 Material Sciences 材料科学, 2012, 2, 133-138 http://dx.doi.org/10.12677/ms.2012.23024 Published Online July 2012 (http://www.hanspub.org/journal/ms) Preparation of Antimicrobial Silk Hydrogels for Surgical Dressings* Xil on g Wu 1, Y iyun Shen2, Shan Sun1, Xiu Zhang1, Shenzhou Lu1# 1National Engineering Laboratory for Modern Silk, College of Textile and Clothing Engineering, Soochow University, Suzhou 2College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University, Suzhou Email: #lushenzhou@suda.edu.cn Received: Jun. 25th, 2012; revised: Jul. 5th, 2012; accepted: Jul. 12th, 2012 Abstract: Using quaternary ammonium salts (QAS) as initiating agents, silk fibroin aqueous solutions were induced to gel rapidly. The structure, zeta-potential change and thermal stability properties of QAS-induced silk gel were charac- terized by means of X-ray diffraction (XRD), infrared spectroscopy (IR), scanning electron microscopy (SEM), zeta- potential measurements and differential thermal analysis (DTA). The results show that QAS-induced silk gelation is accompanied by the formation of β-sheets and less negative zeta-potential values. With the observation of SEM, the internal morphology of gel exhibited a porous three-dimensional network structure. In vitro degradation and DTA analysis revealed that QAS-induced fibroin gel was not quite stable and disintegrated more easily in the enzyme solu- tion. Also, QAS is amorphous or metastable crystal state in silk gel and thus easy to release and diffuse. The antibacte- rial test in vitro suggested that silk-QAS gel showed distinctly antibacterial activities against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. In situ antimicrobial silk hydrogel is expected to be used for a surgical dressing. Keywords: Silk Fibroin; Hydrogel; Quaternary Ammonium Salt; Antibacterial Materials; In-Situ Gelation 抗菌丝素蛋白水凝胶敷料 的制备* 吴锡龙 1，沈旖云 2，孙 姗1，张 秀1，卢神州 1# 1苏州大学纺织与服装工程学院，现代丝绸国家工程实验室，苏州 2苏州大学医学部药学院，苏州 Email: #lushenzhou@suda.edu.cn 收稿日期：2012 年6月25 日；修回日期：2012年7月5日；录用日期：2012 年7月12 日 摘 要：季铵盐类抗菌剂作为凝胶促进剂，诱导丝素蛋白水溶液快速原位凝胶化从而制备抗菌性丝素水凝胶敷 料。利用 X射线衍射、红外光谱、扫描电镜、zeta 电位分析、差热分析等手段对所制丝素水凝胶的结构、zeta 电位、热稳定、降解性及其抗菌性能进行了表征。研究结果表明，季铵盐会引起丝素颗粒负电位值下降，由此 促发形成的丝素水凝胶为 β-折叠片层结构，凝胶内部形貌为多孔的三维网状结构，且对革兰氏阳性菌和阴性菌 都有很明显的抗菌效果。