贵州师范大学生命科学学院，西南喀斯特山区生物多样性保护国家林业局重点实验室，贵州 贵阳

收稿日期：2023年12月8日；录用日期：2024年1月9日；发布日期：2024年1月19日

摘要

bZIP是植物抗逆性领域关键的转录因子，能调控细胞生物学中的各种生命过程，包括生长、发育、应激响应和代谢调控。为了深入研究鱼腥草中bZIP60基因的功能与调控机制，以鱼腥草为材料提取总RNA，合成cDNA第一链，然后成功克隆出鱼腥草HtbZIP60基因，并对其进行相关的生物信息学分析。结果表明，HtbZIP60的编码序列全长为996 bp，编码331个氨基酸，蛋白质分子质量37447.00 ku，不含信号肽剪切位点，包含跨膜结构域，以α螺旋为主要构成，定位于细胞核，具有30个已知功能的启动子。这些发现为深入研究HtbZIP60在鱼腥草生长与发育中的生物学功能提供了科学基础。

关键词

鱼腥草，HtbZIP60，生物信息分析，基因克隆

Cloning and Bioinformatic Analysis of the Analysis of HtbZIP60 Gene in Houttuynia cordata thunb

Qian Ye^*, Nannan Zhang^*, Xin Liu, Li Chen, Zhengting Yang^#

Key Laboratory of State Forestry Administration on Biodiversity Conservation in Karst Mountainous Areas of Southwestern China, School of Life Sciences, Guizhou Normal University, Guiyang Guizhou

Received: Dec. 8^th, 2023; accepted: Jan. 9^th, 2024; published: Jan. 19^th, 2024

ABSTRACT

bZIP is a key transcription factor in the field of plant stress resistance, capable of regulating various biological processes in cell biology, including growth, development, stress response, and metabolic regulation. To investigate the function and regulatory mechanism of the HtbZIP60 gene in Houttuynia cordata thunb, total RNA was extracted from Houttuynia cordata thunbas the material, and the first strand of cDNA was synthesized. Subsequently, the HtbZIP60 gene from Houttuynia cordata thunb was successfully cloned, and relevant bioinformatics analysis was conducted. The results revealed that the coding sequence of HtbZIP60 is 996 bp in length, encoding 331 amino acids, with a protein molecular weight of 37447.00 ku. It lacks a signal peptide cleavage site but contains a transmembrane structure domain, predominantly composed of α-helices. The protein is localized in the cell nucleus and possesses 30 known functional promoters. These findings provide a scientific foundation for further exploring the biological functions of HtbZIP60 in the growth and development of Houttuynia cordata thunb.

Keywords:Houttuynia cordata thunb, HtbZIP60, Bioinformatics Analysis, Gene Cloning

Copyright © 2024 by author(s) and Hans Publishers Inc.

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1. 引言

鱼腥草是一种常见的草药，其全草或干燥的地上部分含有丰富的黄铜、有机酸和无机盐等多种具有药效的成分 [1] 。这些成分赋予了鱼腥草多种潜在的药用功效，包括抗菌、抗病毒、抗炎症等作用，有助于缓解感冒、流感和其他呼吸道感染 [2] ；同时，它还具有排毒、清热解毒、利尿、免疫增强以及潜在的抗癌作用 [3] [4] [5] 。然而，鱼腥草的生存能力和种群扩张受到了干燥、寒冷和重金属污染等环境压力的严重影响。为提高鱼腥草在环境压力下的生存能力，了解其环境应激信号通路对于鱼腥草的研究和保护至关重要。

