EF-Hand蛋白研究进展 Progress on the EF-Hand Proteins

doi:10.12677/biphy.2013.11001

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Biophysics 生物物理学, 2013, 1, 1-10

http://dx.doi.org/10.12677/biphy.2013.11001 Published Online May 2013 (http://www.hanspub.org/journal/biphy.html)

Progress on the EF-Hand Proteins*

Ting Y u#, Y uwei Zhao#, Shaoning Yu†

Department of Chemistry, Fudan University, Shanghai

Email: 10210220023@fudan.edu.cn, 11210220066@fudan.edu.cn, †yushaoning@fudan.edu.cn

Received: Mar. 15th, 2013; revised: Mar. 19th, 2013; accepted: Apr. 15th, 2013

stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract: Structural the EF-hand Ca2+-binding proteins and calcium have been recognized as the key players in all as-

pects of cell function, starting with a cell’s birth during mitosis and ending with its apoptotic death. A malfunction in

EF-hand proteins-signaling can engender many human diseases. Functionally, EF-hand proteins can be divided into two

general classes: the Ca2+ sensors and the Ca2+ buffers. The exceptional versatility of the EF-hand proteins is intimately

associated with the diversity of the EF-hand motifs, such as discrepancy in conformations, domain organization, struc-

tural responses to calcium and so on. In the present review, we describe the progress on the structure and function of

EF-hand proteins, as well as many human diseases caused by signaling dysfunction.

Keywords: EF-Hand Protein; EF-Hand Motif; Calcium

EF-Hand 蛋白研究进展*

吁亭#，赵宇威#，余绍宁†

上海复旦大学化学系，上海

Email: 10210220023@fudan.edu.cn, 11210220066@fudan.edu.cn, †yushaoning@fudan.edu.cn

收稿日期：2013 年3月15 日；修回日期：2013年3月19 日；录用日期：2013 年4月15 日

摘要：EF-hand 蛋白作为钙离子结合蛋白家族中的特殊成员和钙离子一起参与了从细胞增殖到细胞凋亡各方

面的功能调节，EF-hand 蛋白调节信号的异常也被认为是人类多种疾病的诱因。按照功能分类，EF-hand 蛋白可

以分为具有调控功能的 Ca2+信号蛋白和只参与 Ca2+转运、缓冲的 Ca2+缓冲蛋白两大类。EF-hand 蛋白功能的多

样性与 EF-hand 结构的构象、组织形式、对钙离子的响应程度等密切相关。本文就 EF-hand 蛋白结构与功能的

差异以及与疾病的关系进行简要综述。

关键词：EF-Hand 蛋白；EF-Hand 结构域；钙离子

1. 引言

Krestinger[1]在用X衍射分析小清蛋白(Parval

bumin, PV)三维结构时，首次提出了 EF-hand 结构模

型。如图 1，这种 Ca2+结合蛋白有6个螺旋部分(A、B、

C、D、E、F)成对的组成一个类似的结构区域。每个

结构区域包括二个含10 个氨基酸的α螺旋，中间为一

个含 10个氨基酸的非螺旋结构的环状区域。每个环状

区域内，蛋白质主、侧链上的 6~8 个氧原子提供电子

与Ca2+结合。Krestinger将这种特殊的螺旋–环–螺旋

结构称为“EF-hand 结构”，拥有 EF-hand 结构的蛋白

称为 EF-hand 蛋白。这种螺旋结构很像拳头上伸开的

*国家自然基金资助项目(No. 21275032,30970631)，上海市重点学科

资助项目(B109)。

#对本工作同等贡献。

†通讯作者。

EF-Hand 蛋白研究进展

(A) 用右手表示的 EF-hand 结构的三维结构图：食指表示的是 E螺旋(残

基1~10)，弯曲的中指表示的是经典的钙离子结合环(残基 10~21)，大拇

指表示的是 F螺旋(残基19~29)。(B) X射线衍射的小清蛋白结构。(C) 常

见的经典 EF环的氨基酸序列，1、3、5、6、8和12 位为最保守的氨基

酸残基，最常见的氨基酸用下划线表示。

Figure 1. The EF-hand motif of parvalbumin[4]

