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Hans Journal of Medicinal Chemistry
Vol. 10  No. 02 ( 2022 ), Article ID: 51283 , 10 pages
10.12677/HJMCe.2022.102017

银杏叶提取物氯化钠注射液处方工艺研究

刘婕1，张超洋1，谢林峰1，李桂升1，王敬赫1，程耀波2，张文成1，吴泽宇1，惠爱玲1*

1合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥

2邳州恒翔生物制品有限公司，江苏 徐州

收稿日期：2022年3月3日；录用日期：2022年3月19日；发布日期：2022年5月16日

摘要

目的：对银杏叶提取物氯化钠注射液处方进行工艺研究。方法：分析比较银杏叶提取物与市售GBE注射液(金纳多、悦康)的HPLC指纹图谱，以银杏黄酮、萜内酯含量来监控GBE原料及其氯化钠注射液质量。结果：确定处方工艺为GBE用95%乙醇:聚乙二醇400:注射用水(1:1:100)溶解，pH调节至5.0左右，定容分装后于115℃灭菌30分钟。结论：该制剂处方工艺合理可行，初步稳定性良好。

关键词

银杏叶提取物，银杏黄酮，萜内酯，处方工艺

Research on Formulation Process of Ginkgo biloba Extract Sodium Chloride Injection

Jie Liu1, Chaoyang Zhang1, Linfeng Xie1, Guisheng Li1, Jinghe Wang1, Yaobo Cheng2, Wencheng Zhang1, Zeyu Wu1, Ailing Hui1*

1School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei Anhui

2PizhouHengxiang Biological Products Co., Ltd., Xuzhou Jiangsu

Received: Mar. 3rd, 2022; accepted: Mar. 19th, 2022; published: May 16th, 2022

ABSTRACT

Objective: To research on formulation process of Ginkgo biloba extract sodium chloride injection. Methods: HPLC fingerprints of Ginkgo biloba leaf extract and commercial GBE injection (Ginaton and Yuekang) were analyzed and compared, and the quality of GBE raw material and sodium chloride injection was monitored by the contents of Ginkgo biloba flavonoid and terpene lactone. Results: The formula was determined as follows: GBE was dissolved with 95% ethanol:polyethylene glycol 400:water for injection (1:1:100), pH was adjusted to 5.0, and sterilization was performed at 115˚C for 30 min after packaging at constant volume. Conclusion: The formulation process of this preparation is reasonable and feasible, and its initial stability is good.

Keywords:Ginkgo biloba Extract, Ginkgo Flavonoids, Terpene Lactone, Formulation Process

Copyright © 2022 by author(s) and Hans Publishers Inc.

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0).

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

1. 引言

银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract, GBE)制剂一直作为心脑血管疾病治疗和预防的首选植物药 [1]，GBE注射液(市售产品金纳多、悦康通等)在临床被广泛用于改善脑部及周围血流循环障碍，其疗效显著，受到《中国脑血管病防治指南》《国家药物处方集》等多个指南及专家共识的推荐 [2]；GBE有效成分主要为黄酮类、萜内酯类(图1、图2) [3]。

GBE注射液(17.5 mg, 5 mL)在临床应用时，通常以1:10混合比例溶于生理盐水、葡萄糖输液等。溶媒加入GBE注射液或GBE注射液分散于溶媒中，药物形态及密封条件等改变可能促使药物分解、杂质超出限量等，这将大大影响注射液使用效果，也对成品配液稳定性及其使用安全性提出新考验。

