¹湖南中医药大学，湖南 长沙

²湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙

³上海市东方医院，上海

收稿日期：2021年7月29日；录用日期：2021年9月7日；发布日期：2021年9月14日

摘要

目的：观察枸杞子–丹参对rd10小鼠视网膜内质网应激PERK-ATF4-CHOP通路的影响。方法：将40只rd10小鼠随机平均分为5组：空白组、对照组、枸杞组、丹参组、杞参组，分别予以生理盐水、维生素A溶剂、枸杞子中药配方颗粒溶液、丹参中药配方颗粒溶液、枸杞子加丹参中药配方颗粒溶液灌胃；8只C57小鼠为野生组，灌胃生理盐水。给药28天后，Western blot法检测各组小鼠视网膜GRP78、ATF4、eIF2α、CHOP相对表达情况。结果：杞参组小鼠视网膜GRP78、ATF4、eIF2α、CHOP相对表达量均低于空白组、对照组、枸杞组、丹参组(P < 0.05)。结论：枸杞子–丹参可以通过调控内质网应激PERK-ATF4-CHOP通路，抑制rd10小鼠视网膜细胞的凋亡，维持视网膜正常功能结构，从而保护视功能。

关键词

视网膜色素变性，内质网应激，细胞凋亡，枸杞子–丹参

Effect of Lycium barbarum and Salvia miltiorrhiza on PERK-ATF4-CHOP Pathway in Endoplasmic Reticulum Stress of Retina in rd10 Mice

Pengfei Jiang^1*, Chen Ou¹, Jun Peng^2#, Zhen Yao¹, Ye Tian¹, Yijing Yang¹, Houpan Song¹, Jian Xu³, Qinghua Peng^1#

¹Hunan University of Chinese Medicine, Changsha Hunan

²First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha Hunan

³Shanghai Dongfang Hospital, Shanghai

Received: Jul. 29^th, 2021; accepted: Sep. 7^th, 2021; published: Sep. 14^th, 2021

ABSTRACT

Objective: To observe the effect of Lycium barbarum-Salvia miltiorrhiza on the PERK-ATF4-CHOP pathway of rd10 mouse retinal endoplasmic reticulum stress. Methods: Forty rd10 mice were randomly divided into blank group, control group, Lycium barbarum group, Salvia miltiorrhiza group, and Lycium barbarum-Salvia miltiorrhiza group (the qishen group), and they were given intragastrically: normal saline, vitamin A solvent, wolfberry Chinese medicine formula granule solution, Salvia miltiorrhiza Chinese medicine formula granule solution, Lycium barbarum and Salvia miltiorrhiza granule solution by gavage; eight C57 mice were in the wild group and normal saline was gavage. After 28 days of administration, the relative expressions of GRP78, ATF4, eIF2α and CHOP in the retina of each group were detected by Western blot. Results: The relative expression levels of GRP78, ATF4, eIF2α, and CHOP in the retina of mice in the Qishen group were lower than those of the blank group, control group, lycium barbarum group, and Salvia miltiorrhiza group (P < 0.05). Conclusion: Lycium barbarum-Salvia miltiorrhiza can regulate the endoplasmic reticulum stress PERK-ATF4-CHOP pathway, inhibit the apoptosis of rd10 mouse retinal cells, maintain the normal functional structure of the retina, and protect visual function.

Keywords:Retinitis Pigmentosa, Endoplasmic Reticulum Stress, Apoptosis, Lycium barbarum-Salvia miltiorrhiza

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1. 引言

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)是常见的眼底病变，以慢性进行性视力损害并伴有眼底色素变化为特点，早期有夜盲症状，也可有旁中心暗点，晚期对视力、视野损伤较大 [1]。本团队前期对RP病因病机、治疗等方面进行了大量研究，发现RP患者多为虚中夹瘀之证，故提出以补虚活血法治疗RP，已得到中医眼科同道的广泛认可 [2] [3] [4]。基础研究表明，补虚活血代表性药物枸杞子–丹参能抑制RP动物模型感光细胞凋亡，维持视网膜超微结构正常功能和形态 [5] [6] [7]，但枸杞子–丹参治疗RP的深层分子生物学机制尚不明确。内质网应激是内源性凋亡途径的一种，PERK-ATF4-CHOP通路是内质网应激途径的关键通路 [8]，本研究在前期研究的基础上，研究了枸杞子–丹参对RP动物模型rd10小鼠视网膜内质网应激PERK-ATF4-CHOP通路的影响，以探讨枸杞子–丹参治疗RP的内在分子生物学机制。

