 International Journal of Psychiatry and Neurology 国际神经精神科学杂志, 2012, 1, 17-21 http://dx.doi.org/10.12677/ijpn.2012.13005 Published Online August 2012 (http://www.hanspub.org/journal/ijpn.html) The Latest Application Progress of Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells (hUC-MSCs) in Neurological Diseases Deshuang Zhang, Juan Chen* Department of Neonatology, West China Second University Hospital, Chengdu Email: *chenjuan2000@163.com Received: Jun. 25th, 2012; revised: Jul. 5th, 2012; accepted: Jul. 12th, 2012 Abstract: The mesenchymal stem cell is rich in human umbilical cord, compared with MSCs of other sources, hUC-MSCs have major advantages such as richer source, easier collection freedom, shorter doubling time, lower im- munogenicity, longer-term survival after transplantation, no ethical implications and so on. In recent years, the investi- gation of hUC-MSCs has been growing. In appropriate circumstances, hUC-MSCs can differentiate into neuron-like cells, when transplanted into different animal models of neurological diseases can promote the recovery of neural func- tion. Now, we will review the latest application progress of hUC-MSCs in Neurological Diseases. Keywords: Human; Umbilical Cord; Mesenchymal Stem Cells; Transplantation; Nervous System Diseases 人脐带间充质干细胞移植在神经系统疾病中的新进展 张德双，陈 娟* 四川大学华西第二医院新生儿科，成都 Email: *chenjuan2000@163.com 收稿日期：2012 年6月25 日；修回日期：2012年7月5日；录用日期：2012年7月12日 摘 要：人脐带组织富含间充质干细胞(MSCs)，与其他来源的MSCs 相比，具有来源丰富、容易提取、倍增时 间短、免疫原性低、移植后长期存活、不涉及伦理问题等多种优点，近年来对其研究越来越多。在适宜的环境 下，人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)可以分化为神经样细胞，移植于多种神经系统疾病动物模型后均可促进其 神经功能恢复，现就此方面的最新研究及应用进展予以综述。 关键词：人；脐带；间充质干细胞；移植；神经系统疾病 1. 引言 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是 一类具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细 胞，主要来源于骨髓、脂肪、脐带、脐血等，其中人 脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mes- enchymal stem cells, hUC-MSCs)分离成功率高、体外能 够大量扩增，越来越受到关注。很多中枢神经系统疾 病表现为认知与运动功能渐进性恶化最终导致长期劳 动力丧失，为长期困扰医学界的难题。