¹中国林业科学研究院亚热带林业实验中心，江西 新余

²中国林业科学研究院林业研究所，北京

³中国林业科学研究院林木遗传和育种国家重点实验室，北京

⁴国家植物园，北京

⁵中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室，北京

收稿日期：2022年10月4日；录用日期：2022年11月4日；发布日期：2022年11月15日

摘要

鉴定植物是人类认识自然的重要内容之一。由于工作量巨大，经历了漫长而艰辛的研究历程。标本馆和植物园为植物鉴定研究提供了重要支撑。基于形态分类的植物志的出版是植物鉴定研究进展过程中的里程碑式的工作。新的研究阶段需要从全球视角开展植物鉴定研究。植物的种间、属间甚至科间存在或多或少的形态相似性，用于植物分类的有价值的形态性状数量少。形态特征和基于DNA短片段的标记提供的信息量有限，学界期待分辨率高的植物种鉴定技术。高通量测序技术使植物叶绿体全基因组序列的获得成为可能。我们首次利用叶绿体基因组的499个单核苷酸多态位点，研制北美鹅掌楸和鹅掌楸的分子鉴定检索表。分析结果显示，在鹅掌楸属内的物种形成过程中，叶绿体全基因组内有75个基因和64个基因间隔区发生了种级水平的遗传分化。本研究利用了叶绿体全基因组序列提供的丰富的单核苷酸多态位点信息，可为鹅掌楸属植物资源的深入研究、保护和利用提供技术基础。

关键词

鹅掌楸属，叶绿体基因组，单核苷酸多态位点，植物鉴定

Molecular Identification of Liriodendron chinense and L. tulipifera Based on Single-Nucleotide Polymorphic Sites from the Complete Chloroplast Genomes

Ru Liu¹, Wenting Pan¹, Bin Li^2,3*, Xiaobai Jin⁴, Ruili Li⁴, Zhili Suo^5*

¹Subtropical Experimental Center, Chinese Academy of Forestry, Xinyu Jiangxi

²Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing

³State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing

⁴China National Botanical Garden, Beijing

⁵State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing

Received: Oct. 4^th, 2022; accepted: Nov. 4^th, 2022; published: Nov. 15^th, 2022

ABSTRACT

Identification of plants is one of the important contents for human to understand nature. Due to the huge workload, it has gone through a long and arduous research process. Herbaria and botanical gardens provide important support for plant identification research. The publication of Flora based on morphological classification is a milestone in the advances of plant identification research. In the new stage, plant identification research should be carried out from a global perspective. There are more or less morphological similarities among species, genera and even families, the number of valuable morphological characters for plant classification is fewer. Morphological characteristics and DNA fragment-based markers could only provide limited information for plant identification. New technologies with high resolution are highly expected. High throughput sequencing technology makes it possible to obtain the whole chloroplast genome sequence of plants. For the first time, we compiled a molecular identification key to Liriodendron chinense and L. tulipifera using 499 single-nucleotide polymorphic sites from the chloroplast genomes. Our analysis indicated that, during speciation in the genus Liriodendron, genetic differentiation occurred in 75 gene regions and 64 intergenic regions in the chloroplast genomes at species level. This study that utilized the richer bio-information of single-nucleotide polymorphic sites from the complete chloroplast genomes would provide technical support for deeper study on plant resources in Liriodendron and their conservation and utilization.

Keywords:Liriodendron, Chloroplast Genome, Single-Nucleotide Polymorphic Site, Species Identification

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

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1. 引言

在人类认识自然的过程中，鉴定植物是重要内容之一。通过形态特征鉴定为每一种植物命名。形态鉴定是对具有重要鉴定意义的分类特征，特别是花器官、果实、叶等，进行观察、测量、比较和分析，根据形态特征的组合，结合前人的研究进展，对植物进行分类鉴定。

具体操作过程是，首先到野外采集鲜活植物的枝、叶、花和果实，对于高大的乔木，需要利用高枝剪取枝，草本植物需要连根拔起，采集全植株。夹在报纸或草纸的中间，用木板制成的标本夹压平、固定，利用吹风设备，暖风吹24小时，没有吹风设备条件时，需要每天更换报纸晾干。干燥后带回标本馆，平移到台纸上，利用乳胶粘贴固定，或利用细纸条或线缝合固定在台纸上，台纸的左上角贴一个纸条，记录采集地点、海拔高度、经纬度、采集人和采集日期 [1]。

