 Advance in Microbiology 微生物前沿, 2013, 2, 57-64 http://dx.doi.org/10.12677/amb.2013.22012 Published Online June 2013 (http://www.hanspub.org/journal/amb.html) Establishment and Primary Application of Fluorescence Quantitive PCR for Detection of Vi brio parahaemolyticus* Fande Kong1#, Yujuan Wu1,2, Xinxin Huang3, Biaomin Huan4, Xiaoli Peng1, Shufei Xu1, Li Lin1 1Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 2Biological Engineering Institute, Jimei University, Xiamen 3Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University Zhejiang, Jiaxing 4Animal Husbandry and Aquatic Products Bureau of Xinluo District in Longyan Prefecture, Longyan Email: #kfd67@sina.com Received: Dec. 27th, 2012; revised: Mar. 22nd, 2013; accepted: Apr. 5th, 2013 Copyright © 2013 Fande Kong et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unre- stricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract: Objective: The study developed a SYBR Green Ι real time quantitative PCR for Vibrio parahaemolyticus (VP). Method: According to genome sequences within toxR of VP published in GenBank, a pair of primers was designed by primer6.0. The reaction conditions, sensitivity and specificity of the method were optimized and evaluated. The method was also applied to clinical samples. Result: It was shown that the optimal primer concentration was 0.2 µmol/L. The results also demonstrated that standard curve established was shown a fine linear relationship between threshold cycle and template concentration. The correlation coefficient R2 was 0.996, the efficiency of amplification in E was close to 100%, the dissolution curves were specific and the minimum detectable amount was 2.14 copies. This method has better specificity and reproducibility. The coincidence rate was 100% when compared the results to routine separation and assay method. Conclusion: A SYBR Green 1 fluorescent quantitative PCR for detecting toxR gene of VP was devel- noped which could be very useful for identification and inspection of VP from fishery product in import and export. Keywords: Vibrio parahaemolyticus; Fluorescence Quantitive PCR 荧光定量 PCR 技术检测副溶血弧菌方法的建立与初步应用* 孔繁德 1#，吴玉娟 1,2，黄新新 3，黄标敏 4，彭小莉 1，徐淑菲 1，林 立1 1厦门出入境检验检疫局，厦门 2集美大学生物工程学院，厦门 3浙江清华长三角研究院，嘉兴 4龙岩市新罗区畜牧水产局，龙岩 Email: #kfd67@sina.com 收稿日期：2012 年12 月27 日；修回日期：2013 年3月22 日；录用日期：2013 年4月5日 摘 要：目的：建立副溶血弧菌 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 检测方法。