Hans Journal of Agricultural Sciences
Vol.
13
No.
10
(
2023
), Article ID:
73705
,
16
pages
10.12677/HJAS.2023.1310128
夜蛾颗粒体病毒宿主筛选及其增殖因子 主次研究
高小文1，赵艳2*，王浩挺2，陆骏1，曹雅虹1，陆畅2
1镇江市润宇生物科技开发有限公司，江苏 镇江
2镇江应用生物科技开发研究所，江苏 镇江
收稿日期：2023年9月10日；录用日期：2023年10月9日；发布日期：2023年10月16日
摘要
夜蛾颗粒体病毒(GXW9-3 Mamestra oleracea granulosis virus)简称MOGV GXW9-3。该病毒2013年首次由高小文在江苏镇江发现，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V201340，样品呈黑色粉末状，保存于4℃冰箱。MOGV GXW9-3是寄生在鳞翅目夜蛾科昆虫真皮、脂肪组织及血细胞中的一种最重要的杆状病原病毒，以蛋白质包涵体的形式存在，蛋白质包含着一个病毒颗粒，核酸为双链DNA。本文研究影响MOGV GXW9-3增殖宿主及增殖因子的主次，筛选该病毒增殖最佳宿主及其增殖因子主次。研究结果表明，影响MOGV GXW9-3产量的因子及互作因子主次顺序为：宿主细胞 > 饲毒虫日龄与收毒时间互作 > 饲毒虫日龄与收毒时间互作 > 收毒时间 > 温度。明确饲毒宿主，饲毒虫日龄因子对病毒产量有极显著影响，饲毒虫日龄和饲毒虫日龄与收毒时间存在互作且对产量有显著影响。确定MOGV GXW9-3增殖宿主为斜纹夜蛾细胞，最佳生产条件为26~28℃、分别按药剂浓度为：6 × 106 GV/mL、4 × 106 GV/mL、3 × 106 GV/mL、2.4 × 106 GV/mL、2 × 106 GV/mL的剂量饲毒斜纹夜蛾6龄幼虫，14~16 d后提取病毒，斜纹夜蛾6龄幼虫平均单虫个体重约1.046 g，冷冻干燥后每头虫体重量约为：0.085~0.108 g，平均单虫病毒产量约为0.069~0.28亿GV/g，幼虫孵化到收集幼虫提取病毒的生产周期为24 d，病毒增殖倍数为：31.25~43.75倍。
关键词
夜蛾科，夜蛾颗粒体病毒，病毒宿主，斜纹夜蛾，增殖因子条件
Host Screening and Proliferation Factors of MOGV GXW9-3 Primary and Secondary Research
Xiaowen Gao1, Yan Zhao2*, Haoting Wang2, Jun Lu1, Yahong Cao1, Chang Lu2
1Zhenjiang Runyu Biotechnology Development Co., LTD., Zhenjiang Jiangsu
2Zhenjiang Applied Biotechnology Development Institute, Zhenjiang Jiangsu
Received: Sep. 10th, 2023; accepted: Oct. 9th, 2023; published: Oct. 16th, 2023
ABSTRACT
GXW9-3 Mamestra oleracea granulosis virus is abbreviated as MOGV GXW9-3. The virus was first discovered by Xiaowen Gao in Zhenjiang, Jiangsu Province in 2013 and was stored in the Chinese Typical Culture Preservation Center with the storage number CCTCCNO: V201340. The samples were in black powder form and stored in a refrigerator at 4°C. MOGV GXW9-3 is one of the most important rod pathogenic viruses in the dermis, adipose tissue and blood cells of lepidoptera. It exists in the form of protein inclusion body. The protein contains a virus particle and the nucleic acid is double-stranded DNA. In this paper, complex factors were used to study the primary and secondary order of MOGV GXW9-3 proliferation hosts and factors, and to screen the best host of the virus proliferation and its proliferation influence factors. The results showed that the main order of factors and interaction factors affecting the yield of MOGV GXW9-3 was as follows: host cell > interaction between day age of feeding insects and time of toxification > interaction between day age of feeding insects and time of toxification > time of toxification > temperature. Clearly defining the host of the virus, the virus yield was significantly influenced by the age factors of the feed worms. The age of the feed worms and the age of the feed worms interacted with the time of receiving the poison and had a significant effect on the yield. The proliferation host of MOGV GXW9-3 was determined to be moth cells, and the optimal production conditions were 26~28˚C, according to the drug concentration: The 6th instar larvae were fed with 6 × 106 GV/mL, 4 × 106 GV/mL, 3 × 106 GV/mL, 2.4 × 106 GV/mL, 2 × 106 GV/mL, and the virus was extracted 14~16 days later. The average body weight of the 6th instar larvae was about 1.046 g. After freeze-drying, the weight of each insect was about 0.085~0.108 g, the average virus production was about 0.069~0.28 million GV/g, the production cycle from larvae hatching to larvae collection and virus extraction was 24 d, and the multiplication of virus was 31.25~43.75 times.