bZIP转录因子因其独特的bZIP结构域而命名，其中包括一个碱性区域和一个亮氨酸拉链区域 [6] 。这一结构域是bZIP转录因子的标志性特征，它们通过该结构域与DNA结合并参与基因的调控。bZIP转录因子家族涵盖了多种不同成员，广泛分布于真核生物，包括植物、动物和真菌等 [7] [8] ，这种广泛性表明bZIP家族在生物体内具有高度的保守性和重要性。bZIP转录因子在细胞中扮演着多种角色，涉及到广泛的生物学过程。它们可以调控基因的转录，并参与发育、生长、分化、应激响应、代谢和疾病等多个生物学过程 [9] [10] 。许多bZIP转录因子在细胞面对环境应激时发挥关键作用 [10] 。例如，一些家族成员在细胞应激响应中起重要作用，帮助细胞应对氧化应激、热应激、脂质代谢等情况。此外，一些bZIP转录因子与疾病的发生和发展密切相关。例如，CHOP (C/EBP Homologous Protein)在内质网应激和细胞凋亡中发挥关键作用，与多种疾病如癌症、糖尿病和神经退行性疾病等相关 [11] 。

AtbZIP60是拟南芥中的一个重要转录因子，对协调各种生物学响应起着重要作用。它调控与内质网应激、热应激、病原体感染、防御激素响应和其他关键过程相关的基因表达 [12] [13] 。ZmbZIP60在玉米中对植物的多种适应性过程起着贡献作用，它有助于适应升高的温度、保持内质网稳定、增强抵抗病原体的能力，并帮助应对干旱 [14] 。同样，在环境应激条件下，SlbZIP60在番茄植物中被激活。这种激活调节了特定基因的表达，增强了植物对高温和病毒感染等环境应激因素的抵抗力 [15] 。然而，关于鱼腥草中HtbZIP60的调控机制的深入研究尚未见报道。因此研究鱼腥草中HtbZIP60的关键基因序列和结构信息对于阐明其代谢机制至关重要。

因此，在前期研究中我们利用鱼腥草转录组数据，通过逆转录–聚合酶链反应法(RT-PCR)克隆获得了HtbZIP60基因序列，并利用生物信息学方法对其结构和功能进行了分析。这为我们进一步探究HtbZIP60基因在胁迫环境中的功能提供了科学依据。

2. 材料与方法

2.1. 实验试剂

小量提取植物组织Total RNA试剂盒，逆转录试剂盒(TakaRa)、普通DNA产物纯化试剂盒(离心柱型)。

2.2. 基因克隆的克隆

我们使用小量提取植物组织Total RNA试剂盒来萃取高质量的RNA。然后，使用逆转录试剂盒(TakaRa)将RNA反转录成cDNA。再利用在线网站Primer3Plus (http://www.primer3plus.com/)设计PCR引物(F’: ATGGCAGATCAGCGCGAGGA, R’: CTTCTGTTTTGTGGCTCTAA)。采用鱼腥草cDNA为底物，制备50 μL的PCR反应液体系(cDNA 2 μL；引物各2.5 μL；Prime STAR Max Premix (2X) 25.0 μL；ddH2O 18 μL)。反应条件为：95℃ 4 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，68℃ 50 s，68℃ 10 min，共35个循环，并以4℃保存为程序，扩增目的基因片段。最终，我们将扩增得到的目的基因片段提交给上海擎科生物科技有限公司进行测序。

2.3. 生物信息分析

将所得序列进行以下生物信息学分析。

2.3.1. 基因基本信息分析

通过对生工生物公司送测的结果进行深入分析和科研研究，成功地获取了HtbZIP60基因的重要基本信息。我们将该基因的序列特征等特征进行分析总结。

2.3.2. 蛋白质结构域预测

通过CNBI在线网站对HtbZIP60基因序列进行翻译，随后将所得的氨基酸序列输入至Interproscan在线工具(https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/)进行分析，以推测该基因可能存在的蛋白质结构域。

2.3.3. 同源基因分析与多序列对比

我们将HtbZIP60基因上传至NCBI数据库，并运用NCBI在线工具执行BLAST分析，以检索出与HtbZIP60基因相似的同源序列。随后，从中选取前三个具有最高相似性的基因，进行详尽的基因分析。接下来，我们使用Clustal Omega在线工具(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对这四个基因进行多序列比对，并构建系统发育树，以进一步研究它们之间的关系和进化历史。

