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Advances in Marine Sciences
Vol. 09  No. 02 ( 2022 ), Article ID: 53184 , 10 pages
10.12677/AMS.2022.92019

邻苯二甲酸二丁酯暴露对大型溞miR-153及AKT基因表达的影响和功能分析

张晶，魏呈卉，魏杰，张泽，张园雯，王汨*

辽宁省省级高校水生生物学重点实验室，大连海洋大学，辽宁 大连

收稿日期：2022年5月23日；录用日期：2022年6月20日；发布日期：2022年6月30日

摘要

microRNAs参与调控动物所有的生命过程，包括生长、发育、生物和非生物应激反应等。microRNAs与其调控的靶基因已被证实参与水生动物对环境胁迫的应答。为了探究miR-153的生物学功能及邻苯二甲酸二丁酯(DBP)暴露对大型溞miR-153及其靶基因AKT表达的影响，我们对各物种miR-153序列进行多序列比对，利用miRanda和TargetScan分析miR-153的靶基因并对其进行功能富集分析，实时荧光定量PCR检测了miR-153和AKT在DBP暴露后大型溞体内的表达变化。结果显示，多序列比对发现11个物种miR-153基因序列保守性很高，20个碱基完全一致；miR-153的742个靶基因，主要富集在DNA模板和转录调控、氧化还原和信号转导等生物学过程，且靶基因参与胞吞、平滑肌收缩、细胞色素P450对异生素的代谢等代谢信号通路的调节；不同浓度、不同时间的DBP暴露后，与对照组相比，大型溞miR-153表达量出现了极显著上升(p < 0.01)，AKT基因的表达量与之相反，表现出miR-153和AKT的负调控关系。结果表明，在DBP暴露下miR-153可能通过靶向AKT基因，影响AKT下游相关基因的表达，导致AKT参与的大型溞生命活动失调，本实验为解析DBP对水生动物的毒理机制提供科学参考。

关键词

邻苯二甲酸二丁酯，大型溞，miR-153，AKT

Expression and Function Analysis of miR-153 and AKTgene in Daphnia magna Exposed to Dibutyl Phthalate

Jing Zhang, Chenghui Wei, Jie Wei, Ze Zhang, Yuanwen Zhang, Mi Wang*

Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province, Dalian Ocean University, Dalian Liaoning

Received: May 23rd, 2022; accepted: Jun. 20th, 2022; published: Jun. 30th, 2022

ABSTRACT

MicroRNAs are involved in the regulation of animal life processes, including growth, development, biotic and abiotic stress responses. MicroRNAs and target genes have been shown to be involved in the response of aquatic animals to environmental stress. To explore the biological function of miR-153 and the effect of dibutyl phthalate (DBP) exposure on the expression of miR-153 and its target gene AKT in Daphnia magna, we performed alignment of miR-153 sequences of various species. Miranda and Targets can were used to analyze the target gene of miR-153 and perform functional enrichment analysis. The changes of miR-153 and AKT in D. magna after DBP exposure were detected by real-time quantitative PCR. The results showed that the sequence of miR-153 in 11 species was highly conservative, and 20 bases were completely consistent. The 742 miR-153 targeted genes are mainly concentrated in DNA template, transcriptional regulation, redox, signal transduction biological processes. miR-153 targeted genes are involved in the regulation of endocytosis, smooth muscle contraction, cytochrome P450 metabolism of allotropin and other metabolic signaling pathways. After DBP exposure at different concentrations and at different times, compared with the control group, the expression of miR-153 in D. magna increased significantly (P < 0.01), and the expression of AKT gene was opposite. It showed a negative regulatory relationship between miR-153 and AKT. The results showed that miR-153 may affect the expression of AKT downstream-related genes by targeting AKT genes after DBP exposure, leading to an imbalance in the vital activities of D. magna involved in AKT. This experiment provides a scientific reference for analyzing the toxicological mechanism of DBP on aquatic animals.