Keywords:Nocidae, MOGV GXW9-3, Virus Host, Spodoptera litura Fabricius, Proliferation Factor Conditions
Copyright © 2023 by author(s) and Hans Publishers Inc.
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1. 引言
鳞翅目夜蛾科昆虫是一种种群庞大的重要食根、茎、叶、花、果、穗的暴食性强，寄主范围较广，严重为害十字花科蔬菜、禾谷类、棉花、烟草、林草等作物的害虫，对生产造成严重威胁。夜蛾颗粒体病毒GXW9-3 Mamestra oleracea granulosis virus (简称MOGV GXW9-3)是寄生在鳞翅目幼虫真皮、脂肪组织及血细胞中的一种杆状病毒，以蛋白质包涵体的形式存在，蛋白质包含着一个病毒颗粒，核酸为双链DNA。经第三方检测机构检测，测序结果总Reads数为31,337,564，总碱基读长为4,700,634,600 bp，平均Read读长为147.76 Ibp，平均GC含量56.4。该病毒对人畜安全，且杀虫谱较广，不但对夜蛾活性很高，且对斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius、烟青虫Heliothis assulta Guenée、银纹夜蛾Ctenoplusia agnata、小菜蛾Plutella xylostella (Linnaeus)、甜菜夜蛾Spodptera exigua (Hübner)、棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)、大地老虎Agrotis tokionis Butler、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis、二化螟Chilosuppressalis (Walker)等重要农业害虫幼虫均具有较高的杀虫活性，是一种非常有开发潜力的重要昆虫病原微生物。该病毒2013年首次由高小文在江苏镇江发现，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCCNO: V201340)，为国内外首次发现高致病性MOGV GXW9-3毒株。2019年初次对该病毒田间药效试验初报，其对斜纹夜蛾实际防治效果达到80%以上。并对多种鳞翅目夜蛾科害虫也获得良好的效果 。因此，用MOGV GXW9-3田间防治夜蛾等重要农业害虫有广阔的应用前景 [1] 。目前MOGV GXW9-3生产仍以活体增殖方式生产。因此，研究MOGV GXW9-3筛选增殖宿主及其增殖影响因子，对工业化大量生产该病毒和利用该病毒防治鳞翅目夜蛾类等农林牧害虫，保障农、林、牧、草业类作物无公害绿色生产具有重要现实意义。以便为MOGV GXW9-3商品化大量生产提供试验依据和技术支撑。
2. 夜颗粒体病毒宿主筛选
2.1. 试验材料
2.1.1. 宿主的选择
供试虫体：斜纹夜蛾、蚕幼虫(来自中国农科院蚕业研究所养虫室)；银纹夜蛾、小菜蛾(来源镇江市润宇生物科技开发有限公司饲养虫室)；
供试病毒：斜纹夜蛾颗粒体病毒MOGV GXW9-3 (镇江市润宇生物科技开发有限公司菌种室保存的2013年8月分离株)。
2.1.2. 人工饲料
1) 斜纹夜蛾、银纹夜蛾幼虫，人工饲料配方：小麦胚芽600克，大豆粉200克，加1200 ml水混匀后高温灭菌(30分钟)，灭菌快结束。时，进行第二步。琼脂40克，加水1100 ml，置于微波炉中高温微波20分钟。灭菌时可称药品，将所有药品放于一个烧杯中，用灭菌水溶解，用水量为100 ml。小麦胚芽和豆粉灭菌完成后，将琼脂加入其中搅拌，直到不烫手为止，此时加入药品搅拌均匀，然后倒入盒中冷却定型后即可使用。药品包括：酵母粉：30 g；抗坏血酸：16 g；尼泊金甲酯：10 g；山梨酸：5 g；肌醇：1 g；复合维生素B：2片。为防止变质，可加入少量甲醛和头孢。