方法：根据副溶血弧菌(VP)的toxR 基因序列，应用 primer6.0 设计了 1对特异性引物，进行了最佳引物浓度的确定，建立了标准曲线和溶解曲线， 对所建立方法进行了特异性、灵敏度和稳定性测试，并进行了临床样本检测。结果：副溶血弧菌SYBR Green I 荧光定量 PCR 的最佳引物浓度为 0.2 µmol/L，标准曲线循环阈值和模板浓度呈良好的线性关系，相关系数 R2 为0.996，扩增效率 E接近 100%，溶解曲线特异，最低检出量为 2.14 个拷贝，特异性和重复性较好。临床检测 结果与常规细菌分离鉴定方法符合率 100%。结论：建立了特异灵敏的副溶血弧菌实时荧光定量PCR 检测方法， 对于加强进出口水产品中 VP 的检验检疫具有十分重要的意义。 *基金项目：国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2010IK016)，浙江省自然科学基金(LY12C01001)。 #通讯作者。 Copyright © 2013 Hanspub 57  荧光定量 PCR 技术检测副溶血弧菌方法的建立与初步应用 Copyright © 2013 Hanspub 58 关键词：副溶血弧菌；荧光定量 PCR 1. 引言 副溶血弧菌(Vibrio parah aemolyticus，简 称VP)是 一种广泛分布于海洋和盐湖中的革兰氏阴性嗜盐性 弧菌，是我国沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要病 原菌[1-4]。目前检测 VP的常用方法有灵敏度低且费时 费力的细菌分离培养法[5]，需要的实验步骤较多、操 作周期长(一般需要 4~7 d)，大大影响了现阶段进出口 动物及其产品的快速验放需要，同时制约了企业开展 微生物污染检测的持续性，也不利于检测机构和政府 部门定期开展对该微生物的监控。检测 VP 的常用方 法还有酶联免疫吸附技术[6,7]；对仪器设备实验操作要 求较高的 PCR检测技术[8-10]和DNA 指纹图谱技术[11] 等。 荧光定量 PCR 是近年来发展起来的分子生物学 技术，具有灵敏度高、专一性强、检测速度快、可实 时定量、操作简便和污染少等优点，主要包含探针法 和染料法。以分子信标或TaqMan 探针等为基础的荧 光定量 PCR 已被成功地应用于检测VP[12-15]。但探针 法对引物及探针的设计和使用要求较高。SYBR Green I染料法利用 SYBR Green I荧光染料与双链 DNA 分 子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，以扩增子 的熔解温度(Tm)确定 PCR反应的专一性，其优势在 于：无需设计和优化荧光探针，方法适用性较好，操 作更简单，且价格相对较低。目前，国内应用 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 VP 没有报道，本文以 VP ToxR 基因为靶基因，构建快速检测 VP 的SYBR Green I荧光定量 PCR 技术，旨在为水生动物及其产品中快 速高效检测 VP 提供一种更加简便快速和特异灵敏的 技术手段。 2. 材料与方法 2.1. 实验材料 2.1.1. 实验菌株 VP、溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门氏菌、 枸橼酸杆菌等 6个菌株均由厦门出入境检验检疫局检 验检疫技术中心动检实验室提供。 2.1.2. 仪器和试剂 荧光定量PCR仪为美国 PE 公司生产的型号为 ABI 9300的PCR 仪；凝胶成像分析系统，为美国伯 乐公司生产的 GelDoc XR产品；3.5%碱性蛋白胨水、 营养琼脂和 TCBS 琼脂为北京陆桥技术有限责任公司 产品；细菌DNA 提取试剂盒(TaKaRa Code: DV810A) 和SYBR Green I荧光定量 PCR 反应试剂盒(SYBR® Premix DimerEraserTM)，购自大连宝生物工程有限公 司；DNA Mark(MD101-01)，购自天根生化科技(北京) 有限公司。 2.1.3. 引物设计与合成 参照 GenBank 上发表的VP 的toxR基因序列 (AB300869.1)，应用 primer2.0 设计一对特异性引物， VP PCR扩增片段大小为 208 bp，由上海鼎安生物科 技有限公司合成。引物序列如下： VP(ToxR)F1: 5’-CGAAAGCCGTATACTCCTGA- TG-3’ VP(ToxR)R1: 5’-GAGTTGATAGCCTCGTTTTG- GA-3’ 2.2. 实验方法 2.2.1. SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 VP 的 反应体系的建立 将VP 菌株接种到 3.5%碱性蛋白胨水中，过夜培 养18~24 h后，用 Takara 的细菌 DNA 试剂盒提取菌 体DNA 模板溶液，进行荧光定量 PCR 扩增。