会呈直线入杯底部并出现一条红色的血带。假的鹿血粉，粉末则会落人杯底 [21] 。缺点：非专业人员无法操作有很强的局限性，并且随着科学技术的进步，这法可行性很小。

2.3. 近红外光谱技术的应用

该技术是基于有机分子的近红外吸收，从样品的背景变化中提取弱信息的一种技术，具有高效快速、操作简便等优点，广泛应用于医药和食品等领域 [22] 。尹冬冬等 [23] 利用PLS法近红外光谱技术对鹿血真伪进行鉴别，结果表明此法能够快速地鉴别鹿血的真伪。缺点：此方法虽然具有操作简单、高效等优势，但需要特定的仪器(仪器是否昂贵，是否方便携带)和专业的操作人员才可以实现。

3. 蛋白领域鹿血鉴别方法

3.1. 免疫沉淀反应鉴别方法

依据血清学中抗原与抗体特异性结合是否出现沉淀物进行鉴别的方法。张振学等 [24] 根据法医学血清学抗原与抗体沉淀反应的理论，使用抗鹿Hb(血红蛋白)血清为抗体，对鹿血干粉进行鉴别。方法：首先在无菌的环境下进行抗鹿Hb血清的制备，并进行效价及特异性的测定，之后将鹿血粉装入试管中，加入生理盐水，充分搅拌浸泡之后离心取血清并加抗鹿Hb血清，十分钟后观察结果，出现白色沉淀环为阳性反应是真的鹿血粉，反之则为假的鹿血粉。缺点：这样的鉴别方法相比前三种鉴别方式，鉴别结果更加准确客观，但存在对产品的含量及纯度不能够鉴别的弊端。

3.2. 代谢组学鉴定技术

代谢组学是通过高分辨率、高通量的检测分析技术，从整体上分析生命活动在代谢层面上的特征及规律，基因与蛋白质表达的细小变化都会在代谢物上得到放大，进而可以使检测更加容易。张然然等 [25] 利用代谢组学技术对鹿血和鹿茸血进行鉴别，结果表明在小分子代谢物层面上有着明显的区别，因此可以对鹿血和鹿茸血进行区别。缺点：虽然结果准确率低，但是需要专业的仪器和技术人才。

3.3. 特异性多肽或单肽鉴别法

聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种区带电泳，由于该凝胶具有分子筛的性质可以对样品有分离作用，与样品中各组分所带净电荷的多少及分子的大小有关，有变性和非变性两种形式。其中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳较为常用，由于加入了蛋白质变性剂常为SDS (SDS-PAGE)，使蛋白质或多肽与SDS结合，经热变性和二硫键的还原，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物，其泳动速度由分子量决定 [10] [26] 。仓公敖等 [27] 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对鹿、牛、猪、羊的血清蛋白进行鉴别，结果显示鹿与其他动物的蛋白质区带有明显的差异，进而可以将鹿血与其他动物血液区分开。范青等 [28] 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对鹿、牛、羊等五种动物的全血进行鉴别研究，结果表明这五种动物的电泳谱带有明显的差异，可用于鹿血与其他动物血液的鉴别。缺点：此法弥补了传统鉴别方法的不足，但是需要专业人员技术支持及仪器设备。

4. 分子生物学对鹿血的鉴别方法

4.1. DNA条形码鉴定技术

DNA条形码技术是通过比较一段通用DNA序列，对物种进行识别与鉴定，在生物物种鉴定方面有着广阔的发展前景，目前该技术广泛应用于物种分类和鉴定 [29] 。DNA条形码具有操作简便、结果准确和不受鉴定经验的限制等优点。刘冬等 [30] 基于COI序列的DNA条形码分子鉴定技术对鹿类中药材进行鉴定，结果表明此分子鉴定方法可作为鹿类药材的鉴定方法。马巍威等 [31] 利用DNA条形码不同分析方法对8种鹿科动物30个样本序列进行分析，结果显示基于COI序列的DNA条形码能够有效和准确识别大多数鹿科动物，并报道识别正确率最高的分析方法。缺点：建立DNA条形码数据库困难(是否可以鉴定同物种的不同个体，是否可以进行群体调查，是否可以调查群体的遗传多态性)。

4.2. PCR检测方法

PCR技术是利用人工合成的一对引物分别与待扩增片段的两端侧翼序列互补，在DNA聚合酶催化作用下，以靶DNA序列为模板，dNTPs为原料，经过高温变性、低温退火和中温延伸进行靶DNA片段的百万倍的扩增反应 [32] 。沈海英等 [33] 分别提取鹿血、牛血、猪血和它们混合物的基因组，并利用相应的引物进行PCR扩增检测，结果用鹿、牛和猪的基因组均可扩增各自PCR产物，用鹿特异性引物扩增不同血液的基因组，结果显示该引物对鹿血具有特异性，进而可用于鉴别鹿制品的真伪。缺点：PCR检测方法进行鉴别相比传统方法更加客观可靠，但无法对其含量进行测定，鉴定方法有一定的局限性。