2) 小菜蛾人工饲料配方：小麦胚芽100 g、甘蓝粉100 g、加300 mL水混匀后高温灭菌。灭菌快结束时，琼脂12 g，加水200 mL，加热溶解。灭菌时可称药品，将所有药品放于一个烧杯中，用灭菌水溶解，用水量为50 mL。小麦胚芽和甘蓝粉灭菌完成后，将琼脂加入其中搅拌，直到不烫手为止，此时加入药品。搅拌均匀，然后倒入盒中冷却定型后即可使用。药品包括：酵母粉10 g；维C 1片；维B少量；山梨酸1 g；抗坏血酸4 g。
3) 家蚕采用桑树叶饲养：常规家蚕桑叶喂养法。
2.2. 试验步骤
2.2.1. 人工饲养
将同一批孵出的幼虫用细软毛笔转移到放有人工饲料的养虫塑料盒中，并标记日期和时间，继续在气候箱中饲养，保持光周期14L：10D、RH 75%，视食料食用情况，每隔2 d更换1次人工饲料，3龄幼虫开始每隔1 d更换1次人工饲料，视试验要求饲养16~17天后待用。
2.2.2. 接毒与饲养
单皿饲养饲毒幼虫，每处理3次重复，斜纹夜蛾：100虫/重复、银纹夜蛾：30虫/重复、小菜蛾：20虫/重复、桑蚕：50虫/重复。配制浓度为2.4 × 106 GV/mL (稀释500倍)的MOGV GXW9-3悬液待用。将10 μL病毒悬液滴加到约0.5 cm × 0.5 cm × 0.2 cm人工饲料块上，幼虫饥饿5~6 h后每虫喂食1块，待感染饲料被完全取食后每天更换1次无毒饲料，于28℃、光周期14L：10D、RH 75%的人工气候生化培养箱中饲养。
2.2.3. 室内昆虫饲养MOGV9-3宿主细胞筛选试验与结果(见表1~表2、见图1)
结论：从表1、表2试验及数据统计看出，用12.0亿GV/mL MOGV9-3，稀释500倍液浓度加入饲料中，48 h内5、6龄斜纹夜蛾和银纹夜蛾罹病死亡率达100%；而小菜蛾在同样的给毒试验下，4、5龄48 h幼虫罹病死亡率88.3%，72 h幼虫罹病死亡率100%；而5龄期斜纹夜蛾在同样的给毒试验下48 h幼虫罹病死亡率100%。从试验统计虫体越大暴食越强罹病死亡越快，甚至24 h就体破流出白色浮状病毒，产毒量也越高 [2] ；而虫体较小的小菜蛾48 h罹病死亡率仅为88.3%，相比虫体较大的3种幼虫，且繁毒率亦相应较少。见图1中以24 h罹病死亡率宿主筛选，故确定斜纹夜蛾为该病毒首选宿主 [3] [4] 。
Table 1. Results of indoor MOGV9-3 host cell screening test
表1. 室内MOGV9-3对宿主细胞筛选试验结果
Table 2. Summary of indoor MOGV9-3 host cell screening test results
表2. 室内MOGV9-3对宿主细胞筛选试验结果汇总表
Figure 1. Trend of indoor MOGV9-3 screening test on host cells
图1. 室内MOGV9-3对宿主细胞筛选试验趋势图
3. 斜纹夜蛾细胞繁毒率试验
3.1. 试验材料
1) 供试虫体：斜纹夜蛾幼虫(来自镇江市润宇生物科技开发有限公司饲养虫室)；
2) 供试病毒：斜纹夜蛾颗粒体病毒MOGV GXW9-3 (镇江市润宇生物科技开发有限公司菌种室保存)。
3.2. 试验步骤
3.2.1. 斜纹夜蛾的人工饲养
将同一批孵出的幼虫用细软毛笔转移到放有人工饲料的养虫塑料盒中，并标记日期和时间，继续在气候箱中饲养，保持光周期14L：10D、RH 75%，视食料食用情况，每隔2 d更换1次人工饲料，3龄幼虫开始每隔1 d更换1次人工饲料，视试验要求饲养16~17天后待用并记录各虫龄段生长情况，见表3。
3.2.2. 接毒与饲养