Keywords:Dibutyl Phthalate, Daphnia magna, miR-153, AKT

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)是一种常见的全球性有机污染物，作为增塑剂被广泛应用到涂料、包装材料和化妆品等塑料制品中 [1]。它作为内分泌干扰物质在生物体内产生生殖毒性、致癌、致畸性、致突变等毒性效应 [2]。随着塑料制品大量生产和广泛使用，DBP不可避免的进入了水环境，目前在水体、生物体、沉积物等环境样品中普遍检测到DBP的存在 [3]。DBP还可以在生物体内蓄积，通过食物链危害水生生物和以水生生物为食的其他动物。有研究发现，随着DBP浓度的增加，大黄鱼(Larimichthys crocea)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、鲤(Cyprinus carpio)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等受精卵的孵化率逐渐降低，死亡率和变形率逐渐升高，影响鱼类等水生动物正常的发育和繁殖 [4] [5]。课题组也报道了DBP对大型溞(Daphnia magna)成溞和幼溞的急、慢性毒性、生殖毒性效应等和机体的氧化损伤 [6] [7]。

MicroRNAs (miRNAs)是一类由20~25个核苷酸组成的、保守的非编码单链小分子RNA，通过与靶基因mRNA 3′端非翻译区完全或不完全互补配对 [8]，降解靶基因mRNA或抑制其翻译。每个miRNA可以同时影响几十甚至几百个mRNA序列的翻译，调控靶基因参与的细胞重要生命活动 [9]。在斑马鱼(Brachydanio rerio)中检测到一些与细胞增殖和心脏发育相关的miRNA，如miR-738过表达导致斑马鱼胚胎心脏显著增大，miR-738可通过Wnt信号通路调控斑马鱼的心脏发育。miR-155在氟虫腈作用下负调控cyb561d2基因，从而影响斑马鱼细胞增殖以及存活率 [10] [11]。miR-8家族调控斑马鱼胚胎的渗透调节，能够在鳃形成前的早期发育阶段精确控制离子细胞中的离子转运 [12]。据报道有一些与环境胁迫应答相关的miRNA，在外界不利环境的刺激下，参与细胞调控，使机体对外源污染物产生防御 [13]。在重金属镉的暴露下，鲤鱼体内与免疫相关的miR-155和miR-181a表达量升高，miR-155和miR-181a通过靶向HO-1基因参与镉暴露引起的肾脏免疫毒理学效应 [14]。牡蛎(Ostrea gigas tnunb)血细胞在受到细菌攻击或热应激胁迫后，miR-10a-5p和miR-184b受到调控，用来维持牡蛎机体正常的生理功能 [15]。有研究表明蚤状溞(Daphnia pulex)对重金属镉的耐受性与miRNA有关，如miR-2、miR-33，miRNA通过调控GTPase和角质层蛋白通路途径，将细胞能量分配转换为解毒过程，从而提高蚤状溞对镉的耐受性 [16]。

大型溞是一种广泛分布的浮游动物，是淡水生态系统食物网中的关键一环，由于其繁殖力强、生长速度快、饲养方便、易于操作、生活史丰富，常被用作水生态毒理学测试的模式生物 [17]。目前关于DBP等典型水环境污染物对水生生物机体生理生化反应和基因转录影响的研究较为普遍，对DBP暴露下水生动物miRNA作用机制的研究未见报道。miR-153是一个在进化上高度保守的miRNA，通过调控其靶基因，参与细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡等生命活动 [18]。AKT作为miR-153的靶基因，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也称为蛋白激酶B，参与各种信号通路，如细胞增殖、存活、代谢的信号通路 [19] [20]。本文以大型溞为对象，对miR-153的靶基因进行GO和KEGG功能富集分析，研究暴露于不同浓度、不同时间的DBP对大型溞miR-153和靶基因AKT表达的影响，以期鉴定参与DBP胁迫反应的关键基因，研究结果将有助于揭示DBP对大型溞的毒性效应和致毒机制。

