 Bioprocess 生物过程, 2013, 3, 17-22 http://dx.doi.org/10.12677/bp.2013.32003 Published Online June 2013 (http://www.hanspub.org/journal/bp.html) Effects of Different Light Quality on Growth Rate and Accumulation of Organics in Botryococcus braunii Xudan Zhu, Lan Ye, Jianxiang Xu, Huahong Huang, Erpei Lin* Forestry and Biotechnology College, Zhejing Agriculture and Forestry University, Lin’an Email: *zjulep@hotmail.com Received: Sep. 21st, 2012; revised: Sep. 25th, 2012; accepted: Dec. 20th, 2012 Copyright © 2013 Xudan Zhu et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unre- stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: In this study, the influence of different light qualities on growth and organics contents of Botryococcus braunii 357 were investigated. Seven light qualities including white, red, blue, mixed light 1 (red:blue = 4:1), mixed light 2 (red:blue = 2:1), green and yellow were used. The results showed that the cell density and biomass of B. braunii 357 were higher under blue light than the other lights, which were 1.31 (OD680) and 2.56 g·L−1, respectively. The high- est polysaccharide content was observed under white light, reaching to 0.94%; the highest soluble protein was shown under red light, reaching to 0.51%. The content of Chlorophyll and carotenoids under mixed light1 was up to 1.84% and 1.07%, which were significantly higher than other light. Total lipids and total hydrocarbons of B. braunii 357 under mixed light 1 were 25.02% and 25.10% respectively, which were significantly higher than the other light quality. These results will facilitate photobioreactor’s development, growth regulation and large scale cultivation of B. braunii in the future. Keywords: Botryococcus braunii; Light Quality; Growth Rate; Organics 不同光质对布朗葡萄藻生长、有机物质积累的影响 朱旭丹，叶 岚，许建香，黄华宏，林二培* 浙江农林大学林业与生物技术学院，临安 Email: *zjulep@hotmail.com 收稿日期：2012 年9月21 日；修回日期：2012年9月25 日；录用日期：2012 年12 月20日 摘 要：本论文以布朗葡萄藻(Botryococc us br au ni i )357株为材料，研究了 7种光质白光、红光、蓝光、混光 1(红: 蓝 = 4:1)、混光 2(红:蓝 = 2:1)、绿光及黄光对藻细胞生长和胞内几种有机物质含量的影响。