自 2003 年 Mitchell 等[1]首次从脐带中成功分离出基质细胞并证 实其能向神经样细胞分化后，hUC-MSCs 移植在神经 系统疾病中的应用逐渐成为医学界研究的焦点。 2. hUC-MSCs的来源及分离方法 2.1. hUC-MSCs的来源 *通讯作者。 脐带为孕期胎儿与母亲之间的索状连接组织，外 Copyright © 2012 Hanspub 17  人脐带间充质干细胞移植在神经系统疾病中的新进展 被羊膜，内由两条脐动脉与一条脐静脉构成，血管周 围被粘蛋白样组织即 Wharton’s胶所包裹。脐带胶、 脐静脉血管内皮下及脐血管周围均富含 MSCs。 2.2. hUC-MSCs的分离培养 目前，hUC-MSCs 的分离培养尚未有标准方法。 常用方法有组织块贴壁法[1]、酶消化法[2-4]以及两种方 法的结合[5]。在无菌条件下，将手术台上采集的脐带 浸入含青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 ug/ml)的PBS 缓冲液中，4℃保存，48 h内处理。剔除血管、洗净 残血，于平皿中，用解剖刀将脐带分割成 1.5 cm长的 小段，然后用剪刀剪碎成为1~2 mm3的组织块，先后 经胶原酶Ⅳ(1 g/L)和胰酶(2.5 g/L)消化处理，细胞筛过 滤、离心、PBS 洗涤。将洗涤后的细胞接种于 90 mm 细胞培养皿上，加入 10 ml 培养液(DMEM/F12 + 10% 胎牛血清)，置于 37℃、体积分数 5% CO2、饱和湿度 的细胞培养箱中培养，每 3~4 天半量换液，去掉未贴 壁细胞，直到细胞汇合度达70%左右进行传代。传代 消化时，用 0.05%胰酶/EDTA 处理，收集细胞，离心 后以 1 × 104/cm2的密度进行传代。传代培养过程中， 每3天全量换液，直至贴壁细胞达到 90%汇合度。 3. hUC-MSCs的生物学特性 根据国际细胞治疗协会制定的最低标准，MSCs 需具备以下条件：1) MSCs 在标准培养条件下呈贴壁 生长；2) MSCs表达CD105、CD73 和CD90，不表 达CD45、CD34、CD14 或CD11b、CD19 或CD79a 及HLA-DR 表面分子；3) MSCs 在体外至少能向成骨 细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。hUC-MCSs 是介于 胚胎干细胞与成体干细胞之间的一类多潜能干细胞， 高表达整合素及粘附分子CD29、CD44 、CD90、CD95 以及常用的 MSCs 标志物 CD73、CD105；hUMSCs 还表达具有抑制免疫作用的HLA-ABC 和HLA-G，以 及胚胎干细胞标志物 Tra-1-60、Tra-1-81、SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1)、SSEA-4、Oct-4、 碱性磷酸酶 ALP 和MSCs 骨架标志物平滑肌肌动蛋白 及波型蛋白。hUC-MCSs 不表达造血细胞标志物 CD34、CD45 、CD14、HLA-DR 和CD133 及内皮细 胞标志物 CD31、vWF，也不表达或低表达移植免疫 排斥相关标志物 CD80、CD86、CD40。hUC-MCSs 在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制状态，并抑制 T细 胞的增殖，异体移植该细胞可产生免疫耐受性，因此 异基因移植不会发生免疫排斥反应。 4. hUC-MSCs向神经细胞的分化潜能 hUC-MSCs 在特定培养条件下可被诱导分化为神 经样细胞。多种诱导方案均可成功地将 hUC-MSCs 诱 导分化为神经元及胶质细胞。Mitchell 等[1]首先将脐带 胶基质细胞以碱性成纤维细胞生长因子(basic fibro- blast growth factor, bFGF)预处理过夜，再通过 2%二甲 基亚砜、200 µM丁基羟基茴香醚与 2%胎牛血清进行 诱导，5 h 后再经 25 mM 氯化钾、2 mM 丙戊酸、10 µM 毛喉萜、1 μM的氢化可的松及 5 µg/ml胰岛素进行诱 导，结果发现大部分细胞高水平表达神经元标志物 β-III 型微管蛋白和神经微丝。Ma 等[6]将从脐带胶分离 出的 MSCs 先以bFGF 预处理 24 h后，然后再以丹参 或β-巯基乙醇进行诱导，最后以 4%多聚甲醛固定处 理，经以上不同方法诱导处理 1~5 h后，细胞形态发 生明显变化，细胞萎缩、变小并形成突起，细胞逐渐 变成球形、星状或长条形；并表达巢蛋白、β-III 型微 管蛋白、神经微丝和胶质纤维酸性蛋白。Fu 等[7]通过 神经元条件培养基(neuronal conditioned medium, NCM) 对hUC-MSCs 进行诱导，第 3天时可见细胞发生形态 学改变并表达神经元抗核抗体和神经微丝。