图1. 小清蛋白的 EF-hand 结构

食指与拇指，E螺旋相当于食指，F螺旋相当于拇指，

两者伸出成直角，其根部弯曲的中指，相当于螺旋之

间的环，Ca2+正好位于三指的凹陷之中。EF-hand 蛋白

在钙结合蛋白中非常普遍，对人类全部染色体组的分

析表明，共有 242个蛋白中含有 EF-hand 结构[2]，同

时，从其他物种中确定的含有具有EF-hand 结构的蛋

白目前已超过 600 个[3]。其中最著名的成员有钙调蛋

白(Calmodulin, CaM)、小清蛋白 (Parvalbumin, PV)、肌

钙蛋白 C (Troponin C, TnC)、calbindin、S100 蛋白家

族等。

EF-hand蛋白作为钙离子结合蛋白家族中的特殊

成员和钙离子一起参与了从细胞增殖到细胞凋亡各方

面的功能调节。按照功能分类，EF-hand蛋白可以分

为具有调控功能的Ca2+信号蛋白和只参与Ca2+转运、

缓冲的 Ca2+缓冲蛋白两大类[5]。一般讲，在静息状态

时，大多数细胞包括神经细胞和肌肉细胞的 Ca2+浓度

为50~100 nM，这时 EF-hand蛋白在静息细胞中主要

以未结合钙离子的形式存在。当细胞受到刺激时，内

部储备的钙离子释放或外部的钙离子大量涌入导致钙

离子浓度急剧增加，EF-hand 蛋白被激活并参与钙离

子信号的调节。信号蛋白是EF-hand蛋白家族中最大

的一类，它包括CaM、TnC 及S100B 等大家所熟知的

家族成员。信号蛋白能将钙离子浓度增加的化学信号

转变为各种生物化学响应，信号转变过程中都会伴随

着典型的 Ca2+依赖性的构象改变。而缓冲蛋白不会发

生Ca2+依赖性的构象改变，它们在结合Ca2+以后主要

作为钙离子浓度的调节器，参与对细胞内钙离子浓度

的调控，calbindin D9k、calretinin 和PV 就属于这种类

型。EF-hand蛋白功能的多样性与EF-hand 结构域的

组织形式、构象以及对钙离子的结构响应等密切相关。

近年来，随着研究的不断深入，EF-hand 蛋白的许多

新的功能又相继被发现，它们在人类的免疫系统、神

经系统、生殖系统、运动系统等都发挥了突出的作用，

EF-hand 蛋白功能的失调，也被认为是许多人类疾病

如老年痴呆、心肌病、癌症、唐氏综合征的诱因[4,6,7]。

本文就 EF-hand 蛋白结构与功能的差异以及与疾病的

关系进行简要综述。

2. EF-Hand蛋白的结构特征

EF-hand 蛋白中的EF-hand 结构是由一段螺旋–

环–螺旋的二级结构组成，EF-hand 结构中的钙离子

结合区域 EF 环按照组成和长度的不同可以分为经典

与非经典 EF环。大部分EF-hand 蛋白都含有 2、4或

6个EF-hand 结构，具有很强的成对倾向，形成一个

个分离的结构域，不同 EF-hand 蛋白中的EF-hand结

构域可以按照不同的组织形式形成不同的分子构象，

这种 EF-hand蛋白结构的多样性为 EF-hand 蛋白对钙

离子浓度变化产生不同的信号响应提供了结构基础。

2.1. EF环的结构特征

EF-hand 蛋白中的EF-hand 结构是由一段螺旋–

环–螺旋的二级结构组成的。经典的 EF环由12 个氨

基酸构成，起始和终止氨基酸一般分别为为天冬氨酸

和谷氨酸(图1(C))。钙离子与 7个氧原子螯合成五角

双锥形，其中的 5个氧原子由 EF环中的 9个残基提

供，剩下的两个是由出口螺旋侧链中的酸性氨基酸提

供的双齿羧酸酯配体。在 EF环本身提供的配基中，3

或4个来源于负电荷氨基酸侧链的羧基，另一个来源

于骨架羰基，与 EF 环的侧链形成氢键的水分子也常

常作为钙离子的配体(图2(A))。EF 环的残基一般用两

种方式标注：第一种是根据它们的线性位置；第二种

是根据它们在五角双锥中的几何分布。与钙离子螯合

的配体分布在正交坐标系中：1(+X)，3(+Y)，5(+Z)，

EF-Hand 蛋白研究进展

(A) 钙离子螯合结构示意图:入口和出口螺旋用红色标注，蛋白提供的配

体用青色标注，水分子(W)用深青色标注，8位的与配对的 EF-hand 结构

形成短的 β片的残基用紫红色标注。(B) CaM EF1 的钙离子螯合图：钙离

子用黄色标注，水分子用青色标注，侧链氧原子用红色标注，骨架的 NH

基团用黑色。

Figure 2. The co-ordination sphere of the canonical EF-loop[1]

