ABSTRACT

Objective: To determinate the flavonoids’ content and the anti-hepatitis B virus (HBV) effect of the extracts from Lysimachia fortunei Maxim in vitro. Methods: Macroporous resin (D101) was used to isolate and purify the extracts of Lysimachia fortunei Maxim and the total flavonoids’ content was determinated by NaNO₂-AlCl₃ system. Then, the HepG 2.2.15 cell line was used to investigate the anti-HBV effects of the extract from Lysimachia fortunei Maxim. Results: The content of flavonoids reaches 89.29%. The extracts are shown to inhibit the HBeAg secretion in HepG2.2.15 cells. Conclusions: Macroporous resin (D101) is efficient for purification of total flavonoids from Lysimachia fortunei Maxim. The extracts of Lysimachia fortunei Maxim are effective in inhibition of HBV in vitro.

Keywords:Lysimachia fortunei Maxim, Flavonoid, HepG 2.2.15 Cells

大田基黄总黄酮含量测定及提取物抗乙肝病毒作用

龚受基^1,2，杨茵²

¹北部湾大学食品工程学院，广东 钦州

²桂林医学院，广西 桂林

收稿日期：2020年2月2日；录用日期：2020年2月17日；发布日期：2020年2月24日

摘 要

目的：测定大田基黄提取物中总黄酮含量，研究大田基黄不同提取物体外抗乙肝病毒作用。方法：采用大孔吸附树脂(D101)纯化工艺技术，对大田基黄提取物进行提纯，应用NaNO₂-AlCl₃显色法测定总黄酮含量；应用HepG 2.2.15 细胞系培养系统检测大田基黄提取物对HBsAg和HBeAg的抑制作用。结果：经树脂纯化后的大田基黄提取物总黄酮含量达89.29%；大田基黄提取物对HBsAg表达有抑制作用，其中对HBsAg抑制作用差别较大。结论：大孔吸附树脂(D101)分离纯化大田基黄总黄酮效果显著；大田基黄提取物有体外抗乙肝病毒作用。

关键词 :大田基黄，黄酮，HepG 2.2.15 细胞系

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1. 引言

大田基黄Lysimachia fortunei Maxim系报春花科排草属植物红根排草，别名星宿菜、红根草，系多年生植物，多发现于山边、沟坡、溪畔等湿润阴凉区域，在我国中南、华东等省均有分布。大田基黄全草富含黄酮类、甾体类化合物 [1] [2] [3] [4]，具有抗高血压、镇痛抗炎、提高免疫力等药理作用 [5] [6] [7]。黄酮类化合物属于植物二次代谢产物，具有多方面的活性 [8]，大田基黄富含黄酮类化合物 [9] [10]，可能是潜在的抗病毒活性物质。本实验测定了大田基黄提取物中的总黄酮含量，利用HepG 2.2.15 细胞系观察不同提取物对HBeAg、HBsAg分泌的影响，分析不同极性提取物的抗乙肝病毒功效。

2. 材料药品与仪器

2.1. 药品试剂

大田基黄全草，由广西植物研究所黄定中高工鉴定为报春花科排草属植物红根排草Lysimachia fortunei Maxim；芦丁标准品，AR，批号TCM027-080118，南京替斯艾么中药研究所；D101大孔吸附树脂(中国沧州远威化工有限公司)；HepG 2.2.15 细胞系(北京大学医学院第一附属医院病毒研究所)；DMEM G418 (Gibco分装)，谷氨酰胺(Sigma)，新生小牛血清(Sigma)；其他试剂为分析纯。

2.2. 仪器设备

BP211D电子天平，德国Sartorius公司产品；752紫外光栅分光光度计，上海分析仪器总厂产品；MCO -15AC CO₂培养箱，日本三洋公司产品；XSBIA倒置显微镜，上海蔡康光学仪器有限公司产品；KHB ST-360酶标仪，上海科华实验系统有限公司产品；96孔细胞培养板，美国Corning公司产品。

3. 方法

3.1. 总黄酮提取

大田基黄全草粉碎，过14目筛，取过筛物20 g，加60%乙醇200 mL超声提取0.5 h，抽滤，滤渣按相同条件再提取一次，合并滤液，减压浓缩至稠状物。稠状物加500 mL蒸馏水搅拌溶解，静置过夜，抽滤。取滤液上D101树脂柱，待大孔树脂吸附完全后，用蒸馏水洗脱至馏出液无色，弃去此柱流液。再用400 mL 80%乙醇洗脱树脂，收集洗脱液，旋转蒸发仪减压浓缩，将浓缩液于真空干燥器中45℃干燥成疏松固体，粉碎得粗黄酮，备用。