Kadam 等 [8]同样以 NCM 进行诱导培养后的细胞可使其表达神 经元特异性核蛋白 NeuN 及微管相关蛋白Map 2。 hUC-MSCs除能分化为神经元及胶质细胞以外， 还可向特定的神经元细胞分化。Fu 等[9]通过神经元条 件培养基、音猬蛋白和成纤维细胞生长因子-8，成功 地将 hUC-MSCs 诱导分化为表达酪氨酸羟化酶并分 泌多巴胺的多巴胺能神经元。Weiss 等[10]将hUC-MSCs 移植治疗帕金森病大鼠模型时发现，hUC-MSCs 除能 分化为酪氨酸羟化酶阳性的多巴胺能神经元，尚可表 达酪氨酸羟化酶阳性的胆碱能神经元。 5. hUC-MSCs的治疗流程 1) 脐带采集： 签署知情同意书，取健康足月新生儿脐带约 10 cm； 2) hUC-MSCs 的分离培养、纯化； 3) hUC-MSCs 扩增及鉴定： 根据 hUC-MSCs 的免疫表型，运用流式细胞术对 Copyright © 2012 Hanspub 18  人脐带间充质干细胞移植在神经系统疾病中的新进展 分离、扩增细胞进行鉴定； 4) hUC-MSCs 移植治疗神经系统疾病： hUC-MSCs可于体外诱导分化为神经干细胞或直 接移植治疗神经系统疾病动物模型或患者，通过减少 凋亡、抑制炎症、血管重建、细胞替代等作用发挥形 态与功能修复。 6. hUC-MSCs移植在神经系统疾病中 的应用 人们对 hUC-MSCs 的认识较其他来源的 MSCs相 对较晚，hUC-MSCs 移植在神经系统疾病中的应用目 前主要处于不同疾病动物模型的实验研究阶段。 6.1. 帕金森氏病 帕金森氏病是以纹状体多巴胺功能渐进性丧失 为特征的一种神经退行性疾病，目前尚无根治性治疗 措施。然而，hUC-MSCs 移植疗法为其带来了新希望。 Fu 等[9]将hUC-MSCs 移植到 6-羟基多巴胺诱发的帕金 森病大鼠模型的纹状体内，发现表达人特异性核抗原 的酪氨酸羟化酶阳性细胞可在移植部位至少存活 4个 月，并能向移植部位的头、尾两侧迁移约 1.4 mm，苯 丙胺诱发的大鼠转圈行为也得到了显著改善。Weiss 等[10]发现，细胞移植后帕金森病大鼠的黑质和腹侧被 盖区内酪氨酸阳性细胞数目与大鼠的行为学改善呈 正相关，并推测移植细胞产生的胶质细胞源性神经营 养因子 GDNF 和纤维母细胞生长因子 FGF 对多巴胺 能神经元的营养作用可能是其促进神经功能恢复的 主要机制。 邱云等[11]采用脐带 MSCs 移植治疗了 8例帕金森 病患者，植入1月后发现，患者的震颤、强直有了明 显改善，但是运动迟缓、姿势不稳等临床症状无明显 改善，8例患者均未出现移植物抗宿主病。结果提示 脐带间充质干细胞移植可以一定程度地改善帕金森 病患者的临床症状，提高患者生活质量。 6.2. 脊髓损伤 脊髓损伤是基于轴索变性、神经元与胶质细胞丢 失与周围病变部位脱髓鞘的一种疾病，最终将导致白 质纤维束永久性中断造成瘫痪。作为治疗脊髓损伤的 理想供体细胞应具有易于获取、倍增时间短、能够在 脊髓环境中长期存活、易于转染并长期表达外源性基 因等优点，hUC-MSCs 因具有上述优点，可作为治疗 脊髓损伤理想的细胞来源。Yang 等[12]将hU C-MSCs 移植到完全性横贯性脊髓损伤大鼠模型的损伤部位 后，大鼠的运动功能得到显著改善，病变周围皮质脊 髓束再生轴突和神经微丝的数目显著增加。Wang 等[13] 将hUC-MSCs 移植到脊髓半切小鼠模型中，结果发现 小鼠的行为学随移植后时间的迁移而得到逐渐改善。 6.3. 脑缺血 缺血性脑卒中是由突然发生的脑组织局部供血 血流减少或完全中断所致，若得不到及时诊断与治 疗，容易导致永久性的神经损伤、神经系统并发症甚 至死亡。研究表明[14]，神经干细胞、骨髓 MSCs、脂 肪组织细胞、脐带血细胞、外周血细胞均可在动物缺 血性脑卒中模型中发挥一定的治疗作用，由于获取困 难、伦理约束、倍增时间长等原因，限制了其在该领 域的广泛应用。而hUC-MSCs 恰恰克服了这些缺点。 Lin 等[15]将hUC-MSCs 移植到大脑中动脉栓塞模型大 鼠的脑皮质，移植组大鼠出现脑梗死体积减少、萎缩 程度逐渐减弱，运动功能及皮质神经元的代谢活动得 到显著改善，并发现移植大鼠皮质表面有广泛的新生 血管形成、梗死区域血管密度显著增加。Koh 等[16] 也发现，植入hUC-MSCs 的脑卒中模型大鼠神经行为 学改善、梗死面积减少，海马区域内源性巢蛋白阳性 细胞数增加，而相对较少数量的植入细胞表达神经元 标志物。因此推测，植入hUC-MSCs 的脑卒中大鼠神 经行为学的改善可能与hUC-MSCs 的神经保护作用 所致的内源性神经形成增加、梗死面积减少有关，而 并非是在自体神经元与植入细胞之间形成了新的血 管、神经网。 