结果表明：在 7种 光质培养下，细胞密度和生物量在蓝光下最高，OD680 和干重分别可达到 1.31 和2.56 g·L−1，高于其他光质；多 糖含量在白光下最高，其含量达到 0.94%；可溶性蛋白含量在红光最高，为 0.51%；叶绿素和类胡萝卜素的含量 则在混光 1下最高，分别达到 1.84%和1.07%；在混光 1下的总脂和总烃含量最高，分别为25.02%、25.10%， 高于其他光质。这些结果将为布朗葡萄藻光生物反应器的开发，及其生长调控与大规模培养提供依据。 关键词：布朗葡萄藻；光质；生长；有机物质 1. 引言 随着全球能源短缺和环境问题的日益严峻，寻找 和开发清洁、可再生的生物能源，已成为重要的研究 课题。藻类，尤其微藻，种类繁多、分布极其广泛， 与农作物相比，具有光合作用效率高、环境适应能力 *通讯作者。 Copyright © 2013 Hanspub 17  不同光质对布朗葡萄藻生长、有机物质积累的影响 强、生长周期短、生物产量高、可以保持碳平衡等特 点[1]。利用微藻制备生物能源具有良好的前景和战略 意义。布朗葡萄藻(Bot ryococcus braunii )，隶属于绿藻 门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae) 、绿球藻目 (Chlorococcales)、葡萄藻科(Botryococcaeae)、葡萄藻 属(Botryococcus)，是一种世界性分布的淡水单细胞微 藻[2]。布朗葡萄藻又被称为“油藻”，含有较高的胞外 多糖、脂肪酸，尤其是含烃量最高可达细胞干重的 85%，且其所产烃的组成和结构与石油极其相似[2,3]。 由于具有生产石油替代品应用价值，布朗葡萄藻的研 究日益受到重视[4]。 目前，有关布朗葡萄藻的研究主要集中在培养条 件、烃类提取方法、以及生长和代谢的调控[5-13]。如 Ranga RA 等对在露天跑道池和环形池中培养的布朗 葡萄藻的生长、烃类含量进行了系统的分析和比较， 发现在培养 18 d 后，其生物量和烃类含量都会增加， 其最高的生物量和烃类含量分别达到2g·L−1和28%， 添加 0.1%的NaHCO3能够提供生物量和烃类的含量 [5]。Magota A等通过研究发现，利用己烷从布朗葡萄 藻中提取烃类时，预先进行热处理能够减少提取过程 中烃类的损耗，平均的烃类提取效率能够达到90%[6]。 在生长代谢调控方面的研究主要与培养基中营养成分 相关。Song L等对铁、锰、钼和镍这四种微量元素在 布朗葡萄藻培养中的作用进行了系统研究，找到了培 养基中这四种微量元素的最佳浓度和组合，认为这些 元素能够促进葡萄藻的生长[7]。胡章喜等研究发现硝态 氮对布朗葡萄藻 764、765 的生长、总脂和总烃含量有 明显的促进，是这两株葡萄藻培养较为理想的氮源[12]。 光照条件是调节藻类生长代谢的基本因子之一， 研究表明光照强度、光质对藻类的生长、形态结构、 光合作用和物质代谢都具有重要的作用，大多数生物 合成过程能通过改变光照条件进行调节[14-17]。沈银武 等对中华植生藻的研究发现，白光和黄光下生长最 快，在黄光下叶绿素等色素含量最高，而在绿光下固 氮酶活性最高[14]。杜晓凤等以微绿球藻为材料，研究 了光照强度对生长和有机物质积累的影响，发现在 1000~10,000 lx的范围内，微绿球藻的生长、可溶性 蛋白、类胡萝卜素的含量随着光照强度的增加而增加 [15]。但光照条件，特别是光质对布朗葡萄藻生长及物 质积累影响的研究尚未开展，有待深入探讨。因此， 本研究以 B. braunii 357为材料，分析了红、蓝等 7 种不同光质对的生长、有机物质积累的影响，期望通 过本研究为布朗葡萄藻的光生物反应器的开发，及其 生长调控与大规模培养提供依据。 2. 材料与方法 2.1. 试验藻种 布朗葡萄藻 FACHB-357 株由中国淡水藻种库提 供。 2.2. 培养基 实验采用 BG-11培养基，配方参考 Rao AR等[13]。 