2. 材料与方法

2.1. 动物

40只4周龄SPF级rd10小鼠(证书编号：NO. 191A11353)，8只4周龄SPF级C57小鼠(证书编号：43004700062254)，均雌雄各半，饲养于湖南斯莱克景达公司动物实验中心SPF房，室温(22 ± 2)℃，湿度50%~55%，定期更换垫料，自由饮食。本研究经湖南斯莱克景达公司动物实验中心伦理审批。

2.2. 药物

枸杞子中药超微配方颗粒(批号：190247)，丹参中药超微配方颗粒(批号：190131)，维生素A软胶囊(批号：140701)。

2.3. 主要试剂与仪器

GRP78 (abcam公司，货号：ab21685)、ATF4 (abcam公司，货号：ab184909)、eIF2α (abcam公司，货号：ab169528)、CHOP (abcam公司，货号：ab11419)、GAPDH (abcam公司，货号：ab10009)。Tris (美国Sigma，货号：V900483)、APS (中国上海国药，货号：10002618)。摇床(其林贝尔，型号：TS-92)、显微镜(Motic，型号：BA210T)、电泳仪(中国北京六一，型号：DYY-2C)、水平琼脂糖电泳槽(中国北京六一，型号：DYCP-31DN)。

2.4. 分组与给药

采用随机数表法将40只SPF级rd10小鼠随机平均分为5组，分别为：空白组、对照组、枸杞组、丹参组、杞参组，每组8只；8只SPF级C57小鼠为野生组；每组雌雄分开饲养。

所有小鼠适应性饲养1周后给予灌胃，灌胃时间为28天，灌胃剂量均为20 mL/kg∙d。野生组与空白组灌胃生理盐水，对照组灌胃VitA溶剂(维生素A溶于DMSO溶剂，再配置成水溶液)，枸杞组灌胃枸杞子中药配方颗粒溶液(3 g配方颗粒溶于40 mL灭菌蒸馏水中)，丹参组灌胃丹参中药配方颗粒溶液(1.8 g配方颗粒溶于40 mL灭菌蒸馏水中)，杞参组灌胃枸杞子加丹参中药配方颗粒溶液(3 g枸杞子配方颗粒 + 1.8 g丹参配方颗粒溶于40 mL灭菌蒸馏水中)。

2.5. Western blot法检测rd10小鼠视网膜GRP78，ATF4，eIF2α，CHOP蛋白表达

冰预冷PBS清洗视网膜组织，加入150 uLRIPA裂解液于生物样品均质仪中，冰上裂解10分钟，离心15 min，将离心后的上清转移倒1.5 mL的离心管中。经制胶、电泳、转膜、一抗孵育、二抗孵育、显色曝光后，显影冲洗。

2.6. 统计学方法

实验数据采用SPSS23.0分析，计量资料以 $\bar{x}\pm s$ 表示，多组比较采用方差分析或秩和检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

杞参组小鼠视网膜GRP78，ATF4，eIF2α，CHOP平均光密度低于空白组、对照组、枸杞组、丹参组(P < 0.05)，见表1，图1。

表1. 各组小鼠视网膜内质网应激通路相关靶点相对表达量(n = 8, $\bar{x}\pm s$ )

注：^*表示与野生组相比P < 0.05；^#表示与空白组相比P < 0.05；^▲表示与对照组相比P < 0.05；^Δ表示与枸杞组相比P < 0.05；°表示与丹参组相比P < 0.05。

图1. 各组小鼠视网膜蛋白表达情况

4. 讨论

目前多认为RP视力不可逆性下降的主要原因是视网膜感光细胞的凋亡，内质网凋亡途径是细胞凋亡途径的一种，主要包括内质网应激诱导凋亡、内质网钙离子诱导凋亡、内质网凋亡底物介导的凋亡 [9] [10]。内质网腔内包含多种凋亡相关蛋白，如Caspase-12、Bcl-2等，本团队前期研究发现枸杞子–丹参能提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，降低促凋亡蛋白Caspase-12的表达 [11] [12]。

