 Advances in Analytical Chemistry 分析化学进展, 2012, 2, 15-20 http://dx.doi.org/10.12677/aac.2012.23003 Published Online August 2012 (http://www.hanspub.org/journal/aac.html) The Applied Research of Electrochemical Biosensor Based on Electrodeposited CaCO3-Chitosan Composite Nanomaterials Hongye Zhao, Liyun Qiao, Junping Wei Inner Mongolia Inspection and Testing Institute of Petrochemical Industry, Hohhot Email: 1hongye1@163.com Received: Jun. 21st, 2012; revised: Jul. 4th, 2012; accepted: Jul. 17th, 2012 Abstract: In this paper, a novel electrochemical biosensor was fabricated based on CaCO3-chitosan composite nano- materials, which was characterized by cyclic voltammetry, electrochemical impedance spectroscopy, chronoamperome- try and scanning electron microscopy. The electrochemical behaviors of redox protein (enzyme) were studied in details and the new methods for determination of H2O2 were developed. These studies enriched the study of biological electro- analytical chemistry, expanding the scope of the application of nanocomposites. Keywords: Nanocomposite; Electrodeposition; Protein (Enzyme); Biosensor 基于电沉积碳酸钙–壳聚糖复合纳米材料的电化学生物 传感器的应用研究 赵红叶，乔丽云，魏俊平 内蒙古石油化学工业检验测试所，呼和浩特 Email: 1hongye1@163.com 收稿日期：2012 年6月21 日；修回日期：2012年7月4日；录用日期：2012 年7月17 日 摘 要：本文基于碳酸钙–壳聚糖复合纳米材料构建了电化学生物传感器，采用循环伏安法、电化学阻抗法、 计时安培法及扫描电镜技术对其进行了表征，研究了氧化还原蛋白质(酶)的直接电化学和电催化特性，建立了检 测H2O2的新方法。该研究丰富了生物电分析化学的研究内容，拓展了复合纳米材料的应用范围。 关键词：复合纳米材料；电沉积；蛋白质(酶)；生物传感器 1. 引言 新型性能优越的纳米材料和新颖的生物传感器 制备方法对开发第三代有临床应用价值的生物传感 器具有重要意义。在各种纳米材料中，纳米碳酸钙由 于其具有比表面积大、表面反应活性高等优点被广泛 应用于 H2O2电化学生物传感器的构建[1-4]。Shan[5]等 通过滴涂法将纳米碳酸钙，壳聚糖和牛血红蛋白(Hb) 的混合物修饰在玻碳电极表面成功构建了 H2O2传感 器，实现了 Hb 的直接电子转移并取得了良好的催化 效果。Sun 等[6]采用层层涂布法将 Hb、Nan o-CaCO3 和Nafion 修饰在离子液体碳糊电极表面，研究了 Hb 的直接电子转移和对 H2O2的电催化行为。 一步电沉积法是构建生物传感器新型界面的众 多方法之一，也是目前研究较多、应用较广的一种。 该方法操作简单，并且更容易控制所制备材料的形貌 特征和尺寸大小。目前利用壳聚糖的溶解性随 pH 值 变化而变化的特性同时将纳米材料共同沉积在电极 表面的研究工作还较少。壳聚糖分子结构中带有多个 氨基的特性，使其在一步电沉积法构建电化学生物传 感器领域中备受青睐[7-10]。壳聚糖的 pKa为6.3，当溶 Copyright © 2012 Hanspub 15  基于电沉积碳酸钙–壳聚糖复合纳米材料的电化学生物传感器的应用研究 液的 pH 值小于 6.3 时，氨基呈质子化，壳聚糖为水 溶形态；当向工作电极施加电压，溶液中的水被电解， 电极周围会有微小的氢气气泡产生，而产生的氢气气 泡作为动态的模板可有效的促进纳米材料的形成；由 于氢离子形成氢气离开溶液致使电极周围局部 pH 值 升高接近壳聚糖的 pKa，使壳聚糖溶解度下降，使其 和纳米碳酸钙共同沉淀在电极表面，形成碳酸钙–壳 聚糖复合纳米材料。 本文拟利用新颖的一步电沉积法构建 Hb-chit/ nanoCaCO3-chit/CILE 传感器，研究Hb的直接电化学 和电催化行为，建立检测 H2O2的新方法。 2. 实验部分 2.1. 