Figure 1. Flavonoids from Ginkgo biloba leaves

图1. 银杏叶中的黄酮类化合物

Figure 2. Lactones from Ginkgo biloba leaves

图2. 银杏叶中的内酯类化合物

危华玲等 [4] 研究表明：在25℃条件下，GBE注射液与0.9%氯化钠注射液、5%葡萄糖注射液等5种输液配伍后6 h内基本稳定。于泽芳等 [5] [6] 研究表明：3个不同厂家的GBE注射液与0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液两种溶媒配伍后，各成品输液中的槲皮素、异鼠李素于24 h内含量基本保持不变。对GBE注射液不良反应(ADR)发生时间看出，开始给药半小时内为不良反应高峰期 [7] [8]。2020版中国药典对GBE质量控制指标是黄酮 ≥ 24%，萜内酯 ≥ 6%，银杏酸 ≤ 5 mg/kg，其余70%成分未严格控制 [9]。对于黄酮醇苷含量控制，药典以25%盐酸水解后苷元(槲皮素、山柰素、异鼠李素)总量来折算，不能准确反映GBE原料中黄酮原型成分的真实含量。刘宏等 [10] 通过对9个厂家GBE注射液指纹图谱研究发现：黄酮类、内酯类成分在各样品中均可检测到，但含量差异较大；悦康GBE注射液与金纳多注射液的水溶性成分检出较多，且两者相似度最大；其余产品的水溶性成分(糖类、烷基酚酸类、有机酸类等)检出较少或未检出。因此，一些专家学者呼吁要进一步提高GBE原料标准，并逐步对GBE原料及注射液质量进行一致性评价 [11] [12]。

综上所述，开展GBE氯化钠注射液处方优化及其质量控制研究对于提高GBE注射液质量、减少不良反应发生具有重要参考意义。本研究以银杏黄酮的指纹图谱及银杏黄酮(芦丁、水仙苷、槲皮素、山柰素、异鼠李素)、萜内酯(银杏内酯A、B、C和白果内酯)含量监控GBE原料及其氯化钠注射液质量，逐步优化处方工艺，以期实现GBE氯化钠注射液的质量控制。

2. 仪器和材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪、HH-4数显恒温水浴锅、SHZ-95B型循环水式真空泵、PHS-3C pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)、150T多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)、PWN124ZH/E精密电子天平、RE52CS-1旋转蒸发仪；R1002B旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)。

银杏叶提取物注射液(17.5 mg，5 mL；金纳多，批号HC20181022，台湾济生)；银杏叶提取物注射液(17.5 mg，5 mL；悦康通，批号H20070226，中国北京)；芦丁(批号：T20N11Z131674)、水仙苷(批号：S08A8D33447)、槲皮素(批号：C01J10Y91727)、山奈素(批号：G11A11L110978)、异鼠李素(批号：P14O11L124051) (上海源叶生物科技有限公司)；银杏内酯A (批号：100081-200406)、银杏内酯B (批号：110863-200508)、银杏内酯C (批号：110864-200906)、白果内酯(批号：110865-200605) (中国药品生物制品检定所)；甲醇(色谱级，国药集团化学试剂有限公司)；微孔滤膜(孔径0.22 μm，上海兴亚净化材料厂)；有机系一次性针头过滤器(尼龙，0.45/0.22 μm，津腾)；水系一次性针头过滤器(聚醚砜，0.45/0.22 μm，津腾)；一次性使用无菌注射器(河南曙光汇知康生物科技有限公司)；95%乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲酸等其他常用试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)

3. 方法与结果

3.1. 银杏黄酮HPLC分析方法

3.1.1. 银杏黄酮指纹图谱分析

GBE中银杏黄酮HPLC指纹图谱分析方法 [13]：色谱柱为Eclipse Plus C18柱(150 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)梯度洗脱(0~15 min, 35%~40% A; 15~30 min, 40%~45% A; 30~45 min, 45%~50% A; 45~70 min, 50%~55% A)；流速：0.7 mL/min；柱温：30℃；波长：360 nm。

江苏邳州及南京广润GBE粉末(标识24%黄酮，6%萜内酯) 40 mg用甲醇–水溶解定容至100 mL，过0.45 μm水系滤膜，取20 μL注入HPLC进行指纹图谱检测，如图3所示；金纳多、悦康GBE注射液，取20 μL注入HPLC进行指纹图谱检测，如图4所示。