3.2. 样品制备

干燥大田基黄全草粉碎，过14目筛，称取10 g用10倍量95%乙醇超声提取0.5 h，抽滤，滤渣同样条件再提取一次，合并滤液，浓缩、真空干燥得提取物E₁；滤渣用60%乙醇按上述方法处理得提取物E₂；上述滤渣用蒸馏水按上述方法处理得提取物E₃。

3.3. 总黄酮的含量测定

3.3.1. 标准曲线的制备

精确称量20.00 mg芦丁标准品，以60%乙醇超声溶解后，定容至50 mL容量瓶，取8.0 mL于25 mL容量瓶中，加入浓度为0.50 mol/L的NaNO₂ 1.0 mL，摇匀静止5 min，再加入0.30 mol/L的AlCl₃ 1.0 mL，摇匀静置5 min，再加1.00 mol/L的NaOH 5.0 mL，摇匀显色后，用60%乙醇定容并摇匀，放置10 min，用1 cm比色皿在360~600 nm区间扫描，确定最大吸收波长为504.6 nm。分别移取上述标准液0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL于7个25 mL的容量瓶中，同上述方法显色后，用60%乙醇定容，于504.6 nm处测定吸光度，空白试剂为参比液，绘制标准曲线。

3.3.2. 精密度试验

取上述芦丁标准液5份，每份3.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，显色后用60%乙醇定容，测定5份溶液的吸光度值。

3.3.3. 稳定性试验

量取同一供试品溶液，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h处测定吸光度值，每一时间段测5次，计算RSD%。

3.3.4. 样品中总黄酮含量测定

精确称量粗黄酮干燥产物120 mg，用60%乙醇超声溶解，定容至50 mL容量瓶。再精密量取5.00 mL于25 mL容量瓶，按标准曲线制备方法加入试剂显色摇匀后，用60%乙醇定容放置10 min，测定吸光度，测定3次，并将此值代入回归方程，计算总黄酮的含量。

3.4. 总黄酮的体外抗乙肝作用

3.4.1. 药物配制

将大田基黄提取物E₁、E₂、E₃用100%二甲基亚砜溶解，使二甲基亚砜浓度为10%，过滤灭菌备用。

3.4.2. HepG2.2.15细胞的培养

DMEM中加入380 mg/L G418、15%新生小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、1%青霉素链霉素、5%碳酸氢钠调pH 7.2~7.4，于 37℃ 、5%二氧化碳条件下培养，每10 d传代一次。

3.4.3. 药物对细胞的毒性作用试验

将HepG 2.2.15 细胞按1 × 10⁸/mL接种于96孔细胞培养板，每孔190 μL，置CO₂培养箱培养30 min，酶标仪于波长515 nm条件下测其吸光度。依次将提取物E₁、E₂、E₃各50 μL加入培养板中，每3 d换相同浓度的相同药液和培养基，设不加药物的100 mL/L DMSO为对照孔，于第9天测定药物对细胞的毒性。

3.4.4. 大田基黄提取物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg分泌的影响

将HepG 2.2.15 细胞按2 × 10⁵/mL接种于96孔细胞培养板中，每孔190 μL，加入不同浓度提取物E₁、E₂、E₃，每个浓度设3个平行孔，同时设10% DMSO阴性对照组，3天后取培养孔上清液用ELISA法测定吸光度值，计算药物对HBsAg、HBeAg分泌的抑制率。

3.4.5. 统计处理

各组检测数据以 $\overline{\mathrm{x}}$ ± s表示，组间比较用t检验。

4. 结果

4.1. 方法试验

精密度试验：5份芦丁标准液，吸光值分别为0.135、0.135、0.135、0.136、0.135，平均值为0.1352，RSD% = 0.33，显示精密度良好。

稳定性试验：0~8 h不同时间点吸光度值RSD%分别为0.18、0.28、0.19、0.17、0.15、0.28、0.36、0.43、0.67，统计结果表明，在8h内试验结果稳定性良好，检测方法可行。

4.2. 黄酮含量测定

测定提取物中总黄酮含量3次，平均含量为89.29%。

4.3. 提取物对HepG 2.2.15 细胞系的作用

大田基黄提取物体外抗乙肝病毒作用，提取物E₁为60%乙醇提取物，提取物E₂为大田基黄95%乙醇提取物，提取物E₃为95%乙醇提取完后再用水提取。72h的抑制结果见表1、表2和表3。提取物对HBeAg分泌具有较好的抑制作用，对HBsAg的分泌作用影响有差异，仅提取物E₂具有较好的抑制作用。三种提取物对HBeAg的抑制作用呈现剂量性关系，E₂对HBsAg的抑制作用也呈现出抑制作用。