试剂和仪器 牛血红蛋白(Hb，M.W. 64500，美 国sigma 公司)， 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(EMIMBF4，纯度 ≥ 98.5%，兰州化学物理研究所)，石墨粉(光谱纯，国药 集团化学试剂有限公司)，壳聚糖(Chit，M.W.1 × 106， 脱乙酞度 > 90%，上海源聚生物科技有限责任公司)， 氯化钙和碳酸氢铵(CaCl2，NH4HCO3，天津天大化学 试剂厂)，过氧化氢(w/w，30% ，西安化学试剂厂)， 其它试剂均为分析纯。0.1 mol·L–1 的磷酸盐缓冲溶液 (PBS)作为支持电解质，通过加入 0.1 mol·L−1 NaOH 溶 液或 0.1 mol·L–1 H3PO4溶液来调节溶液的pH 值。测 试溶液均通高纯氮气 15 min 除氧。所有电化学测量均 采用三电极系统：工作电极为自制修饰电极，参比电 极为饱和甘汞电极(SCE) ，辅助电极为铂丝。测量温 度为室温(约25℃ ± 2℃)。 2.2. Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE的构建 2.2.1. 离子液体碳糊电极(CILE)的制备 不同质量比的石墨粉、离子液体和液体石蜡混 合，制备所得的离子液体碳糊电极的性能有所不同。 当三者质量比太大时，石墨粉颗粒之间粘接性较差， 容易粉碎和脱落；如果质量比太小，碳糊的机械强度 太小且难以成型。本实验最终选用以下的配比：称取 3.2 g石墨粉，量取 300 μL离子液体 1-乙基-3-甲基咪 唑四氟硼酸盐(EMIMBF4)和700 μL液体石蜡于玛瑙 研钵中混合均匀，将混合均匀的碳糊填入 PVC 管中 约1 cm(Φ = 3 mm)，压实，尾部插铜线作为导线；在 称量纸上打磨成镜面，即制得CILE。 2.2.2. 壳聚糖溶液的配制 1.0 wt%壳聚糖溶液配制：配制 100 mL 0.5 wt.% 的醋酸水溶液，加热至微沸，准确称取 1 g chit，将其 缓慢加入并不断搅拌使其完全溶解，用 5 mol·L−1 NaOH 溶液调节其 pH 为5.0 左右，经砂芯漏斗过滤后 置于 4℃冰箱中备用。 2.2.3. Hb-chit/nanoCaCO3-chit复合膜修饰CILE 的构建 取一定量的 CaCl2和NH4HCO3溶解在 10 mL二 次蒸馏水中，使[Ca2+]为9 mmol·L–1，[CO3 2–]为18 mmol·L–1。用 1 mol·L–1 HCl 将pH 值调节至 5.0 左右， 然后向该溶液中加入配制好的壳聚糖溶液，使其浓度 为0.5 mg·mL–1，再次调节 pH 值于5.0 左右，然后将 新制备的 CILE 浸入该溶液中于–1.5 V(vs.SCE)电位下 电沉积 300 s。在该电位下，H+被还原成 H2，该反应 导致电极表面局部区域的pH 值迅速增大，当 pH 值 达到 6.3，壳聚糖达到溶点，同时与 CaCO3共同析出 在电极表面，由此即制得 CaCO3-chit 复合纳米材料(如 图1所示)。将所制备的电极用二次蒸馏水冲洗晾干之 后，将 5 µL 5 mg·mL–1 Hb 和0.5 mg·mL–1 壳聚糖的混 合溶液滴涂于nanoCaCO3-chit/CILE 表面，于4℃冰箱 放置 6 h 得到Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE。 Figure 1. The principle diagram of co-electrodeposition CaCO3-chit composite nanomaterials 图1. 电化学共沉积 CaCO3-chit 复合纳米材料的原理示意图 Copyright © 2012 Hanspub 16  基于电沉积碳酸钙–壳聚糖复合纳米材料的电化学生物传感器的应用研究 3. 结果与讨论 3.1. nanoCaCO3-chit复合纳米材料的表面形貌 用扫描电子显微镜(SEM)对电极表面 CaCO3-chit 复合纳米材料的形貌进行了研究(图2)。由图可见，制 备的复合纳米材料为球形颗粒，粒子大小约为100~ 200 nm，形状规则，排列有序；通过该法制备的复合 纳米材料形貌不同于其他方法制备所得，且粒径更 小，颗粒分布更均匀[11-13]。本法制备得到的复合纳米 材料与其他方法相比所具有的不同形貌，可能是由于 在电沉积过程中粒子的形成速度不同而造成的。 3.2. 不同修饰电极的电化学阻抗 电化学阻抗谱(EIS)可以为电极表面修饰前后阻 抗的变化提供信息[14-16]。图 3分别为裸 CILE、Hb-chit/ CILE 和Hb-chit/nanoCaCO 3-chit/CILE 在1 mmol·L–1 Figure 2. SEM images of spherical structures of CaCO3-chit com- posite nanomaterials prepared by the co-electrodeposition with (a) Low magnification; (b) High magnification 图2. 