选取斜纹夜蛾不同虫龄幼虫单皿饲养饲毒，每处理3次重复，6虫/重复。配制浓度分别为6 × 106 GV/mL、4 × 106 GV/mL、3 × 106 GV/mL、2.4 × 106 GV/mL、2 × 106 GV/mL的MOGVgxw9-3悬液待用。将10 μL病毒悬液滴加到约0.5 cm × 0.5 cm × 0.2 cm人工饲料块上，幼虫饥饿5~6 h后每虫喂食1块，待感染饲料被完全取食后每天更换1次无毒饲料，于28℃、光周期14L：10D、RH75%的人工气候生化培养箱中饲养 [5] 。
结论：从试验及数据统计看出通过本次试验结果可以看出，从斜纹夜蛾4龄期开始接毒，致死率比较显著。根据表3~表7的调查结果分别得出图2~图5线性图和相应的线性回归方程见表8，根据方程式分别得出斜纹夜蛾颗粒体病毒对斜纹夜蛾不同虫龄毒性的Lc 50值，分别为3龄虫约4.46 × 106 GV/ml、4龄虫约3 × 106 GV/ml、5龄虫约2.49 × 106 GV/ml、6龄虫约2.88 × 106 GV/ml，其中5龄虫Lc 50值最低，其次时6龄，两者均可作为病毒繁殖的活体载体。从表9和图6中可以看出，当浓度为3 × 106 GV/ml时，斜纹夜蛾4、5、6龄72 h的死亡率均超过50%；当浓度为6 × 106 GV/ml时，72 h的死亡率也均超过85%，其中6龄虫死亡率超过90%。根据本次试验结果可以得出斜纹夜蛾病毒活体繁殖需从斜纹夜蛾4龄期开始，其中6龄最佳，其次时5龄，综上所述，得出选取斜纹夜蛾5、6龄幼虫作为病毒繁殖的活体载体 [6] 。
Table 3. Collection of individual growth data for 2nd to 6th instars of Spodoptera litura larvae
表3. 斜纹夜蛾幼虫2~6龄中期个体生长量数据采集
Table 4. Toxicity test results of Spodoptera litura granulosis virus on 3rd instar Spodoptera litura
表4. 斜纹夜蛾颗粒体病毒对3龄斜纹夜蛾毒性试验结果
注：根据表4中的实验数据以百分率的几率值为纵坐标，以浓度的对数值为横坐标，绘制线性回归线及线性回归方程。
Figure 2. Linear plot of toxicity test of Spodoptera litura granulosis virus on 3rd instar Spodoptera litura (72 h)
图2. 斜纹夜蛾颗粒体病毒对3龄斜纹夜蛾毒性试验线性图(72 h)
Table 5. Toxicity test results of Spodoptera litura granulosis virus on 4th instar Spodoptera litura
表5. 斜纹夜蛾颗粒体病毒对4龄斜纹夜蛾毒性试验结果
注：根据表5中的实验数据以百分率的几率值为纵坐标，以浓度的对数值为横坐标，绘制线性回归线及线性回归方程。
Figure 3. Linear plot of toxicity test on 4th instar Spodoptera litura using Spodoptera litura granulosis virus (72 h)
图3. 斜纹夜蛾颗粒体病毒对4龄斜纹夜蛾毒性试验线性图(72 h)
Table 6. Toxicity test results of Spodoptera litura granulosis virus on 5th instar Spodoptera litura
表6. 斜纹夜蛾颗粒体病毒对5龄斜纹夜蛾毒性试验结果
注：根据表6中的实验数据以百分率的几率值为纵坐标，以浓度的对数值为横坐标，绘制线性回归线及线性回归方程。
Figure 4. Linear plot of toxicity test on 5th instar Spodoptera litura using Spodoptera litura granulosis virus (72 h)