6.4. 脑出血 脑出血是由颅内血管自发性破裂所引起，属于脑 卒中的一种，具有较高的发病率及死亡率，存活者常 遗留永久性神经功能障碍。Liao等[17]将hUC-MSCs 移植入脑出血模型大鼠脑内，结果发现移植组大鼠神 经功能缺陷得到了明显改善、脑出血面积减少，脑出 血周围白细胞浸润减轻、小胶质细胞活性降低、胞内 活性氧水平及基质金属蛋白酶的产生明显较少，血管 密度明显增加。推测其可能的发病机制为抑制炎症与 促进血管重建。 Copyright © 2012 Hanspub 19  人脐带间充质干细胞移植在神经系统疾病中的新进展 6.5. 脑创伤 创伤性脑外伤是年轻人群致残、致死的首要原 因。Zhang 等[18]将脑源性神经营养因子(BDNF)修饰的 hUC-MSCs移植入液压敲击裸鼠脑损伤模型的病变周 围，结果发现基因转导的hUC-MSCs 可以改善损伤大 鼠的神经功能，并增加神经元特异性酯酶的阳性细胞 数，减少 GFAP 阳性细胞数及细胞凋亡。由此说明， hUC-MSCs在脑外伤治疗中具有潜在的应用价值。 6.6. 视网膜病 光感受器退行性变是发达国家致盲的主要原因 之一，研究表明，细胞移植疗法可能会为该病的治疗 带来新希望。Lund 等[19]分别将脐带组织细胞、胎盘 细胞、骨髓 MSCs、皮肤成纤维细胞移植入视网膜退 行性变大鼠的视网膜下间隙，结果发现胎盘组织细胞 及骨髓 MSCs均能显著改善视网膜退行性变的程度， 其中前者较后者具有更显著的修复作用。由于植入细 胞未分化为神经元，推测其作用的原因可能与其分泌 神经营养因子如脑源性神经营养因子BDNF、白介素 -6 等有关。这进一步为视网膜退行性变的治疗带来了 新思路。 7. 总结与展望 近10年来，干细胞移植疗法有了重大突破，并 为神经系统疾病的治疗带来了新的契机。尽管神经干 细胞、胚胎干细胞、骨髓 MSCs 等仍为目前细胞移植 领域研究的热点，但与其相比，hUC-MSCs 具有更多 的优点：1) 作为妊娠分娩废弃物，其获取不受伦理、 道德等方面的约束；2) 与骨髓 MSCs 相比，其增殖、 分化能力不会随着年龄的增长而下降，短时间内即可 获取大量细胞，为其短期内的实验与临床移植应用提 供了可能；3) 与脐血 MSCs 相比，其分离成功率高， 几乎可达 100%，而脐血 MSCs 的分离成功率仅为 0%~60%[20]；4) 采集过程为非侵袭性操作，对母亲或 胎儿不会造成任何痛苦或不利影响；5) 胎盘的屏障作 用，使其细菌、病毒感染风险较其他组织源性MSCs 低；6) 生物性能稳定，多次传代后仍保持旺盛功能； 7) 可长年低温储藏，便于实验研究与临床应用；8) 免 疫原性低，不表达 MHCⅡ类分子，低表达 MHCⅠ类 分子，可作为同种异体细胞移植的来源；9) 其分化 潜能介于胚胎干细胞与成体干细胞之间，因此，不会 无限增殖形成畸胎瘤，于适宜环境下可被成功诱导分 化为三个不同胚层来源的多种成熟细胞；10) 在适宜 的体内外环境下，可被诱导分化为多种神经元及各类 胶质细胞，并分泌大量的生长因子、细胞因子及生物 活性因子，通过减少凋亡、调节免疫、抑制炎症、细 胞替代等多重机制参与各种神经系统疾病动物模型 的神经功能修复；11) 转染率高，能稳定表达外源性 基因，可作为基因治疗的载体。鉴于hUC-MSCs 的诸 多优点，其作为神经系统疾病治疗的细胞来源具有广 泛的应用前景。若能有效利用妊娠分娩废弃物，对神 经系统疾病患者进行早期hUC-MSCs 移植治疗降低 其死亡率及神经系统后遗症的发生，进而提高患者的 生存质量将具有深远的社会意义。 难治性神经系统疾病，系指用传统药物疗法或手 术治疗后症状控制每况愈下，毒副作用严重，很难阻 止病情进展的神经系统疾病。此类患者生活质量极 低，给家庭和社会带来了极大负担。而hUC-MSCs 可 以在一定条件下分化为神经类细胞，并定位于损伤部 位进行形态与功能修复，为难治性神经系统疾病患者 带来了曙光。目前，动物实验及临床试验表明，与神 经系统疾病传统疗法相比，hUC-MSCs 治疗的优势在 于，治疗时间短，可以增强机体免疫力、提高生活质 量，尚未有急性或长期不良反应报道。尽管 hUC-MSCs 具有诸多优点，但在其正规、广泛应用于临床治疗神 经系统疾病之前，尚有较多问题以待解决，比如移植 的最佳时间窗及途径、临界细胞剂量、长期传代培养 后有无恶变倾向及标识、移植后有无长期不良效应 等。其中，hUC-MSCs 治疗是否具有长期安全性，为 其临床限制使用的主要原因。因此，hUC-MSCs 在神 经系统中的应用尚需多中心、大规模、前瞻性的实验 进行研究探讨，以最简单、最经济、最安全的方法实 现其最佳疗效，从而为hUC-MSCs 的临床应用提供坚 实的实验依据。 8. 