2.3. 培养方法 将培养至对数生长期的藻种转接含新鲜无菌培 养基的三角瓶中，使其初始OD680 约为 0.1，用可透 过无菌空气的封口膜包扎，分别置于白光、黄光(590 nm)、绿光(518 nm)、蓝光(463 nm)、红光(620 nm)、 混光 1(红光:蓝光 = 4:1，634 nm)、混光 2(红光:蓝光 = 2:1，633 nm)7 种不同的 LED 光源下进行培养(所用灯 具由杭州汉徽光电科技有限公司提供)，光照强度约 85 μmol · m−2·s−1，光暗周期 16:8，温度 25℃ ± 1℃， 实验设置 3个平行。 2.4. 测定指标和测试方法 2.4.1. 细胞生长的测定 每隔 48 h取样，用紫外分光光度计测定藻液在 680 nm波长处的吸光值，测到平台期为止，用 OD680 变化表征细胞的生长情况。 2.4.2. 生物量测定 在生长末期，取一定体积的藻液，10,000 rpm离 心10 min，收集藻细胞，双蒸水洗涤两次后10,000 rpm 离心 5 min，称重后计算鲜重；将藻体 80℃干燥 1 d， 称重计算其干重，以单位体积鲜重和干重来表示其生 物量。 2.4.3. 多糖含量的测定 采用蒽酮法进行多糖测定[18]。准确称取 0.10 ± 0.01 g藻粉于 10 mL离心管中，加入2 mL蒸馏水， 在快速混匀器上混匀后，加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯 (2%)和5 mL 浓硫酸，充分混匀，沸水浴 5 min，冷却 Copyright © 2013 Hanspub 18  不同光质对布朗葡萄藻生长、有机物质积累的影响 至室温后，在 620 nm波长下测其 OD 值。以葡萄糖 为对照做标准曲线，测得藻细胞多糖含量，每种光质 至少采用三个平行实验。 2.4.4. 可溶性蛋白含量的测定 准确称取0.10 ± 0.01 g藻粉于10 mL 离心管中， 加入 2 mL 蒸馏水，在混匀器上混匀后，置于−20℃冰 箱中反复冻融三次，再加入2 mL蒸馏水，离心收集 上清，残渣加适量蒸馏水重复离心，合并上清液，定 容到 10 mL，每种光质采用三个平行。以牛血清蛋白 为对照做标准曲线，采用 Bradford 法测定蛋白含量 [19]。 2.4.5. 叶绿素含量的测定 准确称取0.10 ± 0.01 g 藻粉于具塞试管中，加入 1 mL 蒸馏水，在混匀器上混匀后，置于−20℃冰箱中 反复冻融三次。加入 5 mL，80 %的丙酮，混匀后置于 4℃冰箱内提取过夜，8000 rpm 离心 5 min，取上清于 25 mL 容量瓶中定容，用 Arnon 法测定色素含量[20]。 2.4.6. 总脂含量测定 参照胡章喜等[12]的干重法。称取一定量干藻粉用 蒸馏水悬浮，加入6 mL甲醇/氯仿混合液(2:1，体积 分数)振荡 2 h，离心，将氯仿层转移至预先称重的螺 口试管中，60℃下用氮气将氯仿吹干，称重。螺口试 管前后质量之差即为总脂质量，按照以下公式计算总 脂百分含量： 总脂百分含量 = (总脂质量/藻粉质量) × 100% 2.4.7. 总烃的测定 参照胡章喜[12]的方法。称取一定质量的藻粉，加 入15 mL 正己烷在研钵中充分混匀，然后离心，收集 正己烷提取液。将沉淀物重复上述过程 2次以上，收 集所有的正己烷提取液，转移至预先称重的螺口试管 中，然后在室温下用氮气将正己烷吹干，称重。螺口 试管前后质量之差即为总烃质量，用以下公式计算总 烃百分含量： 总烃百分含量 ＝ (总烃/干藻重) × 100% 2.5. 数据分析 使用 Excel 和 SPSS11.5软件对所有数据进行统 计分析。 3. 结果分析 3.1. 不同光质对布朗葡萄藻细胞密度的影响 布朗葡萄藻 357在7种不同光质下表现出不同的 生长规律(图1)。在培养的初期(8 d)，各个光质下布朗 葡萄藻 357 的生长差异不明显；8 d后，绿光和黄光 下其生长明显比其他光质下的慢，并在整个生长周期 维持较慢的生长速度；12 d 后，在蓝光、红光、白光 和混光下的布朗葡萄藻357 进入对数生长期，而在对 数生长的中期开始，混光 2下布朗葡萄藻 357的生长 明显变慢，而蓝光下的生长最快，到生长末期 OD680 最高达到1.31。而就单色光来讲，布朗葡萄藻 357 在 蓝光下生长最快，红光较快，绿光次之，黄光下最慢。 