2.3.4. 蛋白质特性分析

将HtbZIP60的基因序列上传至Clustal Omega在线工具(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行分析，以获得关于HtbZIP60蛋白质特性的信息。再利用PRABI-GERLAND工具 (https://doua.prabi.fr/templates/services)对HtbZIP60的蛋白质结构进行详细分析。

2.3.5. 跨膜域结构与信号肽分析

利用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线软件对HtbZIP60基因进行了跨膜结构分析，并利用Novopro (https://novopro.cn/tools/signalp.html)在线工具对HtbZIP60基因进行分析，得出HtbZIP60蛋白质的信号肽分析结果。

2.3.6. 蛋白质二级、三级结构预测

利用PSIPED Workbench (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在线软件对HtbZIP60基因和与该基因同源性更近的基因进行蛋白质二级结构的分析。再利用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)在线软件对HtbZIP60基因进行蛋白质三级结构的模型建构。

2.3.7. 亚细胞定位预测

使用在线工具PSORT (https://www.genscript.com/tools/psort)对HtbZIP60基因进行了亚细胞定位的预测分析，以了解该基因在细胞内可能的位置。

2.3.8. 启动子分析

使用Plantcare在线工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对HtbZIP60基因的启动子区域进行分析，以获取与顺式作用元件相关的数据。

3. 结果与分析

3.1. 鱼腥草HtbZIP60基因的克隆及其序列基本信息分析

提取鱼腥草的RNA后，将其逆转录为cDNA第一链。以cDNA为模板， F (ATGGCAGATCAGCGCGAGGA) R (CTTCTGTTTTGTGGCTCTAA)为进行HtbZIP60基因的全长扩增，电泳结果显示在750 bp偏上，1000 bp左右处有一条单一的高亮度目的条带(如图1)。将剩余的PCR产物进行测序，得到全长为956 bp的基因序列，经NCBI blastn对比后命名为鱼腥草HtbZIP60基因。

利用ORF finder确定HtbZIP60基因的开放阅读框为956 bp (如图2(a)，编码331个氨基酸(如图2(b))。

图1. 鱼腥草HtbZIP60基因PCR扩增产物电泳(M为Maker，1，2为PCR样品)

图2. 鱼腥草HtbZIP60开放阅读框(a)及编码区氨基酸序列(b)

3.2. 生物信息分析结果

3.2.1. 蛋白质结构域预测

利用Interproscan (https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/)在线工具分析得出，HtbZIP60基因家族成员有一个碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构域转录因子，它的真核生物的蛋白质包含介导序列特异性DNA结合的基本区域，随后是二聚化所需的亮氨酸拉链区域。目前，bZIP的几个结构及其功能已得到解决。碱性区域和亮氨酸拉链形成连续的α-螺旋，其中亮氨酸拉链的四个疏水残基定向在一侧。这种构象允许平行二聚化，并且使螺旋弯曲，以便新功能的二聚体形成灵活的叉，其中N末端开放端的基本结构域可以与DNA相互作用。因此，可以使两个亮氨酸拉链的方向垂直于DNA。

3.2.2. 同源基因分析与多序列对比

利用NCBI在线软件，对该HtbZIP60基因进行BLAST操作，共分析出9个同源序列，提取前三个相似度最高的基因(XM_006849869、XM_020846332、JX169820)的蛋白质序列，然后对以上三个基因的功能进行功能预测，发现这三个基因都与HtbZIP60基因有着相同的蛋白质功能，它们都在调控与内质网应激相关的基因方面发挥着关键作用。

利用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在线软件对HtbZIP60、XM_006849869、XM_020846332、JX169820这四个基因进行多序列对比和系统发育树建构，结果如图3、图4。从系统发育树来看，我们可以看出HtbZIP60基因与XM_020846332同源关系更紧密。从多序列对比图中可以看出，与其他三个基因相比，它主要是在152号、312号等位点与其他三个基因不同。