通过电沉积法制备所得CaCO3-chit 复合纳米材料的SEM 图 (a) 低倍放大图；(b) 高倍放大图 Figure 3. Electrochemical impedance spectroscopy for (a) Bare CILE; (b) Hb-chi/CILE; (c) Hb-chi/nanoCaCO3-chi/CILE in a solution of 1 mmol·L−1 Fe(CN)63−/4− + 0.1 mol·L−1 KCl as the sup- porting electrolyte; The frequencies swept from 105 to 10−2 Hz 图3. 在1 mmol·L−1 Fe(CN)63−/4− + 0.1 mol·L−1 KCl 溶液中不同修 饰电极的 EIS 图 (a) CILE；(b) Hb-chit/CILE；(c) Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE；频率范围：105~10−2 Hz Fe(CN)6 3−/4− + 0.1 mol·L–1 KCl 溶液中的电化学阻抗 图。依据 Randle 和Ershler理论[17]，对谱图进行拟合(如 图3所示的等效电路)，计算得其电子传递阻抗(Ret) 分别为 303.5 Ω，540.5 Ω和1166 Ω。表明 chit，nano CaCO3-chit 和Hb被成功的固定在了 CILE 表面，Ret 的逐渐增大是由于壳聚糖，nanoCaCO3和Hb 三者的 导电性能差而抑制了Fe(CN)6 3-/4-电对在电极表面的电 子传递。 3.3. Hb在Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE上 的直接电化学 如图 4所示，以 Hb-chit/n anoCaCO3-chit/CILE(曲 线d)为工作电极时，可观察到一对峰形良好、准可逆 的氧化还原峰，其峰电位分别为Epa = –0.228 V和Epc = –0.362 V；式量电位由方程 0 pa pc 12EEE 计算得 –0.295 V，与已报道文献值接近[18,19]。然而，在裸 CILE(曲线 a)，nanoCaCO3-chit/CILE(曲线 b)和chit/ nanoCaCO3-chit/CILE(曲线 e)上没有氧化还原峰出现； 显然，Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE 的电化学响应是 由于 Hb 的活性中心进行了氧化还原反应。Hb-chit/ CILE(曲线c)上的 Hb 也出现了一对氧化还原峰，不过 峰电流远远小于 Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE。这说 明nanoCaCO3-chit 能给固定在上面的 Hb 提供一个良 好的微环境并促进 Hb与CILE 之间的电子传递。这 可能是由于 nanoCaCO3-chit 为血红蛋白分子提供了三 维的立体取向平台进而使其可与电子供体或电子受 Figure 4. CVs of (a) CILE; (b) nanoCaCO3-chi/CILE; (c) Hb-chi/CILE; and (d) Hb-chi/nanoCaCO3-chi/CILE; (e) chi/nanoCaCO3-chi/CILE in 0.1 mol·L−1 pH 7.0 PBS at scan rate of 0.2 V·s−1 图4. 在0.1 mol·L−1 pH 7.0 PBS 中不同修饰电极的循环伏安图 (a) CILE；(b) nanoCaCO3-chit/CILE；(c) Hb-chit/CILE；(d) Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE 和(e) chit/nanoCaCO3-chit/CILE； 扫速：0.2 V·s−1 Copyright © 2012 Hanspub 17  基于电沉积碳酸钙–壳聚糖复合纳米材料的电化学生物传感器的应用研究 体之间进行电子传递，并有效促进了这一电子转移过 程。 3.4. 扫速的影响 考察了在 pH = 7.0时0.1 mol·L−1 PBS 缓冲溶液中 于不同扫速下，Hb 在Hb-chit/nanoCaCO3-ch it/CILE 上的循环伏安行为(图5(A))。由图可见，在–0.8~0.2 V 的电位范围内，当以 Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE 为 工作电极时，可观察到一对峰形良好、准可逆的氧化 还原峰，随着扫速的增加，Hb 的氧化、还 原峰电 流 都依次增大，且峰电流与扫速呈良好的线性关系(图 5(B))，线性回归方程分别为：Ipa(μA) = 1.29 – 32.41ν (V·s–1)，r = –0.9988，Ipc (μA) = 5.54 + 44.82ν (V·s–1)， r = 0.9981，说明 Hb 的电极过程是表面吸附控制过程。 根据公式(1)可求得电极表面具有电活性的Hb 的 表面覆盖度(Γ*)： 22 * pn FA4RTnFQ4RTI (1) s p lglg 11lg lgRT nF1nF2.3RT k vE (2) 式中 Q为积分电量，n为电子转移数，A为电极面积， F为法拉第常数。