反应体 系为 25uL，具体如下：SYBR® Premix Ex TaqTM(2×) 12.5 µl，ROX Reference Dye(50×)0.5 µl，5 μmol/L 的 上下游引物各 1 μL，ddH2O 8 μL，DNA 模板 2 μL。 扩增条件为：95℃预变性 30 s；95℃变性 5 s，60℃退 火31 s，循环40次，在60℃退火 31 s处采集荧光信 号；并在上述扩增条件后增加 60℃~95℃的融解曲线 步骤。取 PCR 扩增产物 5 µL进行琼脂糖(2%)电泳检 测扩增结果。 2.2.3. 最佳引物浓度的测定 对该方法的最佳引物浓度优化测定，反应体系： 25 µl  荧光定量 PCR 技术检测副溶血弧菌方法的建立与初步应用 PCR 反应液组分如下： SYBR® Premix Ex TaqTM(2×) 12.5 µl ROX Reference Dye(50×) 0.5 µl DNA 模板 2 µl VP 上游引物 5 µmol/L分别为2 µl，1.5 µl，1 µl 和0.5 µl，引物终浓度分别为0.4 µmol/L，0.3 µmol/L， 0.2 µmol/L和0.1 µmol/L，下游引物同上游引物，剩 余体积用灭菌超纯水补足。 反应条件：采用两步法 PCR 扩增标准程序，95 ℃预变性 30 s；95℃变性 5 s，60℃退火 31 s，循环40 次，在 60℃退火31 s 处采集荧光信号；并在上述扩增 条件后增加 60℃~95℃的融解曲线步骤。 2.2.4. 灵敏度检测 取37℃培养 18h的VP 菌液，用0.85%生理盐水 做10 倍梯度稀释，稀释至 10 −9，各稀释度菌液采用 平板计数法计数，具体操作参照国标法(GB/T 4789.2-2003)进行细菌计数，然后取 1mLVP菌液原液， 采用 Takara 的细菌 DNA 提取试剂盒提取 VP 的DNA， 做10 倍梯度稀释，稀释至 10 −7，最后用用优化好的 荧光定量 PCR 体系进行检测，以验证所建立的方法在 检测 VP 的灵敏度效果。 2.2.5. 特异性测定 提取 VP、溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙 门氏菌、枸橼酸杆菌等细菌的DNA，利用所建立的最 佳反应条件分别进行荧光定量PCR 检测，以验证此方 法对 VP 检测的特异性。 2.2.6. 稳定性测定 按照以上摸索的最优条件将该荧光定量 PCR 反 应体系的试剂(除了模板)混合制成检测试剂盒，分装 −20℃中冻存，每隔一个月取出两管，加入刚提取的 VP DNA 模板，按照最佳反应条件进行光定量 PCR 检 测，根据扩增效果判定所建立方法的在一定时间内的 稳定性。 2.2.7. 与普通PCR 进行比较 将VP 荧光定量 PCR 的引物用于建立VP 普通 PCR 扩增，扩增体系为25 µL，包括 2 µLVP DNA模 板，10 × PCR Buffer 2.5 µL，2.5 mM dNTP 1 µL，25 mM MgCL2 2 µL，20 µM的上下游引物各 0.5 µL，5 U/µL Taq 酶0.5 µL，不足体积补超纯水。具体反应条 件为 94℃预变性 5 min；95℃，45 s，56℃退火 45 s， 72℃延伸 60 s，35个循环后 72℃延伸 10 min。将荧 光定量 PCR反应产物，取5 µL进行琼脂糖(2.5%)电 泳检测扩增结果，比较二者的灵敏度。 2.2.7. 临床应用 进口冷冻带鱼、鱿鱼和墨鱼，活甲鱼、甲鱼蛋、 螃蟹和虾等 100 份样品，用荧光定量 PCR 技术检测， 同时与传统检测方法进行比较。 3. 结果与分析 3.1. VP 菌液浓度 经过细菌计数，用于建立荧光定量PCR 检测 VP 方法的 VP 菌液浓度为1.5 × 108 cfu/ml。 3.2. 最佳引物浓度的测定 在荧光定量 PCR反应体系中，加入的 VP 上下游 引物终浓度为 0.4 µmol/L时反应的溶解曲线可见到有 非特异性扩增(见图 1(a))和二聚体(见图 1(b))；终 浓 度 为0.3 µmol/L时也有较弱的非特异性扩增(见图1(c)) 和二聚体(见图 1(d))；终浓度为0.2 µmol/L时扩增曲 线无非特异性扩增(见图 1(e))和无二聚体(见图 1(f))； 终浓度为 0.1 µmol/L时虽然无非特异性扩增和无二聚 体，但检测灵敏度只到10 −5 cfu/ml，即 21.4 cfu/25 µl 体系，检测灵敏度较低(见图1(g)和图 1(h))。确定最 佳引物浓度为 0.2 µmol/L。 3.3. 灵敏度的测定 经检测，建立的 VP荧光定量 PCR 检测方法的灵 敏度可达到 1.5 × 102 cfu/ml，即 2.14 cfu/25 µl体系， 该方法的灵敏度较高，如图1(e)、图 1(f) 。 从电泳图 2可以清晰的看出，普通 PCR 检测VP 的灵敏度为 1.5 × 103 cfu/ml，即 21.4 cfu/25 µl体系。 试验证明荧光定量 PCR 的灵敏度明显比普通 PCR 高 10 倍。 