图2. 经典 EF 环的螯合结构

7(−Y)，9(−X)，12(−Z)(图2(B))。在所有已知的 EF-hand

蛋白结构中，EF 环-Y位置的残基通过主链羰基氧原

子与钙离子结合，和这个残基相邻的疏水氨基酸(大部

分是异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸)与配对的 EF-hand 结

构中对应的残基形成两个氢键。这两个氢键是 β片的

一部分，连接着两个EF 环[8]。

尽管大部分的 EF-hand 蛋白含有的是经典的 EF

环，但 EF 环的长度和组成的变化对EF-hand 蛋白的

多样性意义重大。有些非经典的 EF环虽然长度与经

典EF 环一样，但是结合钙离子方式不同，如调节肌

球蛋白轻链(the regulatory light chain of myosin, my-

osin RLC)12 位(−Z)的谷氨酸替换成天冬氨酸，这种氨

基酸的替换使得 EF-hand 蛋白对钙离子的亲和性降

低，更倾向于结合镁离子，与钙离子螯合的几何构型

为八面体[9]。有些非经典EF 环是由于EF 环长度的变

化，如 Calbindin D9k 的N端的EF-hand 结构的EF 环

含有 14 个氨基酸，除了 C端的谷氨酸，所有的钙离

子配体都来源于主链的羰基氧原子。尽管背离了常规

的钙离子结合模式，但Calbindin D9k 还是保留了五角

双锥的几何构型和对钙离子的高亲和力。除此以外，

11 个残基的 EF 环、13 个残基的EF 环都不断被发现。

令人惊讶的是，所有 EF 环氨基酸的插入或丢失一般

都发生在N端，而 C端的长度是不变的，且−Y和−Z

配体间的氨基酸间距是很保守的[10]。EF 环的结构对

EF-hand 蛋白结合钙离子的性质、结合钙离子后蛋白

激活的程度、速度和持续时间等具有重要的影响。

2.2. EF-Hand结构的配对

大部分 EF-hand 蛋白具有 2~8 个多拷贝的 EF-

hand 结构，而且往往空间上成对排列。成对的 EF-hand

结构面对面的排列，4个螺旋聚集在一起形成了一个

疏水区，两个短的反平行的 β片组成的 EF环进一步

完善了 EF-hand 结构。结合了 Ca2+后EF-hand 结构由

于Ca2+-配体、极性基团和紧密结合的水分子间的相互

作用使得 EF-hand 结构更加稳定[10] 。配对的两个

EF-hands结构几乎是 2次对称，但这两个 EF-hands

结构并不是完全一样的[11]。

EF-hand 结构的配对现象几乎是无处不在的。首

先，假如配对的EF-hands 结构中的一个失去了功能，

这两个 EF-hand 结构仍然能够保持配对，这种现象在

无脊椎的杂色沙蚕和文昌鱼的肌质 Ca2+结合蛋白中

(Sarcoplasmic Ca2+-binding proteins，简称SCPs)都可以

见到。以沙蚕的 SCP 为例，由于大量的插入，EF2 丧

失了功能，但仍然能与具有功能的EF1 配对，且几乎

是二次对称的[12]。在文昌鱼的 SCP 中，丧失功能的

EF4 能够再次和 Ca2+ 结合的 EF3 配对，但两个

EF-hands 结构间反平行的β片丢失了[13]。其次，根据

对单个的 EF-hand 结构的肽段的研究得到的 EF-hand

结构的疏水折叠，为肽段的二聚作用提供了一个很强

的驱动力。通过观察不同独立的EF-hand 结构肽段聚

合形成含有多个 EF-hand 结构蛋白质的实验，不同蛋

白质 EF-hand 结构二聚的程度已经得到证实，其中包

括CaM[14]，TnC[15]，calbindin D9K[16]和沙蚕SCP[17]等。

研究表明，在 Ca2+存在下，EF-hand 结构肽段能够聚

合形成同源二聚体。但将同源二聚体和它们的原来的

配对 EF-hand结构肽段混合时，EF-hand 结构肽段更

倾向于形成异源二聚体。异源二聚体和同源二聚体相

比对 Ca2+的亲和性增加了 200倍[18]。有趣的是，除了

二聚体的形成，金属离子的结合会诱导EF-hand 结构

肽段中的无规卷曲向螺旋–环–螺旋的构象转变，这

种转变也许对于蛋白质的折叠具有重要的作用[19]。

2.3. EF-Hand的结构域的组织形式

尽管配对的 EF-hand 的结构是高度保守的，但是

通过对两个EF-hands 的连结在组成和长度上进行修

饰，或者通过改变蛋白质中EF-hand结构域的组织方

式，都可以增加EF-hand的结构的多样性。

Calbindin D9k 是EF-hand 蛋白质家族中最小的蛋

白，分子量只有9kDa，只含有一对 EF-hand 结构。大

部分 EF-hand蛋白质家族中的成员都含有 2对EF-hand

EF-Hand 蛋白研究进展

结构，每对都与 calbindin D9k 类似(图3)。根据成对的

EF-hands 结构域之间的连结的长度和构象的区别，可

以将 EF-hands 结构域的组织形式分为三类：第一类，

两个独立的结构域由一个非常灵活的连结连接，以

CaM[20]和TnC[21]为例，EF-hands 结构域之间柔软的连

结使得它们可以采取不同的方位和靶蛋白相互作用；

第二种组织方式在恢复蛋白(recoverin)和其他的神经

传感器蛋白(Neuronal calcium sensor proteins, NCS)亚

家族其他成员中可以见到，两个结构域由一个 U型的

连结连接，4个EF-hands 结构紧凑的串联排布在蛋白

质的一个平面上[22]。这种相对的排布方式是由结构域

之间和结构域内部的相互作用共同决定的；最后一种

组织形式可以在无脊椎 SCPs 中观察到[13] ，四个

EF-hand 结构折叠为紧密的球形结构，两对 EF-hand

位于球形结构的相反面，事实上，两个结构域高度的

非极性表面使得相互间有高度的专一性和亲和性以致

于阻碍了对靶蛋白疏水表面的识别和结合[23]。此外，

在EF-hand 蛋白的大家族中，有些蛋白质含有 6个

EF-hand 结构包括神经保护功能的calbindin D28K 和它

的同源体 calretinin 以及内质网调节蛋白亚家族。以

calbindin D28K 为例，三对EF-hand 结构形成一个紧密

的、椭圆形的构象，这种构象与NCS类似[24]。

由于 EF-hand 结构具有很强的成对倾向，因此含

有单数 EF-hand 结构的蛋白质是非常少见的。单个具

有功能的 EF-hand 结构在电压门控钙离子通道 1.2 的

亚基的 C端结构域被发现，尽管它的 EF环是一段非

经典的序列，但是这个 EF-hand 结构被认为能够结合

二价离子且对于维持钙离子的动态平衡具有重要作用

[25]。对于含有 3对EF-hand 结构的小清蛋白亚家族而

言，未配对的 EF1 由于提供氧配体的氨基酸已被其他

氨基酸所取代，因此在功能上不能结合 Ca2+，但是可

以看作结合在C端结构域内生的肽段，以Ca-CaM-肽

段的形式稳定配对的Ca2+结合的 EF2/EF3 结构[26]。有

趣的是，如果将EF1 结构替换为经典的EF-hand结构

并不会恢复其对 Ca2+的结合和影响整个结构的稳定性

[27]。最后，当一整个亚家族含有5个EF-hand 结构，

第五个具有功能的 EF-hand结构能够发生自缔合作用

生成含有 10个EF-hand 的结构单元[8]。

3. EF-hand蛋白的工作机理

在钙离子调控过程中，许多生物学反应都是通过

(A) Calbindin D9K (B) Parvalbumin (C) i，CaM; ii，recoverin iii，Nereis SCP (D)

Domain VI of calpain (E) Calbindin D28K。在(A)~(E) 第一对配对的 EF-hand

结构域用紫红/粉红标注，第二队为蓝色/青绿色，第三对棕色/橘黄色，未配

对的 EF-hands 结构域用灰色标注。

Figure 3. EF-hand domain organization[6]

图3. EF -hand结构域的组织形式[6]

