¹上海中医药大学研究生院，上海

²上海中医药大学附属龙华医院针灸科，上海

收稿日期：2022年1月14日；录用日期：2022年3月3日；发布日期：2022年3月11日

摘要

目的：基于网络药理学方法探讨丹芪通络方治疗颈椎病的潜在作用机制。方法：采用TCMSP数据库筛选出丹芪通络方的活性成分，使用Uni Prot系统预测及规范活性成分的潜在靶点；使用Genecards、OMIM、Disgenet数据库检索颈椎病和颈椎综合征的相关靶点；使用Cytoscape软件构建出药物与疾病靶点的蛋白质相互作用网络，使用Merge功能提取二者的交集网络，交集网络可能就是丹芪通络方治疗颈椎病的关键靶点；使用Metascape网站对上述提取出的关键靶点进行GO和KEGG富集分析。结果：获得有效成分226个，药物靶点299个，颈椎病相关靶点6704个，最终得到关键靶点146个、KEGG通路364条。丹芪通络方治疗颈椎病主要成分可能为槲皮素、β-谷甾醇、植物甾醇、山柰酚、木犀草素等，涉及到的关键通路有癌症信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路等。结论：本项研究初步揭示了丹芪通络方多成分、多靶点、多途径治疗颈椎病的机制，为临床治疗颈椎病提供了新方法。

关键词

网络药理学，丹芪通络方，颈椎病，信号通路

Study on the Mechanism of Danqi Tongluo Recipe in Treating Cervical Spondylosis Based on Network Pharmacology

Wanyi Zhang^1,2, Yi Zeng^1,2, Hongyu Lyu^1,2, Deli Sun²

¹Graduate School of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai

²Department of Acupuncture and Moxibustion, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai

Received: Jan. 14^th, 2022; accepted: Mar. 3^rd, 2022; published: Mar. 11^th, 2022

ABSTRACT

Objective: To explore potential mechanism of Danqi Tongluo Recipe in treating cervical spondylosis based on network pharmacological method. Methods: Based on the TCMSP Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform, the active components of Danqi Tongluo Recipe were obtained, and the target gene was predicted according to the Uni Prot system. The targets of cervical spondylosis and cervicobrachial syndrome were searched through databases of Genecards, OMIM and Disgenet. Cytoscape software was used to establish protein-protein interaction (PPI) networks of medicinal substances of Danqi Tongluo Recipe and cervical spondylosis. Enrichment analyses of GO and KEGG on the key targets were performed by Metascape. Results: There were 226 medicinal components, 299 medicinal targets, 6704 targets for cervical spondylosis, 146 key targets and 364 KEGG pathways. The main components of Danqi Tongluo Recipe in treating cervical spondylosis were quercetin, beta-sitosterol, stigmasterol, sitosterol, kaempferol, luteolin, etc. The key targets were HSPA8, RPS27A, RPS27, STAU1, etc. The key biological processes and pathways might include signaling pathways of pathways in cancer, IL-17 signaling pathway, HIF-1 signaling pathway, MAPK signaling pathway, p53 signaling pathway, etc. Conclusion: This study preliminarily reveals a multiple component, target and pathway mechanism of Danqi Tongluo Recipe in treating cervical spondylosis. It provides a new idea for clinical drug prescriptions of cervical spondylosis.

Keywords:Network Pharmacology, Danqi Tongluo Recipe, Cervical Spondylosis, Signaling Pathway

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

颈椎病是由于颈椎相邻椎体和椎体间盘形成的关节周围椎间盘退变而发生的非炎症过程。椎间盘退变和脊椎病的发展是正常衰老过程的一部分 [1]。一项基于我国社区的调查研究显示颈椎病患病率为13.76%，发病率最高的是45~60岁年龄组 [2]。颈椎病的常规治疗方法包括手术疗法、非手术疗法，手术疗法价格高昂、风险大，非手术治疗以止痛药、肌肉松弛剂、物理疗法、牵引、中药、针灸、推拿等为主 [3]。其中中医药凭借其多方位、多靶点、多机制，毒副作用小等特点，在治疗颈椎病有显著优势和广阔前景。