3.4. VP 荧光定量PCR 方法的标准曲线 将计数好的 VP 菌液进行 10 倍梯度稀释，稀释成 1.5 × 101 cfu/ml到1.5 × 10−6 cfu/ml六个梯度，提取细 菌DNA 用于 VP 荧光定量 PCR 扩增制作标准曲线， 以验证建立的荧光定量PCR 方法在检测 VP 方面的质 Copyright © 2013 Hanspub 59  荧光定量 PCR 技术检测副溶血弧菌方法的建立与初步应用 Copyright © 2013 Hanspub 60 (a) (b) (c)  荧光定量 PCR 技术检测副溶血弧菌方法的建立与初步应用 (d) (e) (f) Copyright © 2013 Hanspub 61  荧光定量 PCR 技术检测副溶血弧菌方法的建立与初步应用 Copyright © 2013 Hanspub 62 (g) (h) Figure 1. Optimization of various primer concentrations: (a), (c), (e), (g) are amplification plots at primer concentrations of 0.4, 0.3, 0.2 and 0.1 µmol/L respectively. (b), (d), (f), (h) are melting curves at primer concentrations of 0.4, 0.3, 0.2 and 0.1 µmol/L respectively. The amplifi- cation plots (a), (c), (e), (g) shown from left to right and the melting curves (b), (d), (f), (h) shown from up to down are the curves of decreas- ing concentrations of VP from 1.5 × 10−1 cfu/ml to 1.5 × 10−6 cfu/ml of the template in a serial 10 - fold dilution. 图1. 最佳引物浓度的测定：(a)、(c)、(e)和(g)为不同引物浓度下的 VP 荧光定量 PCR 扩增结果；(b)、(d)、(f)和(h) 为不同引物浓度下的VP 荧光定量PCR扩增的溶解曲线。图中不同扩增曲线为VP菌液不同稀释度(1.5 × 10−1 cfu/ml 到1.5 × 10−6 cfu/ml) 提取的 DNA模版的扩增曲线。 量。从图 3可以看到，在 36 个CT 值内进行定量 PCR 检测，以 VP 标准菌株拷贝数的对数为 X轴、CT值 为Y轴绘制标准曲线，其相关系数R2为0.996，具有 较好的线性关系。 3.5. 特异性的测定 用VP 引物建立的荧光定量PCR 检测副溶血弧 菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门氏菌、枸 橼酸杆菌，结果显示只有副溶血细菌有扩增曲线，其 他菌没有扩增曲线，说明该方法特异性良好(如图 4(a) 和4(b))。 3.6. 稳定性测定 检测期间将预先混合、分装好的检测试剂放置 −20℃条件下保存 10 个月后仍能扩增出清晰的特异性 扩增曲线，说明本试剂稳定性好。  荧光定量 PCR 技术检测副溶血弧菌方法的建立与初步应用 Figur Sensitivity of traditional PCR: M 100 bp DNA ladder; 1 s of decreasing concentrations of VP at 1.5 × 10−1, 1.5 × 10, 1.5 × 10−3, 1.5 × 10−4, 1.5 × 10−5 and 1.5 × 10−6 cfu/ml, lank control; NG Negative control M为100bp DNA Marker， 图中 1~6 为VP 模板对应的菌液浓度分别为 1.5 × 10−1 cfu/ml、 1.5 × e 2. to 6 are result −2 respectively, 7 B 图2. VP 普通 PCR 灵敏度检测结果： 10−2 cfu/ml、1.5 × 10−3、1.5 × 10−4、1.5 × 10−5、1.5 × 10−6 cfu/ml， 7为空白对照，NG 为阴性对照 Figure 3. Standard curve for real time PCR of VP 图3. VP 实时荧光定量 PCR 扩增的标准曲线 3.7. 临床应用 果从 用荧光定量 PCR同时检测进口冷冻带鱼、鱿鱼、 墨鱼、活甲鱼、甲鱼蛋、螃蟹和虾等 100份样品，结 进口甲鱼中检出 2份VP阳性，从进口螃蟹中检 出1份VP 阳性，检测结果与常规细菌分离鉴定结果 (a) (b) or real time PCR of VP: (a) Amplification plots and other control strains; (b) Melting curves of VP and other contr 3: V. 为溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门氏菌、 完全吻合，但检测时间从常规检测时间至少四天缩短 为2天内，大大加快了检测进程。 4. 讨论 目前报道检测副溶血弧菌的荧光 PCR 检测技术 主要为 TaqMan 探针标记建立的方法，该方法要求较 高，需要设计 TaqMan 探针，合成成本较高，而用 SYBR Green I染料的方法用于建立荧光 PCR 检测副溶血弧 菌未见报道，该方法大大降低成本，试剂通用，它是 一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大 且其荧光强度的增加 与双链 DNA 的数量成正比。