致谢 衷心感谢我的导师陈娟教授一直以来在学习、工 作和生活中对我的悉心教导和无微不至的关怀，使我 顺利完成了本文的撰写。她严谨的治学态度、渊博的 学识、精益求精的工作作风、诲人不倦的高尚师德、 Copyright © 2012 Hanspub 20  人脐带间充质干细胞移植在神经系统疾病中的新进展 Copyright © 2012 Hanspub 21 平易近人的人格魅力将使我终身受易，并将激励着我 在今后的学习和工作之中不断努力与进取。 参考文献 (References) [1] K. E. Mitchell, M. L. Weiss, B. M. Mitchell, et al. Matrix cells from Wharton’s jelly form neurons and glia. Stem Cells, 2003, 21(1): 50-60. [2] Y. A. Romanov, V. A. Svintsitskaya and V. N. Smirnov. Search- ing for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: Candidate MSC-like cells from umbilical cord. Stem Cells, 2003, 21(1): 105-110. [3] R. Sarugaser, J. Ennis, W. L. Stanford, et al. Isolation, propaga- tion, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods in Molecular Biology, 2009, 482: 269- 279. [4] K. Seshareddy, D. Troyer and M. L. Weiss. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology, 2008, 86: 101-119. [5] H. S. Wang, S. C. Hung, S. T. Peng, et al. Mesenchymal stem cells in the Wharton’s jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(7): 1330-1337. [6] L. Ma, X. Y. Feng, B. L. Cui, et al. Human umbilical cord Whar- ton’s Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells. Chinese Medical Journal, 2005, 118(23): 1987- 1993. [7] Y. S. Fu, Y. T. Shih, Y. C. Cheng, et al. Transformation of human umbilical mesenchymal cells into neurons in vitro. Journal of Biomedical Science, 2004, 11(5): 652-660. [8] S. S. Kadam, S. Tiwari and R. R. Bhonde. Simultaneous isola- tion of vascular endothelial cells and mesenchymal stem cells from the human umbilical cord. In Vitro Cell & Development Biology Animal, 2009, 45(1-2): 23-27. [9] Y. S. Fu, Y. C. Cheng, M. Y. Lin, et al. Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton’s jelly to dopaminergic neurons in vitro: Potential therapeutic application for Parkinsonism. Stem Cells, 2006, 24(1): 115-124. [10] M. L. Weiss, S. Medicetty, A. R. Bledsoe, et al. Human umbili- cal cord matrix stem cells: Preliminary characterization and ef- fect of transplantation in a rodent model of Parkinson’s dis- ease. Stem Cells, 2006, 24(3): 781-792. [11] 邱云, 汪铮, 路红社. 