细胞内钙离子微妙的变化进行触发或调控的。EF-hand

蛋白作为细胞内的传感器，在不同范围内，对细胞内

钙离子浓度的精确感应是其调控的关键。EF-hand 蛋

白中的信号蛋白的调节功能主要归功于钙离子诱导的

构象变化，导致大量疏水的靶蛋白结合位点暴露。缓

冲蛋白作为钙离子浓度的调节器，其功能受到对钙离

子的选择性、结合钙离子的动态性等多方面的影响。

3.1. 钙离子诱导的信号蛋白的构象变化

EF-hand 蛋白中的信号蛋白的调节功能主要归功

于钙离子诱导的构象变化。最早的TnC[28]的晶体结构

表明，钙离子只结合在C端结构域。结合了钙离子C

端结构域呈现出一个开放的构象，伴随着大面积的疏

水区域的暴露，而未结合钙离子的 N端结构域呈现出

一个封闭的构象，所有的螺旋结构都互相紧密的堆积

在一起。Herzberg[29]等认为钙离子的结合会引起结构

域的构象由闭合向开放转变，同时伴随着大量疏水基

团的暴露，作为和靶蛋白相互作用的位点。这个推论

被称为 HMJ 模型，且已经被大量化学生物和结构数据

证明[10]。

HMJ 模型同样适用于 CaM，CaM是目前研究最

EF-Hand 蛋白研究进展

多，在所有的真核细胞中分布最广的一个钙离子结合

蛋白，介导调控由Ca2+引起的一系列生理生化反应，

参与并调节细胞的增生、分化、运动等基本代谢过程

[30]。Babu 等[20]首次用 X光衍射法得到了分辨率0.22

nm 的Ca2+-CaM 三维晶体结构，从中可以看出 CaM

为一哑铃型结构，整个分子长度为6.5 nm。柄是一个

长α螺旋，每个铃(球区)大约 25 × 20 × 20 Å，两铃间

无直接接触，一铃上含 2个Ca2+结合位，2个Ca2+间

距为 11.3 Å。CaM共含八段 α螺旋，在 N端和 C端

分别含有两个EF 环，由这四个EF 环与位于两头的部

的六个 α螺旋区共同形成四个典型的螺旋–环–螺旋

EF-hand 结构。NMR 和X衍射得出的无Ca2+结合的

CaM(apo-CaM)的晶体结构与 Ca2+-CaM 相比[31,32]，分

子结构有很大的不同(图4)[33]。从整体看，apo-CaM 的

结构更紧凑、封闭，Ca2+-CaM 的结构则较松弛、开放。

在apo-CaM 中，螺旋Ⅰ与Ⅳ、Ⅴ与Ⅷ在空间上形成分

子内相互作用，导致 apo-CaM 的疏水性残基被α螺旋

片段包围，在两端各形成一个结构内部的疏水性核心，

只有部分疏水残基暴露在溶液中。apo-CaM C端结构

域的这种构象使得细胞在静息状态时，与一些钙不依

赖钙调素结合蛋白(Caimodulin binding proteins,

CaMBPs)结合，形成有活性的复合物，行使某些重要

功能[34]。中心螺旋在Ser-81 位置一折为二，两个球部

扭转了大约180˚。每个 EF-hand 结构的 2个α螺旋在

空间上平行，当 EF-hand 的钙结合环结合钙后，这 2

个α螺旋张开成直角，结果导致哑铃球部由沿中心螺

旋折叠而伸直，中心螺旋暴露，疏水残基从 α螺旋片

段之间伸展出去，在每个长把勺末端形成一个面朝外

的疏水穴，这两个疏水穴将与中心螺旋共同负责与靶

酶及拮抗剂的结合[35]。最近的研究发现，钙离子激活

CaM 不仅仅是通过每个结构域局部的结构变化，更多

的是通过整个分子的形状的改变，针对不同的底物，

钙离子能够诱导 CaM 选择不同的构象与底物相互作

用[36]。

Ca2+诱导的这种由封闭到开放的构象变化并不是

在所有的 EF-hand 家族成员中可以看见。S100A6的X

衍射的晶体结构表明，结合了钙离子和未结合钙离子

的EF1 构象非常相似，但是在EF2 中，钙离子的结合

使得螺旋Ⅲ和螺旋Ⅳ之间的夹角变化了86˚[37]，这种

钙离子诱导的螺旋Ⅲ的转动在 S100B中也可以观察到

[38]，因此相对于 Ca2+诱导的CaM 和TnC 中EF-hand

(A) i，apo-CaM; ii，Ca2+-CaM (B) i，apo-S100A6; ii，Ca2+-S100A6。在

图中 N端的螺旋用紫色标注，C端的螺旋用青色标注，钙离子用黄色

标注，非螺旋结构用灰色标注。

Figure 4. Ca2+-induced conformational changes