装订好的植物标本，由专门的技术人员首先归类到科，存放在该科最靠后面的标本柜内。有项目推动的植物标本通常很快鉴定到种名。野外调查人员顺便采集和赠送标本馆的大量标本，通常会尽快完成装订，由于没有项目推动，一直保存在柜子里等待鉴定。利用空调尽量保持室内温度在22度左右，北京相对比较干燥，每周运行1~2次除湿设备。标本保存20~30年后才鉴定出种名的情况很常见，也有装订完70多年后才鉴定到种名的标本。原因是有些标本(特别是热带、亚热带植物的标本)没有能够鉴定的专家。研究专科专属植物的专家通常到各国的标本馆观察标本，也顺便协助鉴定。鉴定名称写在一个纸条上，通常粘贴在台纸的右下角。已经有鉴定名称的植物标本，其他专家发现鉴定错误时，会在旁边另外贴一个纸条，写上拟更新的鉴定名和鉴定日期，鉴定人签名。有些植物标本的鉴定种名被更新过5~6次，台纸上贴着每次的名称鉴定信息纸条。使用者在文献中通常引用最新的鉴定种名，但也鼓励持慎重的验证姿态。有的植物标本最初就被错误地放在了别的科属内，这样的情况偶有发现。一些大型标本馆保存着几百年前的标本。国家植物标本馆内也保存着由于未能采集到全套重要器官而无法鉴定到种名的标本。国际间标本馆际交换赠送的标本通常装订精致，鉴定到了种名。

经过80余家科研、教学单位的312位作者和164位绘图人员对80余年的工作积累(标本和文献)进行分析和整理，2004年中国植物志的编写全部完成，共出版80卷126册，记录了中国植物共301科3408属31,142种。中国植物志的内容主要来自标本馆的植物标本鉴定信息及野外和植物园的观察记录。数字中国植物志已经上线(http://www.iplant.cn)。Goodwin et al. (2015) [2] 调查评价了21个国家40个标本馆的4500份植物标本，发现50%以上的热带植物标本存在种名鉴定错误。根据全世界6大洲、250多个国家或地区的植物接受名统计，全球共有植物1045科16,164属，332,750种，其中包括苔藓植物、蕨类植物、裸子植物和被子植物 [3] [4]。由于工作量巨大，有些植物类群在植物志分册出版后又发表了很多研究新进展，未能及时写入。植物志中存在的错误和需要补充的内容，有待再版时更新。植物标本存在一定程度的褪色和干缩变型，不能完全等同于野外的活植物，鉴定植物名称需要一定的经验。

植物园引种栽培活植物便于近距离详细观察记录植物的形态特征、习性和生活史，对于植物鉴定非常重要。例如，北京的国家植物园采集到野外活植物或种子，先在原始材料圃栽植或播种。进入原始材料圃的植物必须详细登记，包括每个种苗的植物名称、来源、数量、采种母树原产地生态环境及生长发育状况等信息，以便于制定栽培措施和推广应用。每个种苗有一个总的登记号码(或称为引种编号)，用引种编号也可以查询到利用每个种苗培育岀的苗木 [5]。引种编号的重要作用在于即使后来出现该植物的鉴定名称或分类位置发生了变化，也可以追溯到它的来源和最初观察记录信息。这些苗木成活后，根据科研和科普价值，结合园林景观设计的配植方法，移栽到植物园展览区，供长期观察、研究、科普宣传和展示。绘制定植位置图是基础工作，定植位置图上的每株植物都关联一个信息库。早年采用手绘图纸、记录表格或卡片，现在使用AutoCAD或ArcGIS软件绘制图纸，配有相关信息数据库，包括苗木定植记录、引种记录、繁殖记录等子库。国外还开发了BG-Base和BG-Map等专门用于植物园信息管理的计算机软件系统。展览区的植物定期清查、核准并评估植物生长状况，对位置图和相关数据库信息进行更新。植物园展览区栽植的每株乔灌木和每种草本植物都有一个牌子，注明了植物的拉丁学名、中文名、编号、科、属、分布等信息，也可以扫描二维码查询更多信息 [5] [6]。不足之处是原始材料圃和定植区的面积(约0.54平方千米)小，操作空间十分有限。1956年北京的国家植物园建园以来，能够引种的各气候区的植物绝大部分进行了栽培试验，开发了各种相关技术。北京的国家植物园是本地区物种多样性最高的技术和应用推广中心。在汲取经验教训的基础上，2001年批准建设的秦岭国家植物园采取了围山建园和就地保护相结合的策略，规划总面积639平方千米，是目前世界上占地面积最大的植物园。植物鉴定研究过程中，支撑性工作在时间和工作量方面占据很大比例。长期以来，标本馆、植物园、国家基因库、大型苗圃等植物收集、保存、繁育基地，为植物鉴定研究事业提供了重要支撑。

由于植物的种间、属间甚至科间存在或多或少的形态相似性，用于植物分类的有价值的形态性状数量有限。例如，鹅掌楸(木兰科鹅掌楸属的乔木树种)的花朵形似杯状，与郁金香(百合科郁金香属的多年生草本植物)的花很相似，欧洲人称之为“郁金香树”(tulip tree)。学界期待分辨率高的技术方法配合形态特征的鉴定方法来鉴定植物种。