同时由体外降解、差热分析结果可知，季铵盐引发丝素蛋白溶液快速形成水凝胶，蛋 白酶可以在体外降解水凝胶。季铵盐在水凝胶中主要以无定形或亚稳态晶体状态存在，容易扩散释放，达到较 好的抗菌效果。抗菌性原位丝素蛋白水凝胶预计可以用于外科伤口敷料。 关键词：丝素蛋白；水凝胶；季铵盐；抗菌材料；原位凝胶化 *资助信息：江苏省高校自然科学科学基金项目(10KJB540002)；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目。 #通讯作者。 Copyright © 2012 Hanspub 133  抗菌丝素蛋白水凝胶敷料的制备 Copyright © 2012 Hanspub 134 1. 引言 水凝胶是一种三维的交联网孔结构并具有超过 90%的水含量[1]， 因其良好的生物相 容性在临床医 学 领域具有广泛的应用，可作为隐形眼镜，生物传感器 薄膜，人工皮肤，药物释放载体等[1,2]。其中，作为外 科伤口敷料，水凝胶因其自身结构特性而具有独特的 优势：能允许气体交换、吸收伤口多余渗液并保持创 面的湿润、止痛和减少炎症、更换方便、能控制药物 缓慢释放以使伤口局部达到适宜的药物浓度等[3-5]。而 蚕丝是一种具有优良生物相容性的天然高分子材料， 作为外科手术缝合线已经使用了近百年，对机体无过 敏或免疫反应[6]。然而，水凝胶类敷料对于细菌的隔 离作用不强，会选择性允许革兰氏阴性菌生长[7]。对 于皮肤表层伤口、烧伤、软组织挫伤的创面等外科伤 口而言，细菌在伤口处的生长繁殖会加重伤口感染、 疼痛，从而阻碍伤口的痊愈。因此开发具有一定抗菌 效果的水凝胶材料可以弥补这个缺点，对于拓宽丝素 水凝胶的临床应用也具有极为重要的意义。季铵盐类 抗菌剂是一类研究较多的阳离子活性杀菌剂，广泛应 用于外科手术和医疗器械的消毒，如新洁尔灭等，其 主要是通过吸附于细菌表面，穿透细胞壁并对其有裂 解作用，导致菌体团聚和分裂从而达到较好的杀菌效 果[8,9]。本文采用丝素蛋白作为水凝胶基质材料，以季 铵盐类抗菌剂作为凝胶促进剂，促使丝素蛋白溶液快 速原位凝胶化，同时改善丝素凝胶的抗菌性能，利用 扫描电镜、X射线衍射、红外光谱、zeta 电位测试和 差热分析(DTA)等手段对凝胶结构、热学性能及其体 外降解性能进行了研究。 2. 材料与方法 2.1. 材料制备 将家蚕生丝在 0.02 M Na2CO3中煮沸 30 min并用 去离子水漂洗以除去丝胶蛋白.然后将脱胶丝溶解于 9.3 M LiBr 水溶液中，并将其置于截留分子量为 8~10 kD 的透析袋中透析三天，经离心过滤得到4.0 wt%浓 度的丝素溶液。 将三种常见的季铵盐类(QAS)抗菌剂十二烷基二 甲基乙基溴化铵(EDDAB)、洁尔灭(BC)、杜灭芬(DB) 配制成 10 wt%的水溶液，再分别以10/90、5/95、1/99 的比例与丝素溶液充分混合均匀，室温下迅速形成一 系列具有不同季铵盐浓度的丝素凝胶。用打孔模具将 其制成一定尺寸的样品，用作体外降解和抗菌测试， 并分别以纯丝素凝胶作为对照。 2.2. 凝胶结构表征 将按上述方法制备的其中三种季铵盐/丝素(5/95) 凝胶样品、纯丝素凝胶和丝素溶液分别冷冻干燥，并 研磨成微小的粉末颗粒，用80 目筛子筛选出的微粒 用于 X射线衍射(XRD)测试，采用铜靶，超能探测计 数器记录2θ = 5˚ - 45˚之间的衍射强度曲线。红外吸收 光谱(FTIR)测定采用KBr 压片法，测试 400~4000 cm–1 的吸光度。 将丝素水凝胶放入液氮中，速冻固定，真空干燥， 扫描电镜观察凝胶的截面形貌。 2.3. Zeta电位变化 将新鲜丝素溶液分别以100/0、95/5、90 /10、85/15、 80/20的比例与 10%的EDDAB 水溶液共混，并在液 体快速混合器上快速涡旋混合充分，立即吸取 1 ml 置于样品池中，在常温下测其zeta 电位值。每个样品 各进行五次测试，去除两个较大偏差值，取中间值的 平均值为最终的测试结果。 2.4. 体外模拟降解 用模具制备尺寸为 5 ± 2 mm(直径) × 5 mm(高)的 丝素/EDDAB(95/5)凝胶块并将其分别浸入含 5 U/ml 蛋白酶ⅩⅣ的PBS溶液(浴比为1/10)、PBS和纯水中， 以纯丝素凝胶作为对照样品。所有试样放置于 37℃的 恒温培养箱中降解，每24 h 换液一次。在特定时间点 6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h 时，分别取 出相应样品、擦干、称重、计算降解重量剩余率。每 个样品测定 3个平行样，取平均值。 2.5. 差热分析 利用差热分析法(DTA)研究 EDDAB 分布在丝素 凝胶中的晶体状态。分别取纯 EDDAB、丝素/ED- DAB(95/5)凝胶冻干样品、纯丝素冻干凝胶和EDDAB 的物理混合物(EDDAB 成分重量占 5%)各约 5 mg，在 35℃~400℃范围内，以 10℃/min 的升温速率加热，在 氮气流下进行DTA 分析。  抗菌丝素蛋白水凝胶敷料的制备 2.6. 抗菌性能测试 测试方法参照抗菌性能评价标准(GB/T 20944.1- 2007)，采用琼脂平皿扩散法并加以改进。