图4. 钙离子诱导的构象变化

结构域协同变化相比，S100 蛋白构象变化属于独立的

螺旋的运动。Recoverin和NCS 亚家族蛋白质，Ca2+

结合引起结构域的转动，这种转动使得埋藏于蛋白质

内部的肉豆蔻酰暴露，蛋白质转移到质膜[39]。对于抗

药蛋白(sorcin)和其他含有 5个EF-hand 结构的亚家族

成员而言，尽管 Ca2+结合对EF-hand 结构域本身没有

什么影响，但是由于螺旋相互间作用力的改变，C端

EF-hand 结构域与N端EF-hand 结构域的作用力减弱，

导致大量疏水的靶蛋白结合位点暴露[40]。

3.2. 缓冲蛋白对钙离子的响应

缓冲蛋白作为钙离子浓度的调节器，其功能主要

受以下几个方面影响：a) 细胞质中缓冲蛋白分子的浓

度；b) 对钙离子或者其他可能的金属离子如镁离子的

亲和性；c) 结合和释放钙离子的动态性；d) 缓冲蛋

白自身在细胞内部的流动性。由于许多实际的原因，

常常采用 Ks(缓冲剂结合的钙离子的浓度变化与游离

钙离子浓度的变化的比值)作为衡量许多内生缓冲剂

的缓冲能力，特别是当对一种细胞内的钙离子结合蛋

白的性质了解不是很清楚的情况下，如运动神经元的

缓冲能力很低，Ks < 50；而典型的神经元细胞的 Ks

在60~200 之间；Purkinje 细胞由于 calbindin D28k 和

PV 的大量表达，Ks的值非常高，约在900~2000 之间

[4]。

EF-Hand 蛋白研究进展

PV 是EF-hand 蛋白家族中为数不多的含有3对

EF-hand 结构，但只有2对具有结合离子功能的缓冲

蛋白。N端结构域的 AB 位点虽然不能结合钙离子，

但对于维持整个PV 分子的稳定起了很重要的作用。

CD 和EF 位点对钙离子具有很高的亲和性，对镁离子

的亲和性中等，也就是说 CD和EF 位点是 Ca2+/Mg2+

混合结合位点。当细胞处于静息状态时，细胞内镁离

子的浓度达到 0.5~1 mM[41] ，80%~90%的PV 的

Ca2+/Mg2+混合结合位点都被镁离子占据，也就是说，

在钙离子结合上去之前，镁离子先要解离。正因为这

个原因，PV 的钙离子结合率主要由速度相对缓慢的镁

离子解离率决定，同时，PV 结合钙离子的动态性与缓

冲速度很慢的合成缓冲剂EGTA 非常相似，因此 PV

也是一个缓冲速度缓慢的缓冲剂。作为钙离子缓冲剂

的另外一个重要参数是它们在细胞内的流动性。PV

在水溶液(~140 um2/s)中的扩散系数要比在 Purkinje 神

经元树突(~40 um2/s)中的大得多；在同样的Purkinje

神经元其他的细胞结构中，PV的扩散速度降到约 11

um2/s[42]。然而当把PV 的流动性和一个分子量相似、

不会和细胞内其他物质的组分发生特异性反应的右旋

糖苷的流动性比较后发现这两个分子流动性下降的趋

势是一样的。因此，在不同的细胞组分中PV 的流动

性不同是由于细胞质的粘度的差异。最近几年，随着

越来越多的不同物种和形式的PV 的在水溶液中的结

构得到解析，研究发现 PV 虽然内部灵活性较 CaM 还

是比较低，但有些形式的PV 还是会发生钙离子诱导

的构象变化[43]。以βPV为例，当钙离子从βPV 中移

除以后，CD 位点中的两个螺旋、疏水核心、AB 和

CD-EF 结构域之间的界面都会发生重排，这个发现表

明也许 βPV也具备信号蛋白的功能[44]。

Calbindin D28k 也含有 6个EF-hand 结构，其中EF2

被认为丧失了结合离子的能力，而 EF6 对钙离子的亲

和性太低[45]。EF1、EF3、EF4、EF5 位点由于对镁离

子的亲和力很低(0.15 M KCl中对镁离子的亲和常数

为2.5 × 103 M−1)，对钙离子具有高/中等的亲和性(整

个分子对钙离子的平均亲和常数为1.4 × 106 M−1)，因

此被认为是钙离子专一性结合位点[46]。一直以来，

Calbindin D28k 都被认为是一种典型的缓冲蛋白，也有

许多的证据证明在细胞内 Calbindin D28k能够作为钙

离子的缓冲剂发挥作用，如增加细胞内 Calbindin D28k

的水平会降低细胞内钙离子的增长速度；将表达

Calbindin D28k 的基因突变后，钙离子的瞬变增加等。

