ABSTRACT

DNA was extracted from young leaves of 82 fig germplasm collected by following the modified CTAB method. DNA was amplified by sequence-related Simple Sequence Repeats molecular markers to analyze genetic diversity and genetic similarity among 48 bands detected by 8 selective primer pairs. On average, each primer combination amplified 6.0 loci. The genetic similarity of 82 fig germplasm ranged from 0.048 to 1.00 with an average of 0.377. The genetic similarity that estimated by NTSYS pc-V. 2.1 was used for Unweighted Pair Group Method Analysis. According to the genetic similarity of 0.42, 82 fig germplasm were divided into 6 groups, which indicated that there were abundant germplasm resources. It was concluded that 82 fig germplasm share low genetic similarity and high genetic diversity.

Keywords:Fig (Ficus carica Linn), Polymerase Chain Reaction, Simple Sequence Repeats, Genetic Diversity

82份南疆无花果种质资源遗传多样性的 SSR分析

刘春艳¹，李鹏²，阿不都卡迪尔·艾海提¹，张琦¹，黄光辉³，艾斯卡尔·买海提⁴，何良荣^1*

¹塔里木大学植物科学学院，新疆 阿拉尔

²塔里木大学信息工程学院，新疆 阿拉尔

³新疆第十四师农业科学所究所，新疆 和田

⁴新疆克孜勒苏柯尔克孜自治州林管站，新疆 阿图什

收稿日期：2018年12月24日；录用日期：2019年1月4日；发布日期：2019年1月11日

摘 要

本研究采用SSR分子标记技术对从和田、喀什和阿图什等地收集的82份无花果种质资源进行DNA水平遗传多样性评估，采用改良CTAB法提取叶片基因组DNA。利用8对SSR分子标记分析，共检测到48个多态性条带，平均每个引物可检测到6个条带；82份种质的相似性系数在0.048~1.00，平均为0.377；82份无花果供试材料经聚类分析在相似系数为0.42时划分为6大类，结果表明南疆无花果所蕴含的种质。

关键词 :无花果，PCR，SSR，遗传多样性

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1. 引言

无花果(Ficus carica Linn.)属于桑科榕属无花果亚属，为落叶灌木或乔木，因无花果的小花隐藏在花托内，为隐头花序，只能看到花托形成的假果而看不到花，我们吃的是它膨大的花序轴，故称“无花果”。无花果具有很高的药用价值及营养价值，果、叶、根均可入药；无花果树枝繁叶茂，树态优雅，具有较好的观赏价值，是园林绿化、美化和盆栽观赏的优良花卉树种；是无公害绿色食品，栽培技术简便，适应性广 [1] [2] [3] [4] 。近年来随着生活水平的提高，人们越来越重视健康，无花果作为第三代保健型水果受到人们的青睐。

无花果的研究经历了从表型到分子层面的转变，分子标记技术近二、三十年来发展很快，主要有RFLP、RAPD、AFLP、CISH、SRAP、TRAP、ESTs、SNP、SSR。从染色体组型到SSR的过渡，目前SSR技术是最为常用的，成功的可能性最高的一种研究方法 [5] - [10] 。

无花果在新疆南疆地区种植分布零散，种植区域之间距离较远，本试验利用SSR分子标记技术，对南疆无花果资源进行DNA水平遗传多样性评估，能更好了解南疆蕴藏的无花果种质资源现状，为种质资源的有效保存和利用奠定理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 试验材料

以从和田、阿图什、新和、喀什、阿拉尔等地采集的82份无花果种质的叶片为试验材料，采集地点及生境信息见表1，各材料的名称及来源情况见表2。

表1. 无花果采集地点和生境信息

表2. 试验种质名称及来源

2.2. DNA的提取

叶片DNA的提取分为研磨、裂解、萃取、沉淀、洗脱、干燥、溶解7个步骤，详细过程参考刘春艳等 [11] 的提取方法。

2.3. DNA的鉴定

核酸浓度用NanDrop2000 Spectrophotometer测定，根据A260/A280或 A260/A230值判断DNA纯度，DNA分子片段的长度及降解程度可通过0.8%琼脂糖凝胶电泳，电泳液为0.5 × TBE缓冲液进行检测，电泳结果在BIO-RAD ChemiDocTM XRS + 中观察照相。