中医学认为颈椎病属于“项痹”范畴，内因是由于气血亏虚，无法濡养筋骨；外因是劳累过度，起居不慎，风寒湿邪入侵，壅闭经络，导致气虚血瘀、经络不通，患者常感疼痛、麻木等症状 [4]。丹芪通络方，是龙华医院孙德利副主任医师在多年临床诊疗中归纳总结出的经验方，由丹参、黄芪、当归、川芎、白芍、红花、党参、茯苓、白术、桂枝、葛根、骨碎补、威灵仙、延胡索、木香15味中药组成，具有益气活血通络之功效，治疗颈椎病临床效果显著。本项研究利用中药复方网络药理学方法，探讨丹芪通络方的有效活性成分和潜在作用靶点，以了解其治疗颈椎病的作用机制，为临床治疗颈椎病应用提供新方法。

2. 资料与方法

2.1. 丹芪通络方所含成分的收集与筛选

丹芪通络方由15味中药组成，分别是丹参、黄芪、党参、白术、茯苓、川芎、延胡索、木香、当归、白芍、红花、葛根、威灵仙、骨碎补、桂枝。通过中药药理学数据库TCMSP [5] 收集以上15味中药的活性成分，根据限定口服生物利用度(oral bioavail-ability, OB) ≥ 30%和类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18 [6] 筛选所有活性成分，再根据文献报道对活性成分进行补充。

2.2. 丹芪通络方成分靶点预测

通过“2.1”中筛选出的活性成分的相关蛋白靶点，使用Uni Prot数据库 [7] (https://www.uniprot.org/)将检索到的所有靶点蛋白的名称进行校正，转换为官方基因名称(Official Symbol)。

2.3. 颈椎病相关基因靶点的筛选

通过Gene Cards数据库 [8] (http://www.genecards.org)、OMIM数据库 [9] (https://omim.org/)和Dis Ge NET数据库 [10] (http://www.disgenet.org)检索与颈椎病相关基因。分别使用检索词Cervical Spondylosis (颈椎病)和Cervical Syndrome (颈椎综合征)进行检索，获取疾病相关基因。

2.4. 蛋白质互作网络构建及关键靶点筛选

利用韦恩图将丹芪通络方靶点基因与颈椎病相关基因进行合并，形成的交集部分推测其可能是丹芪通络方活性成分治疗颈椎病的靶点基因。将丹芪通络方活性成分靶点与颈椎病靶点分别导入Biso Genet内，各自生成1个蛋白质互作网络(protein-protein interaction, PPI)，通过Cytoscape [11] 中的Merge功能提取上述2个蛋白质互作网络的交集网络从而得到关键靶点。

2.5. 通路富集分析

将上述关键靶点导入Metascape数据库 [12] (http://metascape.org)，将物种设置为人类，选择自定义分析(Custom Analysis)中的富集(Enrichment)，分别对于GO Biological Processes、GO Molecular Functions、GO Cellular Components、KEGG Pathway进行富集分析(Enrichment Analysis)，保存结果，筛选排名靠前条目并进行可视化。

3. 结果

3.1. 丹芪通络方成分的收集与筛选

通过TCMSP数据库，根据限定OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18收集丹芪通络方中符合条件的活性成分，结果得到黄芪20种、丹参65种、党参21种、白术7种、茯苓15种、川芎7种、延胡索49种、木香6种、当归2种、白芍13种、红花22种、葛根4种、威灵仙7种、骨碎补18种、桂枝7种。所有化合物去重后共得到226种活性成分。

3.2. 丹芪通络方“活性成分–靶点”网络构建和分析

利用Cytoscape 3.7.1对丹芪通络方活性成分及其作用靶点的关系网络进行绘制和分析，共获得496个节点与4218条关系，结果见图1。根据度值排名靠前的成分为槲皮素(Quercetin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、谷甾醇(Sitosterol)、植物甾醇(Stigmasterol)、山柰酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)等，表明这些化合物可能是丹芪通络方治疗颈椎病的主要活性成分。