2. 材料与方法

2.1. 实验动物和药物处理

实验动物大型溞来源于辽宁省水生生物重点实验室。取一只雌溞进行孤雌生殖，第一批幼溞培养密度为30 ± 5只/L，培养3~5代，获得足够数量的同步溞用于后续实验。

大型溞共分三组，两组将大型溞分别暴露于亚致死浓度1.0和2.0 mg/L的DBP中，一组作为对照。每组设置4个重复，每个重复烧杯中放入100只大型溞。为了避免大型溞摄食影响实验结果，实验期间不投喂。24和48 h后将存活的大型溞分别放入1.5 ml离心管中，吸干水分。处理好的离心管保存到碎冰中，用于后续miR-153和AKT基因的qPCR分析。

2.2. miR-153序列的保守性

大型溞miR-153序列来自于课题组前期DBP暴露下大型溞miRNA表达谱测序数据，序列为UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUG，与蚤状溞miR-153序列一致。从miRbase数据库中检索获得10个物种(蚤状溞，人类，小鼠，家鸡，非洲蟾蜍，斑马鱼，猪，穴兔，猕猴，马)的miR-153的序列。采用MEGA 7.0软件的cluster w算法进行多序列比对。

2.3. 靶基因预测和富集分析

miR-153的靶基因通过TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_80/)和miRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)获得。

使用GO和KEGG分析miR-153靶基因的主要生物学功能及参与的主要信号通路。富集显著性的阈值为0.05，通过显著性富集分析能确定miRNA-mRNA关系行使的主要生物学功能。

2.4. qPCR

每个重复取40只活的大型溞立即在冰上用研钵在RNeasy溶液(QIAGEN，美国)中匀浆，经过消化、离心、洗脱等操作之后。用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒(宝生物工程大连有限公司)提取来自大型溞的总RNA，获得的RNA分装之后，存放到−80℃的冰箱中。

在1.2%琼脂糖凝胶上分析RNA的完整性。使用Scientific nano drop 2000 (nano drop Technologies Wilmington, USA)检测样品总RNA的浓度和纯度。miR-153采用湖南艾科瑞生物工程有限公司提供的miRNA 1st strand cDNA synthesis kit和SYBR® Green Premix Pro Taq HS q-PCR Kit II (Rox Plus)试剂盒。AKT基因表达用艾科瑞生物公司的Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR对大型溞的总RNA进行反转录。qPCR在Applied Biosystems™ 7500仪器进行，反应条件：95℃ 30 s，(95℃ 5 s 60℃ 20 s)，40个循环。以U6作为miR-153的内参基因，Beta-actin作为AKT的内参基因。大型溞AKT基因NCBI序列号为：LOC116917643。用NCBI-Primer 设计特异性引物，大型溞U6、Beta-actin引物从文献中引用 [21] [22]，用于qPCR的引物序列如表1所示，由生工生物工程(上海)完成。应用2–ΔΔct法计算大型溞miR-153和AKT基因的相对表达量。

Table 1. Primers for qPCR

表1. qPCR所用引物

2.5. 数据处理

使用Excel (T-test检验)和SPSS 17.0 (one-way ANOVA)软件分析对照组和DBP处理组大型溞miR-153和AKT基因的表达量变化，p < 0.05为差异有统计学意义(用*表示)，p < 0.01为差异极其显著(用**表示)。

3. 结果

3.1. miR-153序列保守性分析

在miRBase数据库中获得蚤状蚤、斑马鱼、非洲蟾蜍等10个物种的miR-153基因序列。大型溞、蚤状溞、斑马鱼和人类等11个物种的miR-153和靶基因互补结合的种子序列用绿色标记出来(表2)。各个物种miR-153序列长度为20到23个碱基不等，其中大型溞miR-153序列长度为22个碱基。

基于Clustal W算法的多序列对比分析，发现大型溞miR-153与近缘物种蚤状溞的序列完全一致，结果符合两个物种的进化关系。而且大型溞、斑马鱼、鸡、兔、马、小鼠、猴和人等11个物种，从低等到高等动物的miR-153的20-23的核苷酸序列中，第1到第20个核苷酸碱基完全一致，各物种序列仅有1~3个核苷酸的差异(图1)，说明miR-153在生物进化过程中高度保守。