2.4. PCR扩增反应与毛细管电泳

用8对引物对收集的82份材料进行分析，引物序列见表3。PCR体系由2.0 μL 10 × Buffer，0.4 μL 10 mmoldNTP，0.2 μL Primer-F，0.2 μL Primer-R，0.2 μL DNA聚合酶，5.0 μL模板DNA，7.0 μL ddH₂O组成，总体系为15 μL。反应在C1000TMThermal Cycler中进行，PCR扩增程序为：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃适温延伸40 s，34个循环，最后4℃保存 [11] 。DNA扩增片段通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，Bio-Rad ChemiDocTM XRS + 凝胶成像系统照相，选用Trans5K DNA Marker判断DNA扩增片段大小。

表3. 引物序列及碱基数目

PCR扩增产物用NGS Fragment Analyzer™进行毛细管电泳法检测，毛细管电泳所用胶根据样品数而定，若是1F + 7GP模式，即插入染料体积为1.25 μL，分离胶的体积为25 ml，结果用其配备的PRO Size™分析软件进行分析 [12] 。

2.5. 遗传相似系数计算与绘制DUPGMA聚类图

根据引物扩增得到的SSR标记信息，转化为“01”矩阵，有带记为1，无带为0，利用NTsys 2.10e聚类分析软件进行遗传多样性分析，计算各材料间的相似系数，聚类分析按基于Nei-Li遗传相似系数按不加权成对数算术平均法(Unweighted pair group method with arithmetic，UPGMA)进行，绘制聚类图 [13] 。

3. 结果与分析

3.1. DNA样品的纯度与浓度分析

用NanDrop 2000 Spectrophotometer仪器测得样品DNA含量，A260表示核酸在波长为260 nm时的吸光值，A280是蛋白质和酚类物质在最高吸收波长280 nm处的吸光值，A230是碳水化合物最高吸收峰的吸光值，纯DNA的A260/A230值约为2.5，纯DNA的A260/A280比值约为2.0，均能满足SSR分子标记需要。

3.2. SSR标记结果与分析

从表4可知，82个无花果叶片材料经8对引物共检测到48个多态性条带，平均每个引物可检测到6个条带，每个材料平均可检测到0.6个标记；8对引物扩增的条带范围集中在110 bp~320 bp之间。

引物WHG-6在82个材料中扩增得到13个条带(见表5)，为最多，引物WHG-4和WHG-5只有2条带最少。以引物WHG-3为例，82个材料中扩增得到的5个条带大小在118 bp~132 bp之间，每个材料的扩增结果见表5。通过对比发现，同一种材料采用不同的引物进行扩增，得到的条带数不同，大小分布情况有所差异。

表4. 引物扩增信息结果

表5. SSR片段大小分布情况(引物WHG-3为例)

3.3. 遗传相似性分析

根据8对引物扩增得到的48个SSR标记信息，有SSR标记片段记为“1”，无记为“0”，得到01矩阵，利用NTsys 2.10e聚类分析软件计算出94份无花果材料的遗传相似性系数(表6)及绘制聚类图，最大值为1.00，最小值为0.048 (移栽1~2、移栽1~6与阿图什8之间)，平均为0.377。

表6. SSR标记得到82个无花果材料间的部分遗传相似系数(其中14个为例)

3.4. 聚类分析

依据表6的相似性系数，利用UPGMA聚类分析结果见图1，由图看出，82份种质共计40类，供试材料在相似系数为0.42时分为六个类群。第I类群包含1、10、24、59、60、61、45、69、70、71、72、75、73、58、64、65共16个；第II类群包含21、30、31、33、50共5个；第III类群包含9、25、27、29、35、38、28、36、49、42、43、48、67、63、34共15个；第IV类群包含37、52、53、76、44共5个；第V类群包含2、3、4、5、6、7、11、12、14、15、16、17、18、19、20、32、13、40、41、51、57、66、74、77、79、80、81、56、78、82、55、54、39、68、62共35个；第VI类群包含8、26、47、22、23、46共6个。