尽管目前大部分的报道针对的是 Calbindin D28k对钙

离子的缓冲作用，但仍有许多的证据表明 Calbindin

D28k也能作为信号蛋白发挥作用，如光谱研究结果显

示，结合钙离子后，Calbindin D28k 的构象发生了变化；

在肾脏中，Calbindin D28k 能够结合 TRPV5 并且调节

它的活性；另外，作为信号蛋白，对钙离子的选择必

须是镁离子的1000 倍以上，Calbindin D28k 也符合这

个条件[46]。但是，如果Calbindin D28k 同时也属于信号

蛋白，那么它的作用机理是什么呢？2006年鼠的

Ca2+-Calbindin D28k 的晶体结构得到解析[24]，结果表明

整个蛋白是由6个不同的 EF-hand结构域折叠组成的

单一球体，而不是像 CaM 一样含有两个独立的结构

域。同时，尽管 Calbindin D28k 会发生钙离子诱导的构

象变化，但是 apo-Calbindin D28k 和Ca2+-Calbindin D28k

都有疏水区的暴露[47]。因此Calbindin D28k 不可能采取

和CaM 一样只有在结合了钙离子以后才暴露疏水区

和靶酶结合的作用模式。对于Ca2+-Calbindin D28k 的作

用机理，目前还没有定论，还需要进一步的研究。

除了 calbindin D28k、PV 外，其他许多缓冲蛋白如

calbindin D9K、Calretinin 等发现都能够发生微小的钙

离子诱导的构象变化，具有一些信号蛋白的特征。事

实上，在所有 EF-hand 蛋白中，Ca2+结合和因此发生

的构象变化都是由连接两个EF-hand 结构域中Ca2+结

合环的中间结构决定的，这个中间结构称为

“EFβ-scaffold”[10]。EF β-scaffold 能够提供一个多功

能的铰链，使得一些键能够发生转动从而引起 Ca2+诱

导的构象变化，也就是说EF β-scaffold 扭矩的灵活性

导致了 EF-hand 构象的多样性。同时，随着研究的深

入，许多信号蛋白在细胞内浓度足够高时，也会参与

钙离子浓度的调节，信号蛋白与缓冲蛋白两者的界限

越来越模糊。

4. EF-Hand蛋白与其他金属离子的作用

除了 Ca2+外，与EF-hand蛋白结合并调节其与

Ca2+结合的生理功能相关的金属离子还包括 Mg2+、

Zn2+和Cu2+。与细胞内的 Ca2+浓度从静息状态的 10−7

M到激活状态的10−5 M 较大波动不同[48,49]，Mg2+的浓

度相对恒定，变化范围一般在 0.5~1.0 mM。很多

EF-hand 蛋白Ca2+结合位点对Mg2+具有亚毫克分子量

级的离解常数，因此，在没有Cu2+的竞争的情况下可

EF-Hand 蛋白研究进展

与Mg2+结合。目前在蛋白质数据库仅有三种Mg 2+结

合的 EF-hand 蛋白：小清蛋白(PV) ，Calbindin

D9k(S100G)和扇贝肌球蛋白调节轻链(RLC)。在S100 G

中，Mg2+只和 C端的 S100特征EF 环结合。EF 环呈

伸展构象，与没有结合Mg2+的构象类似。Glu12 由于

距离太远其侧链不能与Mg 配位，取而代之的是一个

水分子[50]，两侧的螺旋部分与Ca2结合构象相比结合

更加紧密。Mg2+与PV 的环结合时，Glu12 的侧链旋转

120˚并且只提供一个氧原子与Mg2+配位。Mg2+能通过

多种途径影响 EF-hand 蛋白功能。首先Mg2+和Ca2+

对EF-hand 蛋白结合位点具有竞争性，因而使得目标

酶的激活需要更高的 Ca2+浓度；其次，有研究表明

Mg2+和Ca2+具有负变构效应[51,52]；另外，Mg2+还可以

通过与各种不同目标分子作用进而影响EF-hand 蛋白

的功能，例如最近 Persechini 的研究显示 CaM 的每一

个结构域的不同构象对应一个特异的、不同的功能

[53]，Mg2+可能通过调节Ca2+对每个结构域的响应而更

复杂的影响 Ca2+信号途径。

Zn2+和Cu2+与S100 家族的一些蛋白结合[54]，其

结合位点位于S100 两个单体的界面之间[55,56]。由于配

体和配位构象均不同，Zn2+、Cu2+与Ca2+和EF-hand