Table 2. Mature sequences of miR-153 in eleven species

表2. 11个物种中miR-153的成熟序列

Figure 1. Alignment analysis of miR-153 mature sequences in eleven species

图1. 11种物种中miR-153成熟序列的多序列比对

3.2. miR-153靶基因富集分析

通过miRanda和TargetScan获得miR-153的靶基因共有742个。将miR-153靶基因对应的GO注释按照分子功能、细胞组分和生物学过程分为三类。按照靶基因数量从高到低排序(图2)，miR-153的靶基因主要聚集在细胞膜(membrane)、细胞器质膜(integral component of membrane)和细胞核(nucleus)等亚细胞组成成分中。miR-153靶基因所参与生物学过程有DNA模板和转录调控(regulation of transcription, DNA-templated)、氧化还原过程(oxidation-reduction process)和信号转导(signal transduction)等，这些靶基因主要具有与金属离子结合(metalion binding)和蛋白质结合(protein binding)的分子功能(图2)。

Figure 2. Go enrichment analysis of target genes of miR-153

图2. miR-153靶基因的GO富集分析

使用ggplot2对KEGG富集分析结果以散点图形式呈现(图3)，发现miR-153的靶基因聚类到118条KEGG通路。Rich Factor越大，靶基因所在的细胞信号通路富集程度越高。P value值越小，富集越显著。miR-153的靶基因主要富集在胞吞(Endocytosis) (358个)、平滑肌收缩(Vascular smooth muscle contraction) (175个)、细胞色素P450对异生素的代谢(Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450) (44个)等信号通路。

3.3. DBP暴露对大型溞miR-153和AKT表达水平的影响

在DBP的暴露下，大型溞的miR-153表达量变化如图4(A)所示。与对照组相比，暴露在浓度为1.0和2.0 mg/L的DBP溶液24、48小时后，miR-153表达量均出现极显著升高(p < 0.01)。大型溞miR-153表达量变化与DBP处理时间和浓度相关，在2.0 mg/L的DBP中处理48小时后，miR-153表达量最高。

从图4(B)可以看出，与对照组相比，大型溞暴露于1.0和2.0 mg/L的DBP溶液中24和48小时后，AKT的mRNA表达水平均出现极显著降低(p < 0.01)，表明AKT对DBP暴露很敏感，在不同的浓度和时间节点都呈现为低表达。

Figure 3. KEGG enrichment analysis of target genes of miR-153

图3. miR-153靶基因的KEGG富集分析

Figure 4. qPCR analysis of miR-153and AKT expression levels in Daphnia magna exposed to DBP (A: Expression of miR-153; B: Expression of AKT)

图4. DBP暴露下大型溞miR-153和靶基因AKT的相对表达量(A：miR-153的相对表达量；B：AKT的相对表达量)

4. 讨论

由于DBP在水环境的持续输入和具有生物富集性，DBP的水生态毒理效应已成为国内外关注的热点。研究证明DBP对水生动物有明显毒性，导致动物死亡、生殖发育畸形、精子损伤、性别错乱等 [23] [24]。miRNAs是生物体内一类短的非编码内源性RNA家族，参与各种细胞的生物学过程，在基因表达过程中起到重要调控作用，并且参与生物的生长和发育以及胁迫响应 [25]。非生物应激因素(如高温、寒冷、重金属和有机污染物等)对生物体miRNA的表达有显著影响 [26] [27]。DBP作为环境中普遍存在的污染物，其急、慢性毒性以及生殖毒性等研究已较为深入 [28]，但是在miRNA参与的细胞内基因的信号通路层面了解DBP毒性作用机制的研究还未见报道。