图1. 丹芪通络方活性成分–靶点网络图

3.3. 丹芪通络方靶点预测

通过TCMSP数据库检索丹芪通络方所含226种活性成分，结果得到出1466个靶点，其中黄芪210个、丹参138个、党参110个、白术19个、茯苓23个、川芎30个、延胡索212个、木香32个、当归52个、白芍90个、红花215个、葛根67个、威灵仙52个、骨碎补166个、桂枝50个。去重后共得到299个靶点，通过Uni Prot数据库将靶点蛋白转换为官方名称(Official Symbol)。

3.4. 颈椎病相关基因靶点筛选

在Gene Cards、OMIM和Dis Ge NET数据库中以Cervical Spondylosis (颈椎病)和Cervical Syndrome (颈椎综合征)进行检索后，分别获得279、6565个相关基因靶点，删除重复后共得到6704个颈椎病相关基因。丹芪通络方靶点与颈椎病相关靶点交集为243个共同基因，见图2。

3.5. 丹芪通络方治疗颈椎病的PPI网络构建

3.5.1. 丹芪通络方治疗颈椎病的PPI网络绘制

运用 Cytoscape分别构建丹芪通络方与颈椎病的PPI网络，结果显示：丹芪通络方潜在靶点可与8564个靶点产生直接或间接作用，其相互关系可达188,537种；与颈椎病直接或者间接相关的靶点有8524个，靶点间相互联系可达187,108种。

3.5.2. 丹芪通络方治疗颈椎病关键靶点筛选

计算交集PPI的网络拓扑学特征属性值后，进行2次筛选，共获得关键靶点146个，筛选过程见图3。

图2. 丹芪通络方靶点与颈椎病靶点分布图

图3. 丹芪通络方与颈椎病关键节点筛选图

3.6. 丹芪通络方治疗颈椎病通路富集分析可视化

利用Metascape平台对上述关键节点进行基因富集分析，包括GO的BP (biological process)、CC (cellular component)、MF (molecular function)以及KEGG通路，保存其结果，并将其结果将其进行可视化。BP、CC、MF结果见图4~6；KEGG通路结果见图7。

4. 讨论

4.1. 丹芪通络方方解

随着社会工作方式的转变，越来越多的人长期伏案工作，颈椎病发病率逐渐增高。颈椎病属于古代文献记载“项痹”，属于痹证范畴。《济生方·痹》中记载：“皆因体虚，腠理空疏，受风寒湿气而成痹也”。中医学认为痹证的发生的本质在于患者先天禀赋及后天调养不足，内有气血亏虚，气血不足，

图4. 生物进程

图5. 细胞组分

图6. 分子功能

图7. 丹芪通络方治疗颈椎病作用靶点富集气泡图

筋脉失于荣养，易外受风寒湿等外邪侵袭，外邪客于颈项部经络，经络不通，故见颈肩关节疼痛，活动不利。痹病日久，经络受阻，经络不通则气血运行不畅，气不行血，则瘀血闭塞经络，进而引起颈项僵硬、肢体刺痛等 [13]。丹芪通络方中以黄芪、丹参为君药，甘温之黄芪，善补脾肺之气，脾主肌肉，故有补气生肌的作用，扶助升阳以助驱邪，有利于散寒；丹参味苦微寒，取其活血化瘀之效，配伍黄芪补气以推动血行，二者共奏益气活血之功效；研究表明此二者共用，能够通过NF-кB信号通路、Wnt信号转导通路和JAK/ATAT通路的调节，修复骨骼肌损伤 [14]。党参健脾益气，扶正祛邪，治疗诸般虚证，有保护神经、抗炎、抗氧化、抗应激等作用 [15]；白术健脾益气、燥湿利水，白术内酯具有抗炎活性，能够促进炎性巨噬细胞因子表达的改变 [16]；茯苓利水渗湿，协助祛除体内寒湿，以上三者助力黄芪之益气之功。川芎为血中之气药，行气活血止痛，味辛行气开郁，活血止痛，具有抗炎镇痛、细胞保护等作用 [17]；延胡索活血行气止痛，通过调节中枢神经系统、抗炎、解痉来起到止痛效果 [18]；木香健脾行气止痛，以上三者共奏行气止痛之效。当归补血活血，在活血祛瘀的同时不伤血；红花有活血祛瘀止痛之功，红花单体成分具有保护成骨细胞的作用 [19]，以上二者助力丹参之活血之功。以上诸药均为臣药。白芍养血和营通瘀，缓急止痛；威灵仙通经络，祛风湿，《海上集验方》称其“去众风，通十二脉”，对于风湿痹痛，肢体麻木，筋脉拘挛，屈伸不利皆有疗效，是治疗风湿痹痛之要药；骨碎补补肝肾，强筋骨，利关节，骨碎补总黄酮具有抗骨质疏松、促进骨折愈合、抗炎等作用 [20]。以上是为佐药。葛根升阳解肌，缓解颈项强痛；桂枝通达营卫，疏通经络，引药循行直达病所，是为使药。全方共奏益气活血，祛风通络之功，兼有补肾，为攻补兼施之剂，于扶正祛邪当中，攻中有补，攻补兼施、标本兼治。