GBE注射液一般是以银杏叶提取物为原料制成，但不同样品的银杏叶提取物的来源及质量等方面存在差异，尤其是在银杏黄酮的种类及含量方面，通过对GEB原料(江苏邳州、南京广润)以及以国外GEB原料制成的市售GBE注射液(金纳多、悦康通)进行银杏黄酮指纹图谱分析。由图3、图4可知，不同样品的黄酮种类相似，但检出色谱峰的个数和含量存在差异，其中，两种国产GEB原料间的相似度是0.803，有8个共有峰，从属一类，而市售的GBE注射液之间有高相似度，相似度是0.875，存在10个共有峰，它们从属一类。结果表明不同GEB原料银杏黄酮在成分组成上有所不同，可为后续以银杏叶提取物为原料制成的注射液提供质量监控依据。

3.1.2. 色谱分析条件

依据3.1.1所述色谱条件，取芦丁、水仙苷、槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品少许，混标20 μL注入HPLC检测；另取自制GBE氯化钠注射液(制法如3.3.1所述)、水解后的GEB注射液 [14] 20 μL注入HPLC检测，其HPLC叠加图如图5所示。

S2(5)：江苏邳州GBE粉末；S1(5)：南京广润GBE粉末。

Figure 3. Liquid chromatogram overlay of flavonoids in two GBE samples

图3. 两种GBE原料药银杏黄酮液相色谱叠加图

S2(8)：悦康注射液；S2(8)：金纳多注射液。

Figure 4. Liquid chromatogram overlay of flavonoids in two GBE injection samples

图4. 两种市售GBE注射液中银杏黄酮液相色谱叠加图

1.芦丁；2.水仙苷；3.槲皮素；4.山奈素；5.异鼠李素。

Figure 5. Liquid chromatogram overlay of standard flavonoids and GBE-NaCl injection sample

图5. 黄酮对照品与GBE氯化钠注射液样品及水解液液相色谱叠加图

由图5可知，自制GBE氯化钠注射液样品中芦丁、水仙苷、槲皮素相对含量较高，而山奈素、异鼠李素相对含量比较低，水解后的GBE氯化钠注射液主要转化为黄酮苷元槲皮素、山奈素、异鼠李素，在该色谱条件下，自制GBE氯化钠注射液样品、水解后的GEB氯化钠注射液与五种黄酮对照品均能分离完全，这适用于监控GBE氯化钠注射液中黄酮原型成分的真实含量(以芦丁、水仙苷、槲皮素进行定量分析)，以及经盐酸水解的总黄酮醇苷的含量，其中，总黄酮醇苷的含量按照2020版中国药典计算：总黄酮醇苷含量 = (槲皮素含量 + 山柰素含量 + 异鼠李素含量) × 2.51。

3.1.3. 定量分析

精密称取芦丁、水仙苷、槲皮素对照品各1.0 mg、0.6 mg、0.8 mg以70%甲醇定容至10 mL，配制成含有芦丁100 μg/mL、水仙苷60 μg/mL、槲皮素80 μg/mL的储备液，分别精密取储备液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀释到刻度，所有样品过滤膜，分别取20 μL注入HPLC，按照上述色谱分析条件进行检测。以峰面积A (mAU*S)为纵坐标，标品浓度c (μg/mL)为横坐标做定量检测标准曲线，得三种对照品线性回归方程(见表1)。

Table 1. Linear regression equation for quantitative determination of three typical flavonoids

表1. 三种典型黄酮定量检测标准曲线

3.2. 银杏萜内酯HPLC分析方法

3.2.1. 色谱分析条件

定性检测的HPLC分析方法 [15]：色谱柱为Eclipse Plus C18柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流动相为甲醇(A)–水溶液(B)梯度洗脱(0~15 min, 25%~32% A; 15~20 min, 32%~32% A; 20~40 min, 32%~35% A)；流速：1.0 mL/min；漂移管温度：90℃；雾化温度：60℃；柱温：30℃；进样量：10 µL。