将培养好的 两种试验菌液(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)以2 × 108 CFU/ml的菌浓度用涂布方式接种到琼脂培养基上， 然后将尺寸为10 ± 2 mm(直径) × 5 mm(高)的凝胶小 块分别均匀地按压在琼脂培养基上，立即放入 37℃的 恒温培养箱中培养 24 h，测定抑菌带宽度并用显微镜 观察试样下面与琼脂接触区域的细菌繁殖情况。为便 于观察比较，对于相同种类并含不同浓度季铵盐的丝 素凝胶试样及其对照样置于同一个培养皿中，并相间 90˚左右放置。 3. 结果与讨论 3.1. 季铵盐引发丝素结构变化 由三种季铵盐引发的丝素结构变化如图 1所示。 新鲜的丝素溶液(a曲线)为一宽峰，代表丝素为无定形 结构，而其他所有丝素凝胶样品在衍射角20.5˚处都呈 现出显著的衍射峰，在9.1˚和24.2˚附近也出现较弱的 峰且丝素–EDDAB 凝胶的这两个峰更加明显，强度 相对较强，这些特征衍射峰表明三种季铵盐–丝素凝 胶中丝素均为Silk II(β-折叠)结晶结构[10]。根据丝素凝 胶样品的红外光谱(图1(B))可以看出，对样品a(丝素 溶液)，1656 cm–1，1539 cm–1，1241 cm–1 分别是酰胺 I，酰胺 II 和酰胺 III 谱带的红外吸收峰，代表丝素为 无规卷曲结构。而对于其它凝胶样品，特征吸收峰出 现在 1628 cm–1，1525 cm–1，1233 cm–1 附近，显示出 丝素蛋白典型的β-折叠结构[11]。由此可见，季铵盐引 发丝素溶液的凝胶化过程，伴随着丝素蛋白构象由无 规线团向β-折叠结构的转变。 用扫描电镜观察丝素–EDDAB 凝胶截面形貌情 况，如图 2所示，凝胶内部为紧密相连的多孔结构(孔 径 ≤ 5 µm)，并且孔间相互贯通形成空间网状结构。 5 1015202530354045 A 20.5 c b a e 2 Diffrac ti on in te n sit y (cp s) d 1800 1600 1400 1200 100080 0 e T rans m itt ance (%) a b c d B Wav enumber ( cm -1 ) 1628 1525 1656 1539 1233 1241 Figure 1. WAXD curves (A) and FTIR data (B) collected from (a) Silk solution; (b) Pure silk gel and QAS-induced silk gels; (c) Silk-DB gel; (d) Silk-BC gel; (e) Silk-EDDAB gel. All the concentrations of QAS in silk gels are 5 wt%, the concentration of fibroin was 4 wt% 图1. 丝素/季铵盐水凝胶的结构，X-射线衍射曲线(A)和红外光谱图(B)：(a) 纯丝素溶液；(b) 纯丝素凝胶；(c) 丝素–杜灭芬凝胶；(d) 丝 素–洁尔灭凝胶和；(e) 丝素–EDDAB 凝胶(季铵盐占总质量的 5%，丝素蛋白浓度为 4 wt%) Figure 2. SEM images for freeze-dried silk h yd rogels prepared with 5% EDDAB 图2. 丝素/EDDAB(95/5)冻干凝胶的截面形貌 Copyright © 2012 Hanspub 135  抗菌丝素蛋白水凝胶敷料的制备 3.2. Zeta电位的变化 利用 zeta 电位分析仪测得丝素溶液 zeta电位值随 EDDAB 加入浓度的变化情况如图3所示，纯丝素溶 液zeta 电位为(–4.32 ± 0.08) mV (n = 3)，随着EDDA B 浓度的提高，季铵盐会抵消丝素蛋白颗粒所带的净负 电荷，混合溶液体系中zeta 电位会变大(趋向于零)， 表明整个丝素溶液体系向零电位趋近，导致丝素蛋白 大分子间易发生凝聚，也为纤维状丝素蛋白分子链间 的缔合创造条件，这可能与丝素溶液的快速凝胶化有 一定关系。 3.3. 凝胶的体外降解 季铵盐(EDDAB)引发的丝素凝胶样品在水、 PBS(pH = 7.4)、蛋白酶ⅩⅣ液中降解 3天(如图4(A))， 酶液中前12 h降解较快，12 h 时降解剩余至 60%，而 后降解速率明显减缓，36 h 时达 50%左右，最终 72 h 内降解剩余 38.6%；而 在PBS 和纯水中也有一定程度 的降解，PBS 中前 36 h 内降解较缓，此后降解速度加 快，在72 h内降解剩余率为60.3 %，在纯水中最终降 。而纯丝素凝胶降解 7天(如图 4(B))， 在PBS 和纯水中都未有显著的降解，而在酶液中剩余 率还有 83%左右。可见，由季铵盐(EDDAB)快速诱发 形成的丝素凝胶与纯丝素凝胶相比，更容易被降解， 而且降解的速度也比较快。 3.4. 凝胶的热学性能 由差热分析(图5(a))可知，EDDAB 的熔化吸热峰 在194℃，分解峰在251℃左右。丝素凝胶与EDDAB 物理混合物的吸热峰叠加，丝素蛋白的分解峰出现在 290℃附近(图5(b))，同时 192℃、248℃附近出现 EDDAB 的熔化峰和分解峰，说明物理混合状态下 EDDAB 的物理状态并没有发生改变。