植物鉴定技术研发方面，经历了基于形态特征的分类、基于同工酶特征条带的分类、基于DNA片段长度和片段数目差异(如RAPD、AFLP及RFLP)的分类，基于DNA片段的核苷酸序列差异[rbcL、matK、trnH-psbA、internal transcribed spacer (ITS)序列以及泛素–蛋白酶体系统相关DNA序列]的分类 [7] [8]，也报道了利用浅层测序技术开发细胞核DNA SSR标记的研究 [9]。但是，这些技术都是出于降低实验成本的角度考虑遗传差异检测。它们的不足是信息量少、有些DNA标记不能定位到基因组内的具体位置上，应用价值有限 [7] [8]。

高通量测序技术可以获得植物完整的叶绿体基因组全长序列，打破了形态特征和DNA片段标记信息量少的瓶颈，实验成本也降低到了一般项目组可以负担的水平。叶绿体全基因组序列已经广泛用于植物的系统发生关系分析和生物地理研究 [10] - [18]。Li et al. (2016)报道了鹅掌楸(Liriodendron chinense)的叶绿体基因组的全长序列 [19]。本研究以鹅掌楸属植物为例，基于叶绿体全基因组序列数据，研制鹅掌楸属物种的分子鉴定检索表方法。我们的研究方法和原理在芍药属(Paeonia L.) [20]、胡桃属(Juglans L.) [21]、紫薇属(Lagerstroemia L.) [8]、柿属(Diospyros L.) [22] 以及马尾藻属(Sargassum C. Agardh) [23] 方面已有发表，但在鹅掌楸属方面为首次报道。

表1. 本研究使用的叶绿体基因组序列数据

鹅掌楸属植物隶属于木兰分支(Magnoliids)的木兰科(Magnoliaceae)，是核心被子植物(Mesangiospermae)的早期趋异的谱系 [4]。鹅掌楸属(Liriodendron L.)是珍贵的第三纪孑遗谱系，全世界有2个现存的乔木种，一个是原产于东亚地区(中国的东南部地区和越南的北部地区)的鹅掌楸(L. chinense Sarg.)，另一个是原产于北美洲东部的北美鹅掌楸(L. tulipifera L.) [24] [25] [26] [27] [28]。两大陆间断分布的特征，使其具有重要的系统发生和生物地理研究价值。鹅掌楸是速生的乔木，木材纤维长度可达1.7 mm，是优良的造纸材料，叶形独特，树形优美，花朵为艳丽的杯型，观赏价值高，17世纪就已被引种到欧洲，是历史悠久的重要园林绿化树种，目前在许多地区广泛引种。鹅掌楸具有药用价值，也是中国的珍稀濒危保护植物 [29]。鹅掌楸属这两个种作为亲本材料，其杂交后代在园林绿化和观赏方面表现优异 [24] [28]。为了深入研究和评估鹅掌楸属植物的种质资源状况、分析杂交过程的遗传变异机制，野生资源的种级鉴定是基础。由于形态特征和DNA片段提供的信息量少，为了提供更加便捷、精准的物种鉴定方法，我们利用叶绿体基因组序列的单核苷酸多态位点，首次研制鹅掌楸属物种的分子鉴定检索表，为资源的保护与利用提供技术支持。

2. 材料与方法

利用5个和4个个体分别代表鹅掌楸(Liriodendron chinense)和北美鹅掌楸(L. tulipifera)。利用MAFFT v7.055b软件 [30] (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software)对9条叶绿体全基因组序列(见表1)进行比对。利用Suo et al. (2012, 2015, 2016) [20] [21] [22] 和索志立等(2022) [23] 报道的方法，确定单核苷酸多态位点的位置。比对后的序列矩阵的长度为160,427个核苷酸，5’-端(左端)起的第1个核苷酸字母的位置编号为1，最后一个核苷酸字母(即最右端的核苷酸字母)的位置编号为160,427。利用Mega 7.0软件 [31] 从左到右顺次检测和记录单核苷酸多态位点(见图1)。种间有差异、种内个体间没有差异的单核苷酸多态位点作为分子分类性状，用于编写鹅掌楸属物种的分子鉴定检索表。利用Mega 7.0软件 [31] 生成鹅掌楸属2个种9个个体之间的遗传关系(见图2)。

3. 结果

基于叶绿体全基因组序列数据，共获得揭示种级水平遗传差异的单核苷酸多态位点499个，利用这些位点构建鹅掌楸和北美鹅掌楸的分子鉴定检索表(见图1)。9个样品按照鹅掌楸(Liriodendron chinense)和北美鹅掌楸(L. tulipifera)聚类为2组(见图2)，与基于形态特征的分类结果一致。单核苷酸多态位点数据显示，在鹅掌楸属的物种形成过程中，叶绿体全基因组序列内部，有75个基因和64个基因间隔区发生了种级水平的遗传分化(见表2)。ycf1区的遗传分化最大，有48个单核苷酸多态位点。体现种级水平遗传差异的单核苷酸多态位点，可用于物种水平上鉴定鹅掌楸属植物资源。