通过对 Hb Fe(III)还原的阴极峰面积 进行积分，可求得修饰电极的表面覆盖浓度(Γ*)为 1.43 × 10–9 mol·cm–2。该值比单层 Hb 吸附至裸电极表 面的理论值大(1.89 × 10–11 mol·cm–2)[20]，说明 Hb-chit/ nanoCaCO3-chit/CILE 具有较多的表面活性位点。根据 Figure 5. (A) CVs of Hb-chi/nanoCaCO3-chi/CILE in 0.1 mol·L−1 pH 7.0 PBS at different scan rates. Scan rate (from a to o): 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 and 1.5 V·s−1, re- spectively; (B) The plot of Ip vs v 图5. (A) 在0.1 mol·L−1 PBS pH 7.0 PBS中，不同扫速下 Hb 在 Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE上的循环伏安图(由a到o)：0.1， 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4 和1.5 V·s–1；(B) Ip vs v Ip-v的斜率可计算得到电子转移数n为1.03。根据 Laviron[21](公式 2)关于电极表面反应异相动力学常数 的计算方法可以得到Hb 电子传递速率常数(ks)为1.98 s–1，这一数值小于Hb 固定在gellan gum/BMIMBF4 复合膜上的 5.66 ± 0.2 s–1[22]，但远远大于文献报道的 将Hb 固定在碳纳米管上的0.49 s–1[23]。 3.5. pH值的影响 考察了溶液 pH 值变化，对 Hb-chit/nanoCaCO3- chit/CILE 的循环伏安行为的影响(图6(a))。随着溶液 pH 值的增加，该修饰电极的式量电位向负方向移动， 而且在 pH 4.91~9.18 范围内均得到了峰形良好、几乎 对称的循环伏安曲线。电位与pH值呈良好的线性关 系(图6(b))：E0' = 0.1012 – 0.0615pH(n = 6，r = 0.9988)。 其中，斜率为−61.5 mV·pH–1，与一电子一质子反应的 理论值(−59.0 mV pH–1)接近，表明 Hb 发生电子传递 的同时，还伴随着等量质子的转移；Hb 的 氧化还 原 过程可简单的表示如下[24,25]： Hb heme Fe (III) + H+ + e− ↔ Hb heme Fe (II) pH 值对固定在Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE 中 的Hb 的氧化还原峰电流具有轻微的影响(图6(c))，由 于中性的 pH 值接近生理环境，并能有效的保持蛋白 质的生物活性，所以该实验中选择 pH 7.0作为最优 pH 以达到最大的灵敏度。另外，由于 chit 的pKa为 6.3，当溶液的 pH 值 > 6.3时，chit 为非水溶形态， 可以保证 Hb-chit/nanoCaCO3-chit 复合物很稳定的修 饰在电极表面不会脱落；当溶液的pH < 5.0，其峰形 Figure 6. (a) CVs of Hb-chi/nanoCaCO3-chi/CILE in different pH values of 4.91, 5.29, 6.24, 7.17, 8.04 and 9.18; (b) Plot of E0' vs pH value; (c) Plot of I vs pH values. Scan rate: 0.2 V·s−1 图6. (a) Hb 在Hb-chi/nanoCaCO3-chi/CILE 上在不同 pH 溶液 (4.91，5.29，6.24，7.17，8.04 和9.18)中的循环伏安图；(b) E0' vs. pH； (c) I vs pH。扫速：0.2 V·s−1 Copyright © 2012 Hanspub 18  基于电沉积碳酸钙–壳聚糖复合纳米材料的电化学生物传感器的应用研究 开始变差且峰电位差也不断增大。 3.6. Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE上Hb 对H2O2的电催化行为 为了考察 Hb-chit/nanoCaCO 3-chit/CILE 电极上 Hb 的电催化活性，采用计时安培法研究了 Hb 对H2O2的 电催化行为(图7(a))。当依次向 不断 搅 拌的除氧后 的 PBS 缓冲溶液(pH 7.0)中加入不同体积的H2O2(0.01 mol·L –1)后，可以观察到 Hb的催化还原电流随加入H2O2 浓度的增大呈阶梯状增加，达到 95%的稳定电流响应的 时间小于 3 s，表明 Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE 电极 对H2O2的响应速度很快。Hb 的催化电流与 H2O2浓度 呈线性关系(图7(b))，其线性范围为 5.0 × 10–6 mol·L–1~ 1.3 × 10–3 mol·L–1，其线性回归方程为 Iss = 10.83 + 5.1 × 10–3 (n = 52，r = 0.9994)，检出限为 1.6 × 10–6 mol·L–1 (S/N = 3)。