4.3. PCR-RFLP鉴定方法

PCR-RFLP技术是指利用通用引物扩增出特定基因，再根据不同物种在该区域不同的酶切位点，使用不同的限制性内切酶将扩增的基因片段切割成大小不同的片段，再通过凝胶电泳区分出不同物种 [34] [35] 。张学维等 [36] 采用通用引物对3种不同马鹿的线粒体12srRNA片段进行比对、分析再设计塔里木马鹿的特异性引物进行PCR鉴别，并寻找能够识别差异片段的限制性内切酶进行酶切鉴别，结果只有塔里木马鹿的基因组DNA可以获得扩增条带，可以对塔里木马鹿进行鉴别。徐岩等 [9] 提取各种鹿茸的基因组DNA，通过PCR反应对正品鹿茸的特异性片段进行扩增进行鉴别鹿茸的真伪，之后对正品鹿茸利用动物通用引物进行PCR扩增并通过限制性片段长度多态性进一步分析确定正品鹿茸的种属来源，结果表明通过特异性片段的PCR扩增可将梅花鹿、马鹿等多种伪品鹿茸加以区分，通过对限制性内切酶进行酶切后的片段长度可进一步区分梅花鹿与马鹿。王凤霞等 [19] 根据梅花鹿、马鹿、猪、牛、羊等基因序列的差异，设计鹿(梅花鹿、马鹿)与非鹿(猪、牛、羊、鸭)的限制性内切酶进行区分鉴别，结果建立的PCR-RFLP方法可以快速对鹿血及相关伪品进行鉴定，也可对梅花鹿及马鹿的血液进行区分鉴定，为鹿产品的质量控制提供技术支持。缺点：此鉴定方法存在一定的局限性，比如一些序列更改、以及目标序列中的缺失都可能导致限制位点的缺失，从而得到不正确的结果。

4.4. STR鉴定技术

STR又称短串联重复序列即微卫星，根据微卫星标记两侧的已知序列设计扩增引物获得扩增产物的分子标记，扩增得到的是包含微卫标记序列在内的片段，反映的是不同微卫星标记重复次数导致的多态性，为共显性标记；由于微卫星标记位点两端的序列保守性强，因此可以通过设计特异性引物来检测位点的多态性 [37] [38] 。由于STR分子标记具有多态性高、共显性、易检测、重复性高、数量丰富及对基因组有很好的覆盖性等特点 [39] [40] [41] [42] ，此外STR鉴定技术需要样品量少，对物种损坏小，通过非损伤取样法即可获得的大量遗传信息，是研究珍稀濒危植物的种群遗传多样性及保护种群资源的有力工具 [43] 。张守纯等 [44] 利用PCR-STR技术通过扩增17个基因座进而筛选用于东北马鹿的鉴定，结果显示有10个基因座分型效果稳定可用于东北马鹿的亲子鉴定。尹君等 [45] 利用12对微卫星对40份野生东北马鹿进行扩增，结果表明8对微卫星可用于马鹿的个体识别鉴定。耿广耀等 [46] 利用10对微卫星对22只豚鹿血样进行扩增分析，结果有7对微卫星可用于豚鹿遗传多样性的研究，进而鉴别豚鹿伪品。缺点：STR鉴定技术虽然操作简单且应用广泛，但是在前期筛选STR分子标记是比较困难，在没有相应的数据库，需要建立一个基因文库，在有数据库的情况下，需要反复的筛选分子标记，并验证是否具有多态性。

5. 小结

目前微卫星已在中药领域可用于伪品鉴定、品种鉴定、地域来源鉴别及遗传多样性分析等方面发挥重要作用 [47] - [57] ，说明微卫星分子标记技术在中药材物种、种质资源，建立标准数据库和分子身份证体系等方面的应用，不仅有利于中药材的质量控制，还在中药材种质资源保护与利用等领域均能发挥重要的推动作用。

随着对中药材的需求日益增加，鹿血作为中药材中的一种，由于鹿血来源稀少且药用价值及其珍贵，为确保鹿血的真实度和纯度，开发鉴别鹿血及常见家畜血液制品的STR分子检测技术，将为鹿血及其制品的质量保证和产业高质量发展提供坚实的技术基础。

基金项目

贵州省教育厅自然科学研究项目(黔教合KY字[2021]004)；贵阳市科技计划项目(筑科合同[2020]-18-4)；贵州省科技计划项目(黔科合支撑[2020]4Y209)；贵医开放课题黔教合KY字[2022]386号；贵州省科技厅黔科合基础ZK[2022]一般465。

文章引用

刘 爽,王一凡,杨心怡,刘德芳,黄春华,张书环,楼迪栋. 鹿血鉴定技术研究现状
Research Status of Deer Blood Identification Technology[J]. 药物资讯, 2023, 12(03): 202-208. https://doi.org/10.12677/PI.2023.123025

参考文献