图4. 斜纹夜蛾颗粒体病毒对5龄斜纹夜蛾毒性试验线性图(72 h)
Table 7. Toxicity test results of Spodoptera litura granulosis virus on 6-year-old Spodoptera litura
表7. 斜纹夜蛾颗粒体病毒对6龄斜纹夜蛾毒性试验结果
注：根据表7中的实验数据以百分率的几率值为纵坐标，以浓度的对数值为横坐标，绘制线性回归线及线性回归方程。
Figure 5. Linear plot of toxicity test of Spodoptera litura granulosis virus to 6-year-old Spodoptera litura (72 h)
图5. 斜纹夜蛾颗粒体病毒对6龄斜纹夜蛾毒性试验线性图(72 h)
Table 8. Summary of linear relationship between the toxicity test results of Spodoptera litura granulosis virus on Spodoptera litura at different instars
表8. 斜纹夜蛾颗粒体病毒对斜纹夜蛾不同虫龄毒性试验结果线性关系汇总表
Table 9. Summary of toxicity test results of Spodoptera litura granulosomal virus on Spodoptera litura at different ages (72 hours)
表9. 斜纹夜蛾颗粒体病毒对斜纹夜蛾不同虫龄毒性试验结果汇总(72 h)
Figure 6. Mortality line chart of the toxicity test of Spodoptera litura granulosis virus to different instars of Spodoptera litura (72 h)
图6. 斜纹夜蛾颗粒体病毒对斜纹夜蛾不同虫龄毒性试验死亡率折线图(72 h)
4. 斜纹夜蛾不同虫龄不同浓度病毒含量测定
4.1. 材料与方法
4.1.1. 供试虫体
斜纹夜蛾幼虫(来自镇江市润宇生物科技开发有限公司饲养虫室)。
4.1.2. 供试毒株
斜纹夜蛾颗粒体病毒毒株GXW9-3 Mamestra oleracea granulosis virus，12亿GV/ml，镇江市润宇生物科技开发有限公司菌种室保存)。
4.1.3. 试验仪器
冷冻干燥机、电子显微镜、血球计数板。
4.1.4. 试验方法
1) 分别挑选出人工喂养的斜纹夜蛾3龄、4龄、5龄、6龄幼虫，6虫/重复，3次重复，并按照药剂浓度6 × 106、4 × 106、3 × 106、2.4 × 106、2 × 106 GV/mL分别进行试验。过程中分别收集不同虫龄不同浓度的死虫体，作无菌处理并低温保存。
2) 将试验收集的死虫体低温保存15~20天，分别直接进行冷冻干燥，2~3天，干燥结束再分别进行粉粹处理，制成粉剂，待测。
3) 含量测定：将每个处理的粉剂进行一定倍数的稀释，分别滴入血球计数板中，在显微镜下观察并计数，每处理计3板，得平均数。
计算公式：含量(亿GV/g) = 5N × 104 × 稀释倍数；式中：N–为血球计数板上5格内的病毒数。
MOGV9-3经口主要感染鳞翅目昆虫的真皮、脂肪组织及血细胞等，由内向外感染的过程。MOGV颗粒体病毒包含体呈圆形(见附件图A2、图A3)。包含体内只含有单个病毒颗粒，偶有两个。颗粒体长约185~300 nm，宽180~290 nm。幼虫被感染后，会出现食欲减退、体弱无力、行动迟缓、痉挛反应、腹部肿胀变色，当MOGV感染受试昆虫约24小时左右引起病原性后，罹病尸体易一触及发生表皮破裂、流出腥臭、浑浊、乳白色脓液(见附件图A1~图A2)等症状。