这一性质使其用于扩增 产物的检测非常理想。SYBR Green I 的最大吸收波长 Figure 4. Specificity f of VP ol strains. 1: Vibrio parahaemolyticus; 2: Vibrio alginolyticus; cholera; 4: Vibrio metschnikovii; 5: salmonella; 6: Citro bacter 图4. 特异性测定：(a)和(b)中1为VP 的扩增和溶解曲线结果， 2~6 枸橼酸杆菌的扩增结果 增强， Copyright © 2013 Hanspub 63  荧光定量 PCR 技术检测副溶血弧菌方法的建立与初步应用 Copyright © 2013 Hanspub 64 约为 497 nm，发射波长最大约为 520 nm。在PCR反 应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR 荧光染 料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不 掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号， 从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同 步。SYBR Green I 在核酸实时检测方面有很多优点， 它与所有的双链 DNA相结合，不必因为模板不同而 特别定制，因此通用性好，且价格相对较低。利用荧 光染料可以指示双链 DNA熔点的性质，通过溶点的 曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以 区分非特异性扩增，同时 过扩增温度的调整降低 度 便， 需在 SYBR Green I反应混合液中加入引物和待测 效、特异的检测 敏度高了 10 倍；其扩增和检测都在同一 需要开盖，不需要电泳检测PCR 产物， 有效 普通 i [3] G. Ripabelli, Mmmarco, G. M. G al. Occurrence [J]. 微生物学报, 1993, 33(4): 285-289. 海产品中的副溶血弧菌[J]. 中国人兽共患病 学报, 2010, 26(5): 455-458. [13] 1 opment of a plex real-time PCR assay with an internal a Rapid detection of Patho- nsitive and specific duplex PCR-hybridization probes assay using LightCycler. Journal of Applied Microbiology, 2008, 105(2): 575-584. 可通 非特异产物的影响。此外，由于一个 PCR 产物可以与 多个分子的染料结合，因此SYBR Green I 的检测灵敏 很高，而且它不要用到对人体有致癌危害的 EB。 本方法与 TaqMan探针法相比，其方法更加简 只 样品就可以了，成本相对低廉，而且无须合成价格昂 贵的探针；与普通 PCR 相比，更为高 VP，检测灵 管内完成，不 解决了污染问题；可同时检测96个样品，检测 时间只要 2个小时左右，且可以直接对检测结果进行 分析，即方便又省时。因此，本试验建立的 SYBR Green I 检测方法是一种快速、准确、简便的检测方法。 荧光定量 PCR 条件是否优化主要是通过标准曲 线、扩增曲线、溶解曲线、可信度R、扩增效率等指 标来衡量，标准曲 R值显示实验数据满足衰减的线性 程度，即数据的线性程度。线性用来衡量重复样品数 据是否一致和不同拷贝数的初始模板是否具有相同 的扩增效率。一般认为反应的扩增效率在 90%~105% 之间能够达到较好的水平，可信度R > 0.98。本研究 所建立副溶血弧菌 SYBR Green I荧光定量 PCR 检测 方法扩增效率 E = 100%，R = 0.996。通过溶解曲线看 出反应过程中未出现非特异性扩增和明显的引物二 聚体。特异性和灵敏度测试实验表明本研究所建立最 低可检测出 2.14 个拷贝，且具有很好的特异性，将试 剂预先混合−20℃保存稳定性非常好，以上结果提示 本研究建立了副溶血弧菌特异的荧光 PCR检测方法， 该方法的特异性、敏感性、稳定性等技术指标均能够 满足检测要求。 经试验证明本研究建立的荧光定量 PCR 方法较 PCR 方法能够并且本方法从制样到得出明确的 检测结果只需 1.5 天，大大缩短了检测时间，能够满 足应紧急情况下的快速应急机制的要求，也是对VP 检测方法的进一步完善，这对于控制和消灭 VP 和加 强口岸检疫将产生重大的意义。 参考文献 (References) [1] K. Mullis, F. Faloona. Specific synthesis of DNA in vtro via a Polymerase-catalyzed chain reaction. 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