内质网应激时，未折叠或错误折叠蛋白在内质网内蓄积，触发未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)。UPR可以激活蛋白激酶R样内质网激酶(Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinas, PERK)，上调内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)基因表达，在早期可以促进视网膜中蛋白质的合成，但随着UPR的进展，过度的UPR引起视网膜Ca²⁺紊乱，加速细胞凋亡 [13]，PERK位于内质网膜上，与葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein78, GRP78)解离后形成同源二聚体，并发生自身磷酸化激活，PERK激活后可促进真核起始因子2α (eukaryotic translation-initiation factor 2α, eIF2α)磷酸化，也可通过下游的激活转录因子4 (activating transcription factor 4, ATF4)上调C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)的表达 [14]，最终在GADD34、Bim等基因的共同作用下，引发了细胞凋亡。在RP病变中，ERS诱导的凋亡与RP疾病进展有关 [15]，在视网膜使用KUS121，可以抑制ERS，从而很明显抑制细胞凋亡，保护了光感受器细胞，尤其视锥细胞，这对维持晚期RP患者的中心视力有非常积极、重要的作用 [16]。

枸杞子味甘，性平，归入肝经与肾经，有补益肝肾的功效，丹参味苦，性微寒，归入心、肝经，有活血化瘀的功效。网络药理学研究表明枸杞子–丹参治疗RP的主要作用靶点是视紫红质(Rhodopsin, RHO)蛋白，而作用途径主要是通过抑制视网膜感光细胞的凋亡通路。虹膜色素上皮细胞(Iris pigment epithelial cells, IPEc)与视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelial cells, RPEc)细胞的基因表达具有明显的差异性，而枸杞子的有效活性成分如黄豆素黄酮、花色素苷、亚麻酸乙酯、五羟黄酮、岩皂甾醇等能够作用于IPEc与RPEc的差异基因，促进IPEc分化为RPEc，从而治疗RP [17]。RHO又名视网膜变性蛋白，是最早被发现的RP基因，主要分布于视杆细胞的细胞膜上，RP的发生与RHO功能障碍有关，网络药理学还发现枸杞子能调控RHO蛋白的表达 [18]。丹参中所含的隐丹参酮、木犀草素、丹参酮IIA等化学成分，能干预RP病理过程中的细胞周期等通路，抑制视网膜感光细胞的凋亡等过程，减少感光细胞损伤 [19]。枸杞子–丹参药对共有19个入血活性成分，可作用于与RP相关的79个致病基因 [20]。

本研究对各组小鼠视网膜中内质网应激相关蛋白GRP78、ATF4、eIF2α、CHOP进行了检测，发现在rd10小鼠的视网膜细胞中内质网应激蛋白表达较C57小鼠增高，经过枸杞子–丹参灌胃干预28天后，rd10小鼠视网膜内质网应激蛋白表达明显降低，说明枸杞子–丹参可抑制内质网应激，进而调控内质网凋亡途径，减轻rd10小鼠视网膜感光细胞的凋亡。但本研究仅检测了内质网应激相关蛋白的主要指标，枸杞子–丹参可能也对内质网应激相关的其他蛋白起作用，今后可更加深入地研究枸杞子–丹参治疗RP的分子生物学机制，为创新药物的研发提供理论依据。

基金项目

国家自然科学基金资助项目(81804150，82074196)，湖南省自然科学基金项目(2019JJ40226)，湖南省研究生科研创新项目(CX2018B497)，湖南中医药大学研究生创新课题(2018CX40)。

文章引用

蒋鹏飞,欧 晨,彭 俊,姚 震,田 野,杨毅敬,宋厚盼,徐 剑,彭清华. 枸杞子–丹参对rd10小鼠视网膜内质网应激PERK-ATF4-CHOP通路的影响
Effect of Lycium barbarum and Salvia miltiorrhiza on PERK-ATF4-CHOP Pathway in Endoplasmic Reticulum[J]. 中医学, 2021, 10(05): 644-649. https://doi.org/10.12677/TCM.2021.105087

参考文献