银杏内酯A、B、C (GA、GB、GC)及白果内酯(BB)对照品用甲醇稀释，取20 μL注入HPLC进行检测；取制备得到的金纳多、自制GBE氯化钠注射液供试品溶液 [16] 20 μL注入HPLC，以GA、GB、GC、BB为参照物，其HPLC叠加图如图6所示。

1.白果内酯；2.银杏内酯C；3.银杏内酯A；4.银杏内酯B。

Figure 6. Liquid chromatogram overlay of standard terpene lactones and GBE injection sample

图6. 萜内酯对照品、金纳多及自制GBE氯化钠注射液样品液相色谱叠加图

由图6可知，自制GBE注射液样品中主要基质与四个萜内酯对照品分离良好，且该色谱分离条件可用于市售GBE注射液萜内酯的分析鉴定，并适用于后续自制GBE注射液中萜内酯的含量测定。

3.2.2. 定量分析

精密称取银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯对照品各25 mg、25 mg、50 mg、50 mg以甲醇定容至10 mL，配制成含有银杏内酯A 2.5 mg/mL、银杏内酯B 2.5 mg/mL、银杏内酯C 5.0 mg/mL、白果内酯5.0 mg/mL的储备液，分别精密取储备液0.5 mL、1 mL、2 mL、2.5 mL、5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释到刻度，所有样品过滤膜，分别取20 μL注入HPLC，按照上述色谱分析条件进行检测。以峰面积(mAU*S)自然对数Y为纵坐标，对照品浓度(mg/mL)自然对数X为横坐标做定量检测标准曲线，得到四种对照品线性回归方程(见表2)。

Table 2. Standard curve for quantitative analysis of terpene lactones

表2. 四种典型萜内酯定量检测标准曲线

3.3. GBE氯化钠注射液处方研究

3.3.1. 制备流程设计

参考市售产品和相关文献 [17] [18] [19]，GBE氯化钠处方工艺包括GBE增溶配方、pH调节、无菌过滤、灌装及灭菌等步骤，制备流程图如图7所示。市售GBE注射液为5 mL，有效成分GBE 17.5 mg，临床使用以1:10配制输液。结合此规格和临床用法，本研究设计的GBE氯化钠注射液规格为100 mL，有效成分GBE不低于35 mg。

Figure 7. Flow chart of preparation of GBE-NaCl injection

图7. GBE氯化钠注射液制备流程图

3.3.2. 溶媒筛选

GBE中含有萜内酯等脂溶性成分，故溶媒需选用一定比例的醇水混合物 [13]。醇的比例需控制在合理范围，偏高可能会造成溶血、刺激性等不良反应，偏低则萜类内酯等脂溶性成分无法溶解。结合GBE氯化钠注射液的处方规格，溶媒选择时以100 mL溶解约40 mg GBE为宜。

本研究尝试了95%乙醇、聚乙二醇400、山梨醇、丙二醇、吐温20等多种混合溶媒及其比例，综合考虑药物溶解性、安全性等因素，当溶媒为95%乙醇:聚乙二醇400:注射用水(1:1:100)时，GBE溶解情况较好，且20℃放置1~2天后无明显沉淀或小颗粒析出，故采用此溶媒组合进行后续研究。

3.3.3. pH调节

预实验中，将市售悦康通及金纳多分别按1:10比例与0.9%氯化钠注射液混匀，测其pH分别为6.5、6.7，故尝试在5.0~7.0范围内调节pH，分别以5% NaOH溶液调节pH至5.0~5.1、5.5~5.6、6.0~6.1、6.5~6.6，考察其对GBE溶解情况、有效物质含量等影响，以GBE溶解情况、原型黄酮醇苷、总黄酮醇苷、总萜内酯含量(GA + GB + GC + BB)为指标，结果见表3。

Table 3. Effect of different pH on dissolution of GBE and content of effective substance

表3. 不同pH对GBE溶解情况、有效物质含量的影响

由表3可看出，pH值在5.0~7.0范围内对GBE的溶解情况都较好，pH值的不同对于原型黄酮醇苷有一定影响，尤其对于黄酮苷元槲皮素影响比较明显，且随着pH值的增大总萜内酯含量有所变小，但pH值对总黄酮醇苷含量影响不显著。综合考虑各项指标，最终确定pH值调节在5.0左右。