Table 10. Determination of granulosis virus content of Spodoptera litura at different ages and concentrations
表10. 斜纹夜蛾不同虫龄不同浓度颗粒体病毒含量测定表
Table 11. Summary table of granulosis virus content of Spodoptera litura at different ages and concentrations
表11. 斜纹夜蛾不同虫龄不同浓度颗粒体病毒含量汇总表
Figure 7. Trend of granulosis virus content in different ages and concentrations of Spodoptera litura
图7. 斜纹夜蛾不同虫龄不同浓度颗粒体病毒含量趋势图
5. 结论
从试验结果可以看出，从斜纹夜蛾4龄幼虫开始饲毒，毒株在活体内繁殖系数增长倍数较高，且根据表10看出同龄虫体含病毒量基本随浓度递增而递增。表11中同一浓度时，斜纹夜蛾幼虫5龄和6龄之间含毒量相差不是很大，当浓度为6 × 106 GV/mL时，斜纹夜蛾6龄幼虫含毒量最高为3.25亿GV/g，且单虫体繁毒量最高为2.8 × 107 GV/g，其次是5龄幼虫含毒量为2.75亿GV/g，单虫体繁毒量为2.0 × 107 GV/g；当浓度为3 × 106 GV/mL时，斜纹夜蛾幼虫5龄和6龄含毒量均为1.75亿GV/g时，毒量增长倍数最高，为58.33倍。由此可见，虫体越大，病毒繁殖越快，含量越高(见附件图A3~图A4)。
基金项目
镇江市现代农业科技项目(编号为NY2019008)。
文章引用
高小文,赵 艳,王浩挺,陆 骏,曹雅虹,陆 畅. 夜蛾颗粒体病毒宿主筛选及其增殖因子主次研究
Host Screening and Proliferation Factors of MOGV GXW9-3 Primary and Secondary Research[J]. 农业科学, 2023, 13(10): 930-945. https://doi.org/10.12677/HJAS.2023.1310128
参考文献
- 1. 梁东瑞, 张起麟. 两种提取菜粉蝶颗粒体病毒方法的比较[J]. 微生物学报, 1983(3): 138-140.
- 2. 孙剑华, 高小文, 关成宏, 等. 110亿OB/mL夜蛾颗粒体病毒悬浮剂对斜纹夜蛾的田间药效试验[J]. 生物灾害科学, 2019, 42(2): 120-125.
- 3. 孟昭金. 黄地老虎颗粒体病毒增殖与温度的关系[J]. 新疆农业科学, 1980(4): 28.
- 4. 陶万强, 潘彦平, 等. 杨扇舟蛾颗粒体病毒室内增殖的研究[J]. 中国森林病虫, 2009, 28(3): 9-10.
- 5. 尹宜农. 菜粉蝶颗粒体病毒规模生产技术研究简报[C]//第七届全国杀虫微生物学术讨论会. 武汉大学学报(自然科学版第44卷).
- 6. 刘强, 丁翠, 等. 粘虫颗粒体病毒及其增效因子对粘虫核型多角体病毒的增效作用[J]. 应用与环境生物学报, 1999, 5(3): 300-304.
附件
Figure A1. Rupture of MOGVgxw9-3 stained corpse
图A1. 染MOGVgxw9-3毒引起病原性罹病尸体
Figure A2. MOGV9-3 proliferation in adipose tissue
图A2. MOGV9-3脂肪组织内增殖
Figure A3. MOGV9-3 proliferation in Microscope
图A3. MOGV9-3于脂肪组织内增殖(电镜)
Figure A4. MOGV9-3 Particle Body (Phase Spectrum Electron adipose tissue (electron microscopy)
图A4. MOGV9-3颗粒体(相谱电镜)
NOTES
*通讯作者。