4.2. 丹芪通络方药物活性成分分析

度值排名第一的成分槲皮素(quercetin)是黄芪、延胡索、红花的共有成分，拥有154个作用靶点，槲皮素具有抗炎症的特性，作为AMPK和SIRT1激活剂，可能通过干扰AMPK/SIRT1通路减少炎症的发生 [21]。槲皮素作为自由基清除剂，通过参与调节PI3K/Akt、酪氨酸激酶、PKC和MAPK等与认知、神经元相关的信号通路，抑制转录因子(AP-1, STAT-1, NF-B)和破坏膜脂筏的积聚来发挥抗氧化作用 [21]。白芍、当归、葛根、骨碎补、桂枝、红花、威灵仙的共有化合物β-谷甾醇(beta-sitosterol)度值排名第二，作用于38个靶点；植物甾醇(Stigmasterol)度值排名第五，是当归、党参、骨碎补、红花、木香、威灵仙、延胡索的共有化合物，作用于31个靶点；谷甾醇(sitosterol)是白芍、川芎、桂枝、木香、延胡索的共有化合物，作用于3个靶点。研究表明β-谷甾醇能够抑制由PGN，TNF-α或LPS(如TNF)诱导的角质形成细胞和巨噬细胞分泌TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8和ROS，能够降低NLRP3炎性小体的关键成分NLRP3的表达，并抑制了caspase-1的活化 [22]，还能够抵抗IL-1β诱导的NF-κB通路 [23]。山柰酚(Kaempferol)度值排名第三，是白芍、骨碎补、红花、黄芪的共有化合物，作用于63个靶点，山萘酚是一种饮食生物类黄酮，普遍存在于各种类型的植物中。它通过抑制脂肪生成，炎症，氧化应激，破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡，同时激活成骨细胞自噬来发挥抗氧化和抗炎活性作用。能够通过调节核因子-κB (NF-κB)，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路发挥抗骨老化的作用 [24]。木犀草素(Luteolin)是丹参、党参、骨碎补的共有成分，度值排名第四，一种重要的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎和神经保护作用，能够在免疫细胞中抑制细胞因子表达、核因子κB (NFkB)信号和TLR4信号 [25]。

君药黄芪含有黄芪多糖、黄芪总苷等多种成分。黄芪多糖能够降低患颈椎病大鼠的纤维环组织内 MMP2和MMP9的表达水平，同时能够增高TIMP2表达水平，起到改善椎间盘退变的作用 [26]。黄芪总苷能够显著降低颈椎间盘中细胞因子白细胞介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素－1β (IL-1β)的含量，减缓或改善椎间盘的退变 [27] [28]。丹参成分丹参酮有41个靶点，能清除氧自由基、起抗氧化作用，从而清除炎症因子对机体血管的损伤，能够降低患者的肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、干扰素γ (IFN-γ)水平 [29]。研究结果显示，丹参酮I能够抑制白细胞介素1β (IL-1β)显著诱导CHON-001细胞凋亡、细胞外基质降解和炎症反应 [30]。

4.3. 关键靶点结果分析

蛋白相互作用网络结果显示丹芪通络方作用于颈椎病的靶点间有复杂的交互关系。研究发现核心靶点HSPA8能够诱导神经退行性疾病相关蛋白的积累 [31]。RPS27A可能是触发神经退行性疾病的小胶质细胞激活的控制器 [32]。RPS27作为细胞对各种生长因子和其他环境信号的增殖反应的潜在重要介体而发挥作用，能够与DNA中的cAMP反应元件特异性结合 [33]。STAU1的高表达会导致多种炎症和免疫反应基因的表达水平发生变化，其会对与“神经生长因子受体信号通路”相关的基因产生显著的调节作用。说明其对于神经元的损伤后修复和再生具有重要意义 [34]。