图3. XM_006849869、XM_020846332、JX1698205、HtbZIP60发育树(Hocor06aG0052100.1.0.28547为HtbZIP60)

图4. XM_006849869、XM_020846332、JX1698205、HtbZIP60多序列对比(Hocor06aG0052100.1.0.28547为HtbZIP60)

3.2.3. 蛋白质特性分析

利用ExPaSy-ProParam (https://web.expasy.org/protparam/)在线工具对HtbZIP60基因进行蛋白质特性分析可得：该蛋白质分子质量为37447.00 ku，等电点为4.76，带负电荷的残基总数(Asp + Glu)：59，带正电荷的残基总数(Arg + Lys)：39，原子组成：碳C：1631、氢气H：2587、氮气N：465、氧气O：522、硫磺S：12，其分子式：C₁₆₃₁H₂₅₈₇N₄₆₅O₅₂₂S₁₂，原子总数：5217；不稳定指数(II)计算为61.01，故将该蛋白质归类为不稳定的。脂肪指数：88.67，亲水性总平均值(GRAVY)：−0.548，故推测为亲水性蛋白。

利用PRABI-GERLAND (https://doua.prabi.fr/templates/services)在线工具对HtbZIP60基因进行分析，发现HtbZIP60蛋白质的氨基酸组分中186个为α螺旋，占比56.19%；12个延伸链，占比3.63%，6个β转角，占比1.81%，127个无规则卷曲，占比38.37%。

3.2.4. 跨膜域结构与信号肽分析

利用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线软件对HtbZIP60基因进行了跨膜结构分析，结果如图5。发现该基因有发现该基因有1个跨膜螺旋，位于第243号氨基酸到265号氨基酸。

图5. HtbZIP60跨膜结构图

使用Novopro (https://novopro.cn/tools/signalp.html)在线工具对HtbZIP60基因进行了分析。根据结果显示(见图6)，HtbZIP60蛋白质中含有信号肽的概率仅为0.041%，并且未检测到其他相关内容。这一结果表明，HtbZIP60蛋白是一种不包含信号肽的蛋白质。进一步推测，该蛋白可能属于非分泌蛋白质类型。

3.2.5. 蛋白质二级、三级结构预测

利用PSIPED Workbench (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在线软件对HtbZIP60基因和与该基因同源性更近的XM_006849869基因进行蛋白质二级结构的分析(如图7)。从图中可以看出，HtbZIP60和XM_006849869基因的序列基本相似，3号、4号、5号、8号、9号、10号、11号、12号、14号位点等多个位点发生了明显的变化。3号位点由天冬酰胺变成了谷氨酸，4号位点由谷氨酰胺变成了亮氨酸，5号位点由精氨酸变成了缬氨酸，8号位点由天冬酰胺变成了丝氨酸，9号位点由半胱氨酸变成了苯丙氨酸，10号位点由甘氨酸变成了精氨酸，11号位点由亮氨酸变成了谷氨酸，12号位点由天冬酮变成了天冬酰胺，14号位点由天冬氨酸变成了色氨酸，可能与该基因调控不同情况的调节应激响应基因方面的功能与该突变有关，这一点有待研究。

图6. HtbZIP60信号肽图

图7. HtbZIP60和XM_006849869基因蛋白质二级结构图((a) HtbZIP60二级结构图；(b) XM_006849869二级结构图)

利用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)在线软件对HtbZIP60基因进行蛋白质三级结构的模型建构(如图8)。可以看出该基因多为α螺旋，所以该基因蛋白稳定性较好，且该蛋白质为亲水蛋白质。