而丝素–EDDAB 凝胶中没有出现 EDDAB的吸收峰(图5(c))，只有丝 素凝胶的吸热分解峰(296℃)，说 明EDDAB 在丝素凝 胶中其结晶状态发生了变化，可能以无定形或亚稳晶 体状态存在，与丝素蛋白分子间形成一定的相互作用 力；另外也可以看出丝素–EDDAB 凝胶热稳定性比 纯丝素凝胶高(分解峰 296℃ > 290℃)。 解剩余率为71% 100/095/590/10 85/15 80/20 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 Zeta potential (mv) SF/EDDAB Figure 3. Zeta potentials for 4 wt% SF s ol uti on s with different concentrations of EDDAB (n = 3) 图3. 不同浓度 EDDAB 对丝素溶液 zeta 电位的影响 Figure 4. Degradation of silk/EDDAB (95/5) gel (A) and pure silk gel (B) in vitro (incubated at 37˚C) 图4. 丝素–EDDAB 凝胶(95/5)(A)和纯丝素凝胶(B)的体外降解(37℃) Copyright © 2012 Hanspub 136  抗菌丝素蛋白水凝胶敷料的制备 Figure 5. DTA thermograms of ( a) Pure EDDAB; (b) Physical mixture of pure silk gel and EDDAB and (c) Silk-EDDAB gel 图5. 差热分析(DTA)：(a) 纯EDDAB；(b) 冻干丝素凝胶和 EDDAB 的物理混合物；(c) 丝素–EDDAB 凝胶 Figure 6. Inhibition zone assay on agarose plates with E. coli (up- per panels) and S. aur eus (down panels). The concentrations of quaternary ammonium salts in gels (A, D. Silk-EDDAB Gel; B, E. Silk-BC Gel; C, F. Silk-DB Gel) were 10%, 5% 1%, 0%, respec- tively, from the left on a clockwise direction 图6. 抑菌性能测试(上排：大肠杆菌；下排：金黄色葡萄球菌)。 凝胶中季铵盐浓度从左逆时针方向依次为 1 0%, 5% 1% , 0% (A、 D. EDDAB Table 1. Inhibition zone diameters of antimicrobial silk gels 表1. 抗菌丝素凝胶抑菌圈直径 E. coli (mm) S. aureus (mm) ；B、E. 洁尔灭；C、F. 杜灭芬) Gel 10% 5% 1% 0% 10% 5% 1%0% EDDAB 11 7.5 0 0 18.5 14.5 11.50 BC 8 5.5 0 0 16.5 12.5 4 0 DB 7.5 4.5 0 0 8.5 6 1.90 3.5. 凝胶的抗菌性能 从抑菌照片 言，纯丝素凝胶均未产生抑 在逐渐增加，说明在形 胶的过程中三 铵盐仍保持抑菌性能，且 散释放，使得抗菌效果愈加 显著 ，且与自然 成的纯丝素凝胶相比更容易降解。 2) 季铵盐在丝素凝胶中是以无定形或亚稳态晶 型存在，较容易地向外扩散释放，季铵盐–丝素凝胶 对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很明显的抗菌效果。 参考文献 (References) [1] L. Yu, J. Ding. Injectable hydrogels as unique biomedical mate- rials. Chemical Society Reviews, 2008, 37(8): 1473-1481. [2] N. A. Peppas, P. Bures, W. Leobandung, et al. Hydrogels in pharmaceutical formean Journal of Pharmaceu- -46. . PVA-clay nanocom- wound dressing. European Polymer Journal, 2007, 43(3): 773-781. [4] B. Balakrishnan, M. Mohanty, A. C. Fernandez, et al. Evaluation of the effect of incorporation of dibutyryl cyclic adenosine mo- nophosphate in an in situ—Forming hydrogel wound dressing based on oxidized alginate and gelatin. 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