大型溞对水环境中的污染物敏感性高，被用作生态毒理学模式生物，评估淡水生态系统中存在的污染物的毒性效应 [29]。为了探讨miR-153在DBP暴露对大型溞的毒性作用中可能介入的生物学过程，我们首先进行了miR-153的保守性和靶基因的功能富集分析。在miRBase数据库中对miR-153基因序列进行搜索，发现miR-153广泛存在于从低等到高等的各种物种。目前分析miRNA的靶基因所使用的生物信息学算法是通过miRNA和mRNA的3'末端非翻译区之间的序列互补性进行的，识别的重点位置是miRNA的种子区域(核苷酸2-8)。我们在大型溞、蚤状溞等11个物种的miR-153序列中标注出其种子序列(表1)。使用MEGA7.0中的Clustal W算法对大型溞的miR-153序列与蚤状溞、斑马鱼等其他十种动物的miR-153进行多序列比对(图1)，发现各物种miR-153的大部分碱基序列相同，且大型溞和蚤状溞的miR-153序列完全一致，结果符合物种的系统发生关系。多序列比对结果表明miR-153在进化上高度保守。靶基因分析结果表明miR-153可靶向数百个不同的mRNA (图2和图3)，包括已经过双荧光素酶和免疫蛋白印迹实验验证的Jagged1、SRC、GALNT7、Snail、AKT等基因 [30] [31] [32]。GO注释发现miR-153的靶基因主要参与了DNA 模板和转录调控过程、氧化还原过程和信号转导等生物学过程。miR-153的靶基因主要富集在胞吞、血管平滑肌收缩、细胞色素P450对异生素的代谢等KEGG pathway信号通路。以上结果提示miR-153对生物生命活动的调控是一个miR-153-靶基因调控网络参与的复杂的过程。

miR-153通过调控靶基因来发挥相关生物学作用，找到miR-153的靶基因是研究其功能的关键。为了检测miR-153是否通过对靶基因AKT的调控，参与大型溞对DBP胁迫的分子响应，我们将大型溞暴露于1.0 mg/L和2.0 mg/L的DBP溶液24小时和48小时后，利用qPCR技术观察DBP暴露下大型溞miR-153与AKT基因mRNA的表达变化趋势。实验发现不同浓度、不同时间的DBP暴露后，大型溞体内的miR-153的表达均显著高于对照组(图4(A))。蚤状溞在镉胁迫下体内miR-153表达水平明显改变，说明miR-153在蚤状溞应对镉胁迫的过程中发挥了一定的作用 [33]。PI3K-AKT基因信号通路是与水生动物细胞应激反应相关的重要细胞内信号转导途径 [34]。最近报道巨型对虾(Macrobrachium rosenbergii)经过急性氨氮暴露处理，对虾PI3K、AKT和FoxO基因的mRNA在不同组织和不同胁迫时间均出现明显的差异表达 [35]。AKT是PI3K-Akt信号通路上的核心位置，它的功能主要有调控细胞周期、凋亡、血管生成以及细胞侵袭等方面 [36]。在锌暴露下，鲤鱼前肠和中肠AKT的磷酸化水平显著下调，表明锌胁迫使AKT的活性受到抑制，可能导致鲤鱼肠道细胞凋亡水平增加 [34]。大型溞AKT mRNA在1 mg/L和2 mg/L DBP暴露下的相对表达量明显下调(图4(B))，推测DBP可能会干扰PI3K-AKT信号通路相关的细胞生命活动。而大型溞在DBP暴露下miR-153表达量升高，AKT的mRNA表达量下降，证实了大型溞miR-153与AKT基因mRNA的负调控关系。

综上，本文对物种间miR-153序列的保守性及其靶基因功能进行分析，发现miR-153序列在进化上高度保守，推测大型溞miR-153可通过靶基因参与细胞内的一些重要生物学过程，如DNA模板和转录调控、氧化还原过程和信号转导等；DBP暴露引起大型溞miR-153的差异表达，负调控AKT基因mRNA的表达水平，可能使AKT介导的大型溞生命活动出现异常，最终导致毒性效应。本研究为进一步解析DBP暴露对水生动物的分子毒性效应提供了理论依据。

基因项目

本论文由国家自然科学基金(42077226)和辽宁省自然科学基金(20180550774)资助。

文章引用

张 晶,魏呈卉,魏 杰,张 泽,张园雯,王 汨. 邻苯二甲酸二丁酯暴露对大型溞miR-153及AKT基因表达的影响和功能分析
Expression and Function Analysis of miR-153 and AKTgene in Daphnia magna Exposed to Dibutyl Phthalate[J]. 海洋科学前沿, 2022, 09(02): 140-149. https://doi.org/10.12677/AMS.2022.92019

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    37. NOTES

    *通讯作者。

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