蛋白结合不存在竞争关系。许多S100 家族蛋白对Zn2+

具有很高的亲和力，通过与Zn2+结合精细地调节蛋白

的结构和功能[54,57]。S100B 和S100A12 结合 Zn2+后可

以提高它们对Ca2+的亲和力，将Zn2+和Ca2+信号通路

联系起来[58]。Zn2+的浓度在细胞外可以达到微摩尔到

毫摩尔级水平，参与S100 分泌蛋白低聚物的形成和

细胞外功能[59,60]。S100B 是人大脑中含量最丰富的蛋

白之一，它可以与Cu2+结合并有效隔绝 Cu2+，抑制

Cu2+引起的细胞损害，对神经起保护作用[61]。

一些重金属离子结合也可以与 EF-hand 蛋白结

合，引起对 Ca2+信号通路的干扰，引起中毒和致病。

在分子水平，Pb2+能特异性作用于Ca2+电压门控通道，

和TnC[62]，并且可以在低浓度刺激 CaM信号通路[63]。

其他一些金属离子例如Ba2+、Sr2+、Hg2+、Cd2+和大部

分镧系元素对包括 CaM在内的许多 Ca2+结合蛋白同

样具有亲和力。最新的对Pb2+、Ba2+和Sr2+与痢疾变

形虫的 Ca2+结合蛋白-1(EhCaBP1) 的晶体学和热力学

研究显示其 EF-hand 结构域可以与几个重金属离子结

合并且具有相似的亲和力，EhCaBP1 对Pb2+有五个结

合位点，对 Ba2+和Sr2+有四个结合位点[64]。

5. EF-Hand蛋白功能与疾病

EF-hand 蛋白对神经系统、免疫系统、生殖系统、

运动系统等都发挥了重要的作用，几乎涉及到细胞内

所有的功能调节。许多科学家认为EF-hand 蛋白介导

的调控异常是导致许多人类疾病的诱因。如 CaM 依赖

的蛋白激酶对免疫系统，神经系统的调节和精子的形

成都有重要的影响，当鼠的 CaMKIV 突变以后，表现

出从骨质疏松到男性不育等一系列人类疾病的显著特

征[65]；Calbindin D28k 在老年人以及神经退行性疾病人

群中显著减低，老龄老鼠模拟试验显示，Calbindin D28k

在整个脑部，其 mRNA 水平的表达降低了 60%~80%；

脊髓运动神经元由于缺乏PV和Calbindin D28k 的表达

而对钙离子介导的损伤非常敏感[66]。另外，许多其他

的EF-hand蛋白如：Calcineurin、S100 家族、NCS家

族等对许多人类疾病的致病机理也密切相关。

5.1. 钙调磷酸化酶

钙调磷酸化酶(Calcineurin, CN)也属于 EF-hand 家

族中的一员，由分子量较大的催化亚基 CNA 和分子

量较小的调节亚基 CNB 组成，是目前唯一所知依赖

钙和钙调蛋白的蛋白磷酸酶。当钙离子结合后，CNB

的构象发生变化导致CNA 暴露 CAM 结合位点，

Ca2+/CaM 的结合进一步使得自抑制结构域从催化结

构域移开，CN被激活。CN对钙离子具有很高的亲和

性，纳摩尔级浓度的钙离子就能将CN 激活。CN 在脑

内的含量极高，因此许多脑内功能都与之有关，特别

是对于神经突触的可塑性和记忆有重要作用。大脑中

调节大部分兴奋性突触传导的谷氨酸 AMPA受体

(AMPA-R)的845 位丝氨酸的脱磷酸化会降低神经传

导的强度，这可能是长期抑郁现象(Long-term depres-

sion, LTD)的原因[6]。除此以外，CN 通过脱磷酸化活

化Ｔ细胞核因子(Nuclear factor of activated T cell,

NFAT)使之活化而移位进入核内，然后参与IL-2 和其

他一些因子的转录过程。CN-NFAT的信号故障能够造

成一系列的疾病，如心脏肥大、免疫功能失调、骨质

疏松症、老年痴呆、唐氏综合症和癌症等。

5.2. S100蛋白家族

S100 蛋白共有 21 个成员，只在脊柱动物中表达，

是EF-hand 信号蛋白家族中最大的亚家族。除了

EF-Hand 蛋白研究进展

S100G(Calbindin D9k)属于缓冲蛋白，所有其他的成员

都通过钙离子依赖的形式调节受体蛋白的活性。编码

S100A1-S100A16蛋白的基因位于很容易发生染色体

重排的 1q21染色体上，显示 S100家族蛋白和新陈代

谢及肿瘤的形成相关[58,67,68]。除S100G(Calbindin D9k)