图8. HtbZIP60基因蛋白质三级结构图

3.2.6. 亚细胞定位预测

利用PSORT (https://www.genscript.com/tools/psort)在线软件分析，发现HtbZIP60基因的位置最有可能位于细胞核，数据显示，HtbZIP60基因在细胞核上的占比高达73.9%，由此可以得出HtbZIP60基因主要定位于细胞核中。同时它也有可能定位于细胞质膜、细胞质基质、分泌系统的囊泡、线粒体。数据显示细胞质膜与细胞质基质均占8.7%，其余各占4.3%。通过预测结果我们可以直接的在相应位置找出HtbZIP60基因所表现出的相关功能，比如分泌蛋白合成过程中，HtbZIP60基因作为参与基因调控和信号传导等生物过程中的重要蛋白质，进行应激响应。通过对基因的亚细胞定位预测，可以为后续实验研究提供相应参考。

3.2.7. 启动子分析

用Plantcare (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线软件对HtbZIP60基因进行分析，结果如图9，分解结果得出该基因启动子区59个顺式作用元件，其中已知有功能的元件共30个，具有功能的元件如表1所示，包括(1)启动子和增强子区域中常见的顺式作用元件CAAT-box(2)与分生组织表达相关的顺式调控元件CAT-box(3)参与昼夜节律调控的顺式调控元素circadian、G-box(4)光响应元件的一部分GTGGC-motif(5)参与干旱诱导的MYB结合位点MBS(6)赤霉素响应元件P-box(7)转录起始点周围的核心启动子元件(位于−30位置附近)TATA-box(8)参与防御和应激响应的顺式调控元素TC-rich repeats(9)短函数。

图9. HtbZIP60顺式作用元件

表1. HtbZIP60基因作用元件分析

4. 讨论和结论

本研究利用鱼腥草转录组测序结果，成功从鱼腥草中克隆了HtbZIP60基因，该基因编码的蛋白质由331个氨基酸组成，属于bZIP家族成员。对HtbZIP60蛋白质进行分析发现，它的等电点为4.76，具有偏酸性，在酸性环境中容易沉淀；同时，它具有较高的稳定值，属于不稳定的亲水性蛋白质。通过跨膜结构域和信号肽分析发现，HtbZIP60蛋白质不含信号肽剪切位点，但包含一个跨膜结构域，这表明它可能参与跨膜运输。亚细胞定位预测结果显示HtbZIP60主要定位于细胞核，这表明细胞核是HtbZIP60蛋白质发挥功能的主要位置。进一步预测蛋白质结构域时发现，HtbZIP60翻译的蛋白质仅具有一个bZIP结构域，对内质网应激相关基因的调控发挥关键作用。

另外，通过氨基酸序列比对和进化树分析发现，HtbZIP60与其他相关基因存在密切的关系，尤其是与具有类似功能的基因之间。然而，在预测的二级结构中，我们观察到了与这些相似基因的差异，这可能会对HtbZIP60在应激响应中的功能产生影响。这为今后深入研究bZIP家族在不同生物中的调控机制提供了重要的参考。

此外，通过生物信息学分析，我们发现鱼腥草的HtbZIP60基因具有多个功能启动子，这些启动子参与了分生组织表达、昼夜节律调控、赤霉素响应、干旱应答、防御和应激响应等多个生物学功能。这些结果对于我们深入了解植物的生长机制、适应逆境环境以及基因调控网络提供了重要的思考方向。

在本实验成功地利用RT-PCR法克隆了鱼腥草HtbZIP60基因，并通过生物信息学方法对HtbZIP60蛋白进行了理化性质、二级和三级结构预测、同源性分析以及系统进化树的构建。这些分析揭示了该基因的重要分子特征，为进一步深入研究鱼腥草在逆境条件下的基因调控机制奠定了理论基础。

基金项目

贵州师范大学大学生创新训练项目(S202310663056)。

文章引用

叶 茜,张楠楠,刘 鑫,陈 丽,杨正婷. 鱼腥草中HtbZIP60基因的克隆和生物信息分析
Cloning and Bioinformatic Analysis of the Analysis of HtbZIP60 Gene in Houttuynia cordata thunb[J]. 植物学研究, 2024, 13(01): 63-74. https://doi.org/10.12677/BR.2024.131008

参考文献