这说明蓝光有利于布朗葡萄藻357 的生长。苗红利等 在中肋骨条藻[21]，以及 Jean-Luc Mouget等在硅藻多 痂哈斯来藻(Haslea ostrearia)[22]的研究中也有类似的 结果，发现蓝光的效果最好，红光和绿光效果较差。 3.2. 不同光质对布朗葡萄藻的生物量的影响 布朗葡萄藻 357在红、蓝等 7种光质下生长 48 d 后，分别测定其单位体积的鲜重和干重(图2)。实验 结 果表明，布朗葡萄藻 357 在白光和蓝光下的鲜重最高， 分别达到21.46 g·L−1和20.33 g·L−1，显著高于其他光 质(p < 0.05)，但这两者间没有显著差异，鲜重的结果 基本反映了生长曲线的生长规律。干重检测结果表 明，布朗葡萄藻357 在蓝光下的干重最高，达到2.56 g·L−1，白光下的干重次之，达到2.12 g·L−1，显著高于 Figure 1. OD680 of B. braunii 357 under different light qualities 图1. 不同光质下布朗葡萄藻 357 的OD680 Copyright © 2013 Hanspub 19  不同光质对布朗葡萄藻生长、有机物质积累的影响 Figure 2. The biomass of B. braunii 357 under different light quali- ties 图2. 不同光质下布朗葡萄藻 357 的生物量 其他光质(p < 0.05)。这些结果表明，蓝光可能更有利 于葡萄藻生物量的积累。 3.3. 不同光质对藻细胞有机物质含量的影响 将在不同光质下培养 48d的葡萄藻 357，收集烘 干后用于藻体有机物质含量的测定。由图 3可以看出， 白光和蓝光下多糖含量较高，干重含量分别为 0.94% 和0.91%，黄光下多糖最低，为 0.43%，而其他光质 下多糖含量也显著低于白光和蓝光(p < 0.05)。这与藻 生长速率、生物量的结果基本一致，说明白光和蓝光 下有利于藻细胞内细胞多糖的积累，而在其他光质， 尤其混光，尽管生长速率较快，但物质可能并没有转 化成多糖。 对可溶性蛋白的检测表明，在红光、白光和蓝光 下藻体蛋白质含量明显高于其他光质(p < 0.05)，分别 达到 0.51%、0.49%和0.48%，而在黄光下藻体蛋白含 量最低，仅为 0.10%(图4)。与多糖含量相比，相对于 白光和蓝光，红光可能有促进蛋白质在藻细胞内的积 累作用，而在混合光质下，由于红光和蓝光的交互作 用，反而不利于蛋白质的积累，因而含量较低。 由图 5可知，叶绿素和类胡萝卜素的含量均在混 光1下最高，分别达到 1.84%和1.07%；在红光下次 之，分别为 1.50%和0.938%；这两种光质明显高于其 他光质(p < 0.05)，蓝光下其色素含量也较其他光质要 高，而在黄光下色素含量最低。这说明红光、蓝光及 红蓝混合的光质可能有利于叶绿体的发育，相应的使 Figure 3. The content of ploysaccharide of B. braunii 357 under different light qualities 图3. 不同光质下布朗葡萄藻 357 的多糖含量 Figure 4. The content of soluble protein of B. braunii 357 under different light qualities 图4. 不同光质下布朗葡萄藻 357 的可溶性蛋白含量 Figure 5. The content of Chlorophyll and ca rotenoids of B. braunii 357 under different light qualities 图5. 不同光质下布朗葡萄藻 357 的叶绿素和类胡萝卜素含量 Copyright © 2013 Hanspub 20  不同光质对布朗葡萄藻生长、有机物质积累的影响 其 藻357 在红、蓝等 7种光质下培养 48 d 后， 异 蓝等 7种光质下培养 48 d 后， 结论 光照条件是影响藻类生长的主要环境条件，光照 对微 的生 680 2 2 布朗葡萄藻有机物质的积累有显著 的影 藻体内的色素含量较高。但比较生物量和多糖含量 的结果，单独的红光、蓝光或混光下藻体的光合效率 可能都没有白光下高，因而其生物量和多糖的量较白 光下要低。 