是单体构型外，其他S100 蛋白组织形式为紧密的同

源二聚体[69]，每个亚基由 C端“经典的”EF-hand结

构和 N特有的“假的”EF-hand 结构组成。结合钙离

子以后，C端发生一个大的构象变化，暴露出与靶蛋

白作用的疏水表面。S100 的受体蛋白包括酶和非酶蛋

白：S100B 和S100A1 调节涉及能量代谢和信号传导

的蛋白酶；S100A8 和S100A9 调节某些激酶，S100A10

调节 PLA2，S100A11 调节ATPase；S100 蛋白家族中

的25 个成员中的13 个与细胞骨架蛋白相互作用，进

而调节它们的聚集或者磷酸化状态；有些 S100 蛋白

和转录因子相互作用。S100 蛋白功能的多样性与它们

在何种类型的细胞内表达、浓度、细胞内的定位、和

靶蛋白的协同表达、与不同金属离子结合的性质

(Ca2+，Zn2+和Cu2+)、形成同源、异源、低聚物的能力

等息息相关。S100 蛋白还可以被运输排放到细胞外，

激活细胞表面受体[70]。晚期糖化物终极受体(RAGE)

是细胞表面受体之一，在糖尿病患者中具有异常高的

含量。许多 S100蛋白可以和 RAGE 作用，包括

S100A1、S1 00A2、S100A4、S100A5、S100A6 、10 0A7、

S100A8/A9、S100A11、S100A12 和S100B 等[71]，通

过RAGE 信号通路引起细胞因子和趋化因子的细胞外

活性。S100-S100A8/S100A9 异二聚体被称作钙网蛋白

(CP)，在某些白血球细胞中被大量表达。CP 直接和=

炎症及先天性免疫应答相关，在类风湿性关节炎、慢

性支气管炎，AIDS、糖尿病和癌症患者中含量较高[72]。

研究证实，在金黄色酿脓葡萄球菌引起的脓肿中，CP

可以通过螯合Zn2+和Mn2+引起有效地抗菌活性[73]。最

新研究发现 S100A8/S100A9 通过一个金属离子介导

的淀粉蛋白寡聚化和纤维化过程参与淀粉样蛋白的形

成[74]。由于 S100 蛋白家族和人类疾病如，癌症、神

经退行性疾病、心肌疾病等的密切联系，近年来它们

受到越来越多的关注，S100 蛋白对于疾病诊断和作为

潜在的药物靶点的价值也日益增加[68]。

5.3. NCS蛋白家族

NCS 蛋白家族根据氨基酸序列分为五个亚家族，

分别命名为A-E。尽管它们也含有 4个EF-hand 结构，

但CaM 的同源性非常低，EF1 由于 EF 环氨基酸的非

活性替换丧失了结合钙离子的功能。NCS蛋白家族的

结构非常相似，与结合了钙离子的CAM 哑铃状的构

象不同，它们在结合了钙离子以后结构更加紧密、趋

于球形。所有哺乳动物的的NCS A-D亚家族蛋白的N

端都豆蔻酰化，有些NCS蛋白如recoverin和NCS B

亚家族蛋白只有结合了钙离子以后才暴露出肉豆蔻酰

基团。NCS 具有一些独特的功能，可以通过十四酰基

团锚泊在膜表面[75]。NCS 蛋白主要在神经元细胞、心

脏细胞和视网膜感光细胞中表达，参与调节神经元和

视网膜感光器内许多细胞进程。Recoverin 和GCAPs

只在视网膜内有表达，这两个亚家族蛋白对光适应有

特有的调节作用；KChIPs亚家族的所有成员都能与

DNA 中的下游调节元件(downstream regulator element,

DRE)序列结合并抑制他们的转录。 NCS-1 被认为是

NCS 蛋白家族的原始蛋白之一，在不同的物种中序列

具有高度保守性。与 CaM 相比，NCS-1对Ca2+具有

更高的亲和力，可以对更低浓度的 Ca2+做出响应。

NCS-1 参与调解神经信号传导，轴突的分支，与学习

记忆有关的树突可塑构型。NCS-1 能与多巴胺D2受

体直接作用并抑制受体由于内化而产生的脱敏反应，

NCS-1 表达水平的波动可能会引起多巴胺系统活动异

常，导致一些精神性和神经性疾病的发生。NCS-1 可

能与自闭症有关，一个 NCS-1 的错义突变(R102Q)在

一个自闭症患者中被发现[75]。NCS-1的表达水平降低

会引起精神病[76]，而NCS-1表达水平的升高会导致心

率失常[77]。

6. 展望

EF-hand 蛋白参与了细胞的多种生理、病理的调

控，多年来引起了极大的关注并进行了大量的研究。

迄今为止，在人体内共发现242 个EF-hand 蛋白，同

时，从其他物种中确定的 EF-hand 蛋白也已超过 600

个，研究领域囊括了 EF-hand 蛋白的结构与功能、定

位、动力学、热力学、致病机理等内容。但是，大量

的研究都集中在模型蛋白如CaM、TnC 和Calbindin

D28k 等，其他EF-hand蛋白相对来说获得的关注非常

少；另一方面，许多数据还不完善，只有非常少的结

合和未结合钙离子形式的 EF-hand 蛋白高分辨率的 X

EF-Hand 蛋白研究进展

射线晶体结构得到了解析，这对于进一步研究它们的

功能和致病机理造成了阻碍。因此，EF-hand 蛋白家

族还有许多广阔的未知领域等待我们去发掘，要阐明

EF-hand 蛋白家族的调节机制依旧任重道远。

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