脐带间充质干细胞移植治疗帕金森病 8 例. 中国组织工程研究与临床康复, 2011, 15(36): 6833-6836. [12] C. C. Yang, Y. H. Shih, M. H. Ko, et al. Transplantation of hu- man umbilical mesenchymal stem cells from Wharton’s jelly af- ter complete transection of the rat spinal cord. PLoS One, 2008, 3(10): e3336. [13] G. S. Wang, Q. Z. Zhang and Z. C. Han. Evaluation of neuro- logical function recovery following human umbilical cord mes- enchymal stem cells transplantation to injured spinal cord in rats. Chinese Journal of Neurosurgery, 2006, 22(1): 18-21. [14] T. Bliss, R. Guzman, M. Daadi, et al. Cell transplantation ther- apy for stroke. Stroke, 2007, 38(Suppl. 2): 817-826. [15] Y. C. Lin, T. L. Ko, Y. H. Shih, et al. Human umbilical mesen- chymal stem cells promote recovery after ischemic stroke. Stroke, 2011, 42(7): 2045-2053. [16] S. H. Koh, K. S. Kim, M. R. Choi, et al. Implantation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a neuropro- tective therapy for ischemic stroke in rats. Brain Research, 2008, 10(1229): 233-248. [17] W. Liao, J. Zhong, J. Yu, et al. Therapeutic benefit of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells in intracere- bral hemorrhage rat: Implications of anti-inflammation and an- giogenesis. Cell Physiology and Biochemistry, 2009, 24(3-4): 307-316. [18] S. Zhang, X. Z. Liu, Z. L. Liu, et al. Stem cells modified by brain-derived neurotrophic factor to promote stem cells differen- tiation into neurons and enhance neuromotor function after brain injury. Chinese Journal of Traumatology, 2009, 12(4): 195-199. [19] R. D. Lund, S. Wang, B. Lu, et al. Cells isolated from umbilical cord tissue rescue photoreceptors and visual functions in a ro- dent model of retinal disease. Stem Cells, 2007, 25(3): 602-611. [20] E. N. Momin, A. Mohyeldin, H. A. Zaidi, et al. Mesenchymal stem cells: New approaches for the treatment of neurological dis- eases. Current Stem Cell Research & Therapy, 2010, 5(4): 326- 344. |