3.3.4. 过滤、杀菌的影响

按工艺处方制成GEB氯化钠注射液，pH值调节在5.0左右，为了选择适应本品的灭菌条件，以及考察处方工艺流程中经0.22 μm滤膜过滤前后对GBE氯化钠注射液有效物质含量的影响，以原型黄酮醇苷、总黄酮醇苷、总萜内酯含量为指标，结果见表4。

Table 4. Effect of filtration and sterilization on effective substance content of GBE-NaCl injection

表4. 过滤、杀菌对GBE氯化钠注射液有效物质含量的影响

由表4可看出，过滤前后对GBE氯化钠注射液中原型黄酮醇苷及总黄酮醇苷含量无明显性变化，但过滤会损失部分内酯，损耗率在5%左右，其损耗在整个处方工艺中属于正常范围内，不同灭菌条件对GBE氯化钠注射液有效物质含量无明显性变化，但从整体上来看，115℃，30 min灭菌条件下的指标要比121℃，15 min灭菌条件下的指标数值要高，且生产成本也较低。因此，在GBE氯化钠注射液的制备过程中，可忽视过滤操作中部分有效物质含量的损失，最终采用115℃灭菌30分钟的灭菌条件。

3.3.5. 处方确定

依据上述对溶媒选择与配比、pH值及灭菌条件等考察，我们确立GBE氯化钠注射液(100 mL:40 mg)的处方工艺，完整处方如表5。具体步骤如下：准确称取处方量的GBE 0.4 g，用10.0 mL 95%乙醇和10.0 mL PEG400初步搅拌溶解；分批次加入一定量60℃~70℃注射用水，持续搅拌10~15分钟；并继续加至近1000 mL，使提取物充分溶解；加入处方量的NaCl 9.0 g、NaHSO3 1.5 g，搅拌使其溶解；用稀NaOH溶液调节pH值至5.0左右，定容至1000 mL；经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌的溶液分装至100 mL注射剂瓶中，于115℃灭菌30分钟，即得GBE氯化钠注射液成品。从最终制成的GBE氯化钠注射液成品中随机选择3瓶测定其有效物质含量，考察该处方工艺是否稳定可行，由表6可看出，该3瓶GBE氯化钠注射液的有效物质含量基本无差别，初步判定该处方工艺稳定。

Table 5. GBE-NaCl injection prescription (10 bottles, 100 mL each)

表5. GBE氯化钠注射液处方(每10瓶，每瓶100 mL)

Table 6. GBE Effective substance content of GBE-NaCl injection

表6. GBE氯化钠注射液有效物质含量

4. 结论

本研究通过分析比较银杏叶提取物与市售GBE注射液(金纳多、悦康)的HPLC指纹图谱，以银杏黄酮(芦丁、水仙苷、槲皮素)、萜内酯(银杏内酯A、B、C和白果内酯)含量来监控GBE原料及其氯化钠注射液质量，所建立的方法真实可靠，能稳定反映出GBE氯化钠注射液中有效物质含量，并以此来逐步优化其处方工艺，确定处方为GBE用95%乙醇:聚乙二醇400:注射用水(1:1:100)溶解，pH调节至5.0左右，定容分装后于115℃灭菌30分钟，且注射液在有效物质含量方面有很好的稳定性。

基金项目

江苏省苏北科技专项(CZ-SZ202030)。

文章引用

刘 婕,张超洋,谢林峰,李桂升,王敬赫,程耀波,张文成,吴泽宇,惠爱玲. 银杏叶提取物氯化钠注射液处方工艺研究
Research on Formulation Process of Ginkgo biloba Extract Sodium Chloride Injection[J]. 药物化学, 2022, 10(02): 180-189. https://doi.org/10.12677/HJMCe.2022.102017

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    20. NOTES

    *通讯作者。

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