从图1可知，来自喀什、和田、阿图什、新和及塔大的本地无花果材料，如喀什1~7号、塔大1~3号、和田无花果王、新和5号、和田2、10号聚为第V类，虽然聚居地不同，但仍聚为一类，说明聚居地对无花果的遗传改良作用不大。

图1. 基于SSR标记数据绘制的UPGMA聚类图

新和采集的5份材料分布于I、III、V、VI类群，塔大移栽的28份无花果资源分布于I、III、IV、V类群，阿图什采集的无花果种质分布于I、II、III、V、VI类群，和田的10份无花果资源分布于I、II、III、IV、V、VI类群。可见，新和、阿图什、和田、塔大移栽的无花果类型丰富。

4. 结论与讨论

4.1. SSR标记对无花果资源多样性分析是可行的

82份种质共检测到48条多态性条带，每个引物平均得到6条带；82份所有种质的相似性系数在0.048~1.00，平均为0.377，遗传相似性低，遗传基础差异较大。

条带检测结果与引物，各种成分的组合比例，扩增程序的设定，操作过程有关。个别试验材料经毛细管电泳不能扩增得到多态性条带，82份种质共检测得到的条带为48条多态性条带，结果可能与引物有关，因所用引物只有8对，部分材料不能特异性结合产生特异性片段，且试验存在误差，操作过失，扩增过程中变性、复性、延伸的时间不恰当等、都会造成个别材料没有谱带。所提取的DNA纯度不高，可依次用酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇抽提，去除蛋白质，加入RNA酶去除RNA，以确保试验结果的精确性。

关于SSR分子标记技术在作物遗传育种中的应用罗冉 [14] 等作了详细的讲述，SSR所用DNA量少且质量要求低，即使是部分降解的样品也可进行分析；结合相关分析、聚类分析等数量遗传分析手段，可以对不同亲缘物种进行分类，判断其亲缘关系，评价不同品种的异质性并进而划分杂交优势群。胡杨、梁俊、昝逢刚已经在甘蔗种质上成功应用，本试验所用的方法借鉴了他们的方法，在此基础上作了适当的调整，利用其多态性丰富、提供遗传信息多、操作便利、在基因中分散分布等特点，根据聚合酶链式反应原理，对无花果的SSR-PCR反应体系各个成分的浓度、用量、组合效应及扩增程序等的优化成功得到清晰、准确的多态性标记，且降低试验成本，能更好地探索南疆无花果种质资源的遗传多样性规律，为进一步进行无花果的种间杂交提供基础。

4.2. 南疆无花果82份资源划分为6类，多样性丰富

将82份无花果供试材料经聚类分析在相似系数为0.42时划分为6大类；南疆蕴含的无花果种质资源丰富，阿图什、新和、和田等地种植的无花果类型多样，可为以后的进一步更深入研究提供基础 [14] 。

4.3. 南疆无花果资源遗传多样性来源于外地引种

研究结果显示来自和田、喀什、阿图什和新和的本地无花果聚为一类，遗传无差异，聚居地对遗传无影响，无花果以扦插、压条为主进行无性繁殖，出现遗传变异的几率低。阿图什、新和、和田等地的无花果种质资源中，除本地无花果以外，均为近5~6年从内地引进的，可见种质资源丰富源自于引种。

基金项目

新疆兵团博士资金专项《南疆无花果种质资源多样性研究》(2014BB013)；新疆第一师科技局项目《南疆无花果设施栽培技术体系的建立》(2016YY10)；大学生创新项目(国家级)《无花果扦插育苗体系的建立》(107572017057)。

文章引用

刘春艳,李 鹏,阿不都卡迪尔•艾海提,张 琦,黄光辉,艾斯卡尔•买海提,何良荣. 82份南疆无花果种质资源遗传多样性的SSR分析
Genetic Diversity Analysis of 82 Collections of Fig Germplasm in Southern Xinjiang with SSR Markers[J]. 植物学研究, 2019, 08(01): 50-59. https://doi.org/10.12677/BR.2019.81007

参考文献