从其线性斜率5.15 × 10–3 μA·μM−1， 可得其灵敏度为 0.16 A·M–1·cm–2。该值远远大于文献报 道的 0.06 A·M–1·cm–2 和0.045 A·M–1·cm–2[26,27]，略小于 0.6 A·M–1·cm–2和0.234 A·M–1·cm–2[28,29]。该修饰电极高 的灵敏度是由于 nanoCaCO3-chit 复合纳米材料为血红 蛋白内部的活性中心提供了优良的生物环境使其能够 进行氧化还原反应。 22 HO C Lineweaver-Burk 方程[30]可用于求解用于评价酶 生物活性的特征动力学参数 app M K 值： app ssmax M max 11 I IKIC 式中，Iss 为稳态电流；Imax 为最大稳态电流；C为底 物浓度。当电流受酶促反应速率控制时，在一定范围 内，采用双倒数法(ss 1~1 I C)作图将得到一条直线 (图7(c))，从其斜率和截距可求得 Hb催化还原 H2O2 的app M K 值为 8.17 × 10−4 mol· L−1，与文献所报道的值相 比，此值要低于 Hb 固定在 SP sephadex 膜中的 1.90 × 10-3 mol·L−1[31]和Chitt-Aus/cys 膜中的1.40 × 10−3 mol·L −1[32]，表明 nanoCaCO3-chit 复合膜能够保持 Hb 高的生物活性，对 H2O2表现出较强的亲和力。 3.7. 传感器的稳定性及重复性 将Hb-chit/nanoCaCO3-chit/CILE 于0.1 mol·L−1 PBS (pH 7.0)的缓冲溶液中以 0.1 V·s−1连续扫描 50 圈，氧 化还原峰电流扫描前后相比几乎没发生变化，表明所 Figure 7. (a) Amperometric response of Hb at the Hb-ch erent a 图7. (a3- chit vs 在相同 PBS 缓冲溶液 ，用同批构建的 6支Hb- chit/ nanoCaCO3-chit/CILE 对1 × 10−3 mol· 4. 结论 本文采用一步电沉积法，成功地制备出了结构新 颖的 i/nanoCaCO3-chi/CILE when successive added diff mounts of H2O2 into 20 mL stirring PBS (pH 7.0) at the potential of −0.4 V; (b) Ip vs HO 22 C; (c) I−1 vs HO 22 -1 C ) 连续加入不同浓度 2时Hb-chitH2O/nanoCaCO /CILE 上Hb 的计时安培电流响应；(b) Ip vs HO 22 C；(c) I−1 HO 22 -1 C；溶液：20 mL 0.1 mol·L−1 PBS (pH 7.0)；电位 V (vs SCE) ：−0.4 中 nanoCaCO3-chit/CILE 对1 × 10−3 mol·L−1 H2O2进 行测定，其电流响应的 RSD为4.3%，表明所构建的 传感器重复性良好。 用同一支 Hb-chit/ L−1 H2O2连续平行测定14 次，每天测定一次，其 电流响应的 RSD 为3.9%，表明所构建的传感器重复 性良好。 nanoCaCO3-chit 复合纳米材料，并构建了Hb- chit/nanoCaCO3-chit/CILE。研究表明，在修饰电极上， Hb 发生了快速直接电子转移，且对 H2O2表现出良好 的电催化作用、较高的检测灵敏度。这一方面可能是 因为通过一步电沉积法所制备的nanoCaCO 3的粒径 更小，比表面积大，分布均匀，为 Hb提供了更多的 活性位点，促进其与电极之间的电子传递；另一方面 可能是因为 nanoCaCO3-chit 复合纳米材料具有良好的 生物相容性使Hb能够很好的保持其对 H2O2催化还原 的生物活性。该研究为电化学生物传感器的构建提供 了一种新途径；所制备的 nanoCaCO3-chit 复合纳米材 料不仅可以用于生物传感器的研发，而且有望用于药 物筛选、先进材料和生物电子等领域。随着材料科学 的发展和新材料的涌现，不同学科交叉与融合的增 强，特别是传感器设计理念和技术的进步，电化学生构建的传感器稳定性良好。 Copyright © 2012 Hanspub 19  基于电沉积碳酸钙–壳聚糖复合纳米材料的电化学生物传感器的应用研究 Copyright © 2012 Hanspub 20 参考文献 (References) G. L. Radu. Laccase-MWCNT- g, E. Wang. Direct electron transfer between cytochrome irect electrochemistry of . , H. G. Xue and S. Cosnier. Direct electro- ctrochemistry ression of the linear potential sweep , S. H. Chen and N. Q. Jia. e Electroactive myoglobin o- A. Puganova, I. A. Budashov, I. N. Ku- D. Compagnone, G. Palleschi and A. ryakin, E. K. Elena and Lo. Gorton. Amperometric i and D. Moscone. Prussian blue n. Rotating ring-disk enzyme electrode an, H. Y. Wang, S. Sun, D. X. Zhu, G. Wagner and G. X. J. Xu and H. Y. Chen. Direct electrochem- 物传感器的研究与应用必将在疾病诊断、环境污染物 在线监测、食品安全和卫生保健等诸多方面发挥重要 作用。 [1] M. Diaconu, S. C. Litescu and chitosan biosensor—A new tool for total polyphenolic content evaluation from in vitro cultivated plants. Sensors and Actuators B, 2010, 145(2): 800-806. [2] F. Li, Z. Wang, W. Chen and S. S. Zhang. A simple strategy for one-step construction of bienzyme biosensor by in-situ forma- tion of biocomposite film through electrodeposition. Biosensors and Bioelectronics, 2009, 24(10): 3030-3035. [3] J. M. Gong, L. Y. Wang, K. Zhao and D. D. Song. One-step fabrication of chitosan-hematite nanotubes composite film and its biosensing for hydrogen peroxide. Electrochemistry Commu- nications, 2008, 10(1): 123-126. [4] X. L. Luo, J. J. Xu, Y. Du and H. Y. Chen. A glucose biosensor based on chitosan-glucose oxidase-gold nanoparticles biocom- posite formed by one-step electrodeposition. Analytical Bio- chemistry, 2004, 334(2): 284-289. [5] D. Shan, S. X. Wang, H. G. Xue and S. Cosnier. Direct electro- chemistry and electrocatalysis of hemoglobin entrapped in com- posite matrix based on chitosan and CaCO3 nanoparticles. Elec- trochemistry Communications, 2007, 9: 529-534. [6] W. Sun, R. F. Gao and K. Jiao. Electrochemistry and electro- catalysis of hemoglobin in Nafion/nano-CaCO f 3ilm on a new ionic liquid BPPF6 modified carbon paste electrode. The Journal of Physical Chemistry B, 2007, 111(17): 4560-4567. [7] Y. Du, X. L. Luo, J. J. Xu and H. Y. Chen. A simple method to fabricate a chitosan-gold nanoparticles film and its application in glucose biosensor. Bioelectrochemistry, 2007, 70(2): 342-347. [8] J. D. Qiu, R. Wang, R. P. Liang and X. H. Xia. Electrochemi- cally deposited nanocomposite film of CS-Fc/Au NPs/GO fo xr glucose biosensor application. Biosensors and Bioelectronics, 2009, 24(4): 2920-2925. [9] Y. H. Bai, H. Zhang, J. J. Xu and H. Y. Chen. Relationship be- tween nanostructure and electrochemical/biosensing properties of MnO2 nanomaterials for H2O2/Choline. Journal of Physical Chemistry C, 2008, 112(48): 18984-18990. [10] S. George, K. Lee. Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin in nafion/carbon nanochip film on glassy carbon electrode. Journal of Physical Chemistry B, 2009, 113(47): 15445- 15454. [11] C. Y. Wang, C. Y. He, Z. Tong, X. X. Liu, B. Y. Ren and F. Zeng. Combination of adsorption by porous CaCO3 microparticles and encapsulation by polyelectrolyte multilayer films for sustained drug delivery. International Journal of Pharmaceutics, 2006, 308(1-2): 160-167. [12] W. Y. Cai, Q. Xu, X. N. Zhao, J. J. Zhu and H. Y. Chen. Porous gold-nanoparticle-CaCO3 hybrid material: Preparation, charac- terization, and application for horseradish peroxidase assembly and direct electrochemistry. Chemistry of Materials, 2006, 18: 279- 284. [13] D. S. Tsekova, B. Escuder and J. F. Miravet. Solid-state poly- morphic transition and solvent-free self-assembly in the growth of organic crystalline microfibers. Crystal Growth & Design, 2008, 8(1): 11-13. [14] Z. Dai, H. Bai and M. Hong. A novel nitrite biosensor based on the direct electron transfer of hemoglobin immobilized on CdS hollow nanospheres. Biosensors and Bioelectronics, 2008, 23(12): 1869-1873. [15] J. Feng, G. Zhao and J. Xu. Direct electrochemistry and electro- catalysis of heme proteins immobilized on gold nanoparticles stabilized by chitosan. Analytical Biochemistry, 2005, 342(2): 280- 286. [16] L. Wan C and a gold nanoparticles modified electrode. Electrochemistry Communications, 2004, 6(1): 49-54. [17] M. K. Wang, Y. Shen and Y. Liu. D microperoxidase 11 using carbon nanotube modified electrodes. Journal of Electroanalytical Chemistry, 2005, 578(1): 121-127. [18] W. Sun, R. F. Gao, X. Q. Li, D. D. Wang, M. X. Yang and K Jiao. Fabrication and electrochemical behavior of hemoglobin modified carbon ionic liquid electrode. Electroanalysis, 2008, 20(10): 1048-1054. [19] D. Shan, S. X. Wang chemistry and electrocatalysis of hemoglobin entrapped in com- posite matrix based on chitosan and CaCO3 nanoparticles. Elec- trochemistry Communications, 2007, 9: 529-534. [20] Y. H. Zhang, X. Chen and W. S. Yang. Direct ele and electrocatalysis of myoglobin immobilized in zirconium phosphate nanosheets film. Sensors and Actuators, B: Chemical, 2008, B130(2): 682-688. [21] E. Laviron. General exp voltammogram in the case of diffusionless electrochemical sys- tems. Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Elec- trochemistry, 1979, 101(1): 19-28. [22] Y. L. Wen, X. D. Yang, G. H. Hu Direct electrochemistry and biocatalytic activity of hemoglobin entrapped into gellan gum and room temperature ionic liquid composite system. Electrochimica Acta, 2008, 54(2): 744-748. [23] Y. D. Zhao, Y. H. Bi, W. D. Zhang and Q. M. Luo. The interfac behavior of hemoglobin at carbon nanotube and the detection for H2O2. Talanta, 2005, 65(2): 489-494. [24] H. Y. Ma, N. F. Hu and J. F. Rusling. films grown layer-by-layer with poly(styrenesulfonate) on pyro- lytic graphite electrodes. Langmuir, 2000, 16(11): 4969-4975. [25] W. Sun, R. F. Gao and K. Jiao. Electrochemistry and electr catalysis of a Nafion/nano-CaCO3/Hb film modified carbon ionic liquid electrode using BMIMPF6 as binder. Electroanalysis, 2007, 19(13): 1368-1374. [26] A. A. Karyakin, E. rochkin, E. E. Karyakina, V. A. Levchenko, V. N. Matveyenko and S. D. Varfolomeyev. Prussian blue based nanoelectrode ar- rays for H2O2 detection. Analytical Chemistry. Analytical Chemis- try, 2004, 76(2): 474-478. [27] D. Moscone, D. D’Ottavi, Amine. Construction and analytical characterization of Prussian blue-based carbon paste electrodes and their assembly as oxi- dase enzyme sensors. Analytical Chemistry, 2001, 73(11): 2529- 2535. [28] A. A. Ka biosensor for glutamate using Prussian blue-based “artificial per- oxidase” as a transducer for hydrogen peroxide. Analytical Chem- istry, 2000, 72(7): 1720-1723. [29] F. Ricci, A. Amine, G. Pallesch based screen printed biosensors with improved characteristics of long-term lifetime and pH stability. Biosensors & Bioelectronics, 2003, 18(2-3): 165-174. [30] R. A. Kamin, G. S. Wilso for biocatalysis kinetic studies and characterization of the im- mobilized enzyme layer. Analytical Chemistry, 1980, 52(8): 1198- 2005. [31] C. H. F Li. Electron-transfer reactivity and enzymatic activity of hemo- globin in a SP sephadex membrane. Analytical Chemistry, 2001, 73(13): 2850-2854. [32] J. J. Feng, G. Zhao, J. istry and electrocatalysis of heme proteins immobilized on gold nanoparticles stabilized by chitosan. Analytical Biochemistry, 2005, 342(2): 280-286. |