表2. 鹅掌楸和北美鹅掌楸的叶绿体基因组内与物种遗传分化有关的基因和基因间隔区及单核苷酸多态位点数目

^*：indicates the intergenic regions；^*：基因间隔区。

4. 讨论

鹅掌楸属隶属于木兰科的鹅掌楸亚科(Liriodendroideae)，直到晚第三纪(Late Tertiary) (距今2330万年~距今164万年)，鹅掌楸属的几个种仍然分布于整个北半球 [2]。第三纪(距今6500万年~距今260万年)的这2个孑遗种，出现于中新世(2300万年前到533万年前)的中后期(Middle to Late Miocene)，在晚新生代(Late Cenozoic) (注：新生代开始于6700万年前，延续至今)，其分布范围缩小 [2]。现存的这2个种典型地间断分布于两个大陆。

叶绿体基因组是光合作用的重要细胞器–叶绿体的遗传密码，大量基因和基因间隔区的核苷酸序列发生了遗传分化，表明地球的光环境相关因子在鹅掌楸属的物种形成过程中产生了巨大影响。这方面是未来深入研究的重要方向之一。本研究提供了一种更加精准、便捷的物种鉴定方法，对于鹅掌楸属植物资源的全球清查、保护和利用具有重要意义。本方法也适用于具有叶绿体基因组的藻类鉴定 [23]，在分类学上，藻类已经从植物界独立出来。藻类广泛分布于海洋和湖泊，至少有10万种以上，具有重要的环境保护价值和经济价值。但是，由于调查、采集艰难，分类学研究严重滞后。经过长期努力，虽然采集保存了大量藻类等的生物标本，但是在液体里保存的标本基本上难以提取到DNA，目前为止已经收集到的海洋藻类等生物标本的利用价值有限，兼顾DNA保存的海洋藻类等生物标本野外采集和保存方法的研发是未来的研究重点之一。同时，海洋藻类等生物较为广泛地存在寄生、共生、甚至内生等现象，需要通过人工养殖、培养和镜检观察等多种方法研究获得纯物种DNA的技术。由于水生的藻类可以浮游移动，且同一物种内个体间形态变异幅度大，应该建立鉴定用关键形态特征的特写照片与DNA数据配套的技术资料。物种鉴定研究主要包含本文中提到的这几个重要环节(采集、保存、观察记录、分析数据和鉴定)，应该增加人员数量和科研经费，加快研究的进程。

图1. 基于叶绿体基因组内的499个单核苷酸多态位点的鹅掌楸和北美鹅掌楸的分子鉴定检索表。核苷酸字母后面的数字为单核苷酸多态位点从5’末端起位于叶绿体基因组内的位置

图2. 采用Juckes-Cantor参数模型利用邻接法生成的基于叶绿体全基因组序列数据的鹅掌楸属2个种9个个体的遗传关系树状图。分支附近的数值是1000次重复获得的自展支持率

5. 结论

本研究获得的分子分类特征来自叶绿体基因组的全长序列，信息量大。高通量测序技术打破了形态特征和DNA短片段信息量少以及设计引物的局限。单核苷酸多态位点是纳米级的分子分类性状，物种鉴定灵敏度高。本方法可以利用植物体的局部微小绿色组织作为分析样品，实现物种鉴定，克服了形态分类依赖全套植物重要器官(叶、花器官和果实)的问题。

致 谢

在调查标本馆系统、植物园系统、种质资源圃、国家基因库及讨论物种标本鉴定和数据分析等方面，得到如下老师的热情支持、帮助和指导，他们是杨志荣、王忠涛、傅连中、马欣堂、李文清、解孝满、鲁仪增、孙忠民、李宇航、张素萍、王少青、陈志云、张兵兰、张会金、徐秀萍、王风花，深表感谢。

基金项目

亚热带林木国家林木种质资源库中央财政林业改革发展资金林木良种繁育补助项目(2021, 2022)，国家自然科学基金项目(No. 31770744)。

文章引用

刘 儒,潘文婷,李 斌,靳晓白,李锐丽,索志立. 利用叶绿体全基因组的单核苷酸多态位点对鹅掌楸和北美鹅掌楸的分子鉴定
Molecular Identification of Liriodendron chinense and L. tulipifera Based on Single-Nucleotide Polymorphic Sites from the Complete Chloroplast Genomes[J]. 农业科学, 2022, 12(11): 1098-1108. https://doi.org/10.12677/HJAS.2022.1211151

参考文献