布朗葡萄 分别测定其总脂含量(图6)。实验结果表明，布朗 葡萄藻 357 在混光1、蓝光和红光下的总脂含量较高， 分别达到 25.02%、23.70%和24.23%，但这三者间没 有显著差，而其他光质下的总脂含量平均只有 18% 左右，与前三者间存在极显著差异(p < 0.01)。这些 结 果表明，蓝光、红光，或蓝光比例较低的混光 1能够 促进葡萄藻总脂的积累。 布朗葡萄藻 357在红、 分别测定其总烃含量(图7)。实验结果表明，布朗 葡萄藻 357 在混光1、蓝光和红光下的总烃含量较高， 分别达到 25.10%、22.50%和23.62%，而其他光质下 的总烃含量平均只有 16%左右。方差分析的结果表 明，布朗葡萄藻357 在混光1下的总烃含量高于其他 光质，差异显著(p < 0.05)。这些结果表明，蓝光、红 光，或蓝光比例较低的混光 1能够促进葡萄藻总烃的 积累。 4. 藻的生长和有机物质的积累有着重要影响[23-25]。 布朗葡萄藻 357 在白光、混光 1、蓝光和红光下 长较快，生物量较高，这与绿色植物光合作用最佳光 质情况基本一致。其中，布朗葡萄藻 357在蓝光下细 胞密度最高，培养 48 d 后OD 可达到 1.31；在蓝光 下的干重最高，达到 2.56 g·L−1，高于其他光质。最近 的研究[26]表明在蓝光下布朗葡萄藻(Race B)的CO固 定效率高于红光，而本研究中布朗葡萄藻357 的干物 质量积累最多，说明蓝光能够 CO的吸收，增加物质 的代谢积累。 不同光质对 响，白光和蓝光有利于多糖的积累，其含量分别 达到 0.94%和0.91%。可溶性蛋白含量在红光和白光 最高，分别为 0.51%和0.49%；而叶绿素和类胡萝卜 素的含量则在混光 1下最高，分别达到 1.84%和 1.07%。进一步的检测表明，布朗葡萄藻 357在混光 1 和红光下，总脂和总烃的含量均较高，其在混光 1和 Figure 6. The content of total lipids of B. braunii 357 under differ- ent light qualities 图6. 不同光质下B. braunii 357的总脂含量 Figure 7. The content of total hydrocarbons of B. braunii 357 un- 光下的总脂含量分别达到 25.02%和24.23%，总烃 累有 到了浙江省大学生科技创新 项目 （20 参考文献 (References) ah, D. J. Lee and J. S. Chang. der different light qualities 图7. 不同光质下布朗葡萄藻 357 的总烃含量 红 含量分别达到 25.10%和23.62%。说明这两种光质对 布朗葡萄藻的脂类代谢有重要的调控作用，且不同比 例的红蓝混光对其总脂和总烃的积累有不同的效应。 不同的光质对布朗葡萄藻的生长或有机物质积 不同的效应，工业化生产时可根据不同的需求选 择不同的光质或光质的组合。 5. 致谢 本项目得 11R412004）的资助，在此表示感谢！ [1] C. Y. Chen, K. L. Yeh, R. Aisy Copyright © 2013 Hanspub 21  不同光质对布朗葡萄藻生长、有机物质积累的影响 Copyright © 2013 Hanspub 22 and U. C. Banerjee. Bo tzger, C. Largeau. Botryococcus braunii: A rich source for T. R. Shamalab and G ati Imou. Effect of u- th characteristics of Botryococ- 夜光. 几种主 . N、P营养盐胁迫对两株布朗葡萄藻 养 李爱芬, 张 . Shamala and G. A. Cultivation, photobioreactor design and harvesting of microal- gae for biodiesel production: A critical review. Bioresource Technology, 2011, 102(1): 71-81. [2] A. 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