4.4. 通路与生物进程分析

GO富集分析发现，丹芪通络方治疗颈椎病主要涉及的生物学过程包括：cellular response to organic cyclic compound (细胞对有机环化合物的反应)、response to inorganic substance (对无机物的反应)、response to xenobiotic stimulus (对外来刺激的反应)、response to wounding (对受伤的反应)、apoptotic signaling pathway (凋亡信号通路)、positive regulation of cell death (积极调控细胞死亡)、response to oxygen levels (对氧气水平的反应)等。涉及的分子功能有protein kinase binding (蛋白激酶结合)、protein domain specific binding (蛋白质结构域特异性结合)、oxidoreductase activity (氧化还原酶活性)、protein homodimerization activity (蛋白质均二聚活性)等。涉及的细胞组分有membrane raft (膜筏)、receptor complex (受体复合体)、dendrite (树突)、perinuclear region of cytoplasm (细胞质的核周区域)、synaptic membrane (突触膜)等，是一个复杂的过程。

通过KEGG生物途径富集分析发现，有多条信号通路被显著富集。包括Pathways in cancer (癌症的途径)、Transcriptional misregulation in cancer (癌症中的转录失调)、IL-17 signaling pathway (IL-17信号通路)、HIF-1 signaling pathway (HIF-1信号通路)、MAPK signaling pathway (MAPK信号通路)、p53 signaling pathway (p53信号通路)等，因此推测丹芪通络方治疗颈椎病可能与上述通路关系密切。癌症信号通路(Pathways in cancer)及Transcriptional misregulation in cancer (癌症中的转录失调)参与细胞的增殖、分化、运动、迁移等过程，与细胞炎性反应、凋亡等生物功能相关联 [35]。IL-17 信号通路中IL-17A是一种促炎性细胞因子，也具有促进血管生成和破骨细胞生成的能力 [36]。IL-17B和IL-17C与TNF-α的产生有关，与炎症相关 [37]。HIF-1是与细胞缺氧相关的信号通路 [38] [39]。通用的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路由四个不同的级联共享，与细胞增殖，分化，迁移，衰老和凋亡有关 [40]。MAPK信号通路能够促进炎细胞因子的表达，并有效抑制人软骨细胞的凋亡 [41]。椎间盘退变的发生可能激活p53信号通路 [42] [43]。其他相关性较高的信号通路。其他信号通路目前尚未发现相关文献报道，需要进一步探索，以证实其作用机制。

5. 结语

综上所述，丹芪通络方治疗颈椎病主要成分可能为槲皮素、β-谷甾醇、植物甾醇、山柰酚、木犀草素、黄芪多糖、黄芪总苷、丹参酮等，涉及到的关键通路有癌症信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路，与细胞对有机环化合物的反应、对无机物的反应、对外来刺激的反应、凋亡信号通路、积极调控细胞死亡、对氧气水平的反应等多个生物学过程相关。因此推断丹芪通络方可能通过以上通路发挥治疗颈椎病的作用。本研究利用网络药理学方法对丹芪通络方治疗颈椎病的机制进行探讨，发现此方包含多种活性成分，涉及多种信号通路和生物过程，体现了多成分、多靶点、多途径发挥作用的特点，同时需要后续的研究，为临床治疗颈椎病提供新的参考。

基金项目

2020~2021年度上海市卫生健康委员会中医药科研项目计划(2020LP040)，上海中医药大学附属龙华医院科技创新项目(CX202018)。

文章引用

张宛宜,曾 怡,吕虹宇,孙德利. 基于网络药理学的丹芪通络方治疗颈椎病作用机制研究
Study on the Mechanism of Danqi Tongluo Recipe in Treating Cervical Spondylosis Based on Network Pharmacology[J]. 中医学, 2022, 11(02): 213-223. https://doi.org/10.12677/TCM.2022.112034

参考文献