表1. 提取物E₁对HepG 2.2.15 细胞株HBsAg、HBeAg表达的影响(n = 3, $\overline{\mathrm{x}}\pm \text{s}$ )

表2. 提取物E₂对HepG 2.2.15 细胞株HBsAg、HBeAg表达的影响(n = 3, $\overline{\mathrm{x}}\pm \text{s}$ )

表3. 提取物E3对HepG 2.2.15 细胞株HBsAg、HBeAg表达的影响(n = 3, $\overline{\mathrm{x}}\pm \text{s}$ )

5. 讨论

乙型肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致，肝脏感染后产生炎性病变，具有传染性。乙肝病毒感染者血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)呈阳性，是感染HBV的标志。乙型肝炎E抗原(HBeAg)是判断HBV复制活跃与否的重要标志，其存在于HBsAg阳性患者的血液中，HBeAg呈阳性反映HBV病毒复制活跃、传染性强。目前，抗乙型肝炎药物主要有α-干扰素和核苷类似物两大类，但是其治疗效果并不令人满意，而且具有类感冒、疲倦和低血球等副作用 [11] [12]。传统中药作为一种补充替代疗法，在临床上中国、日本和韩国等多个国家广泛应用其治疗乙型肝炎 [13]。传统中药活性因子复杂多样，很多活性因子没有完全分离纯化，结构没有阐明，但是由于其来源广泛，而且化学特征与生物合成或者化学合成药物类似，易吸收、代谢，因此近年来传统中药引起了药物研究者的广泛关注 [14]。

黄酮类化合物是一类发现于植物的酚型结构次生代谢产物，种类繁多，活性多样。多种黄酮被证实对乙型肝炎具有治疗作用，茶叶中富含EGCG，其能够破坏HBV DNA复制中间体的合成从而抑制HBV 复制，最终减少共价环状病毒DNA链的表达 [15]。汉黄芩素和5-甲氧基-(3,4-二氢-3,4-二乙酰氧基)-2,2'-二甲基-吡喃酮-(7,8,5,6)-黄酮降低HBsAg和HBeAg分泌水平，同时降低HBV DNA表达，从而抑制HBV复制 [16] [17]。苎麻叶提取物含黄酮类化合物，对HBV的HBsAg、HBeAg和DNA表达都有显著抑制作用 [18]。

大田基黄中槲皮素含量达3.25 mg/g，总黄酮含量高达3.83%，黄酮含量丰富，以大孔树脂D101富集纯化效率较高 [9] [10]。已经鉴定的黄酮类化合物有5000多种，包括无糖基的苷元和连接有糖基的苷。不同黄酮类化合物极性不同，溶解于有机溶剂的特性也不同，苷元和连接较少糖基的苷极性小，容易溶解于高浓度乙醇溶液中，含有稍多糖基的苷极性中等，比较容易溶解于中等浓度乙醇溶液，当苷中糖基数目比较多时极性较大，比较容易溶解在水中。所以利用95%乙醇提取出极性较小的黄酮苷元和黄酮苷E₁，60%乙醇溶液提取出中等极性黄酮苷E₂，水提取出极性大的黄酮苷E₃。

本实验以乙型肝炎病毒感染肝癌细胞得到的细胞系HepG 2.2.15 为体外研究模型，检测了HBsAg、HBeAg的表达水平，观察了大田基黄三种提取物不同浓度体外对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用。结果表明，提取物E₂、E₃仅对HBeAg表达有抑制作用，提取物E₁对HBsAg与HBeAg均有抑制作用，且其抑制作用呈现剂量依赖性。三种提取物极性不同，表明其所含糖基数目不等，但均对HBeAg有抑制作用，且抑制作用相差不大，从构效角度表明苷元糖基存在与否对HBeAg表达影响不大，糖基对HBeAg的抑制作用不是必须的。但是糖基的存在对抑制HBsAg表达存在较大差异，提取物E₁极性较小，说明其含糖基数目少，有较好的抑制HBsAg表达作用，而提取物E₂、E₃极性较大，对HBsAg表达的抑制较弱，说明糖基的存在不利于抑制HBsAg表达。

基金项目

北部湾大学校级科研项目(2017KYQD223)，广西高校科学技术研究项目(KY2015ZD086)。

文章引用

龚受基,杨 茵. 大田基黄总黄酮含量测定及提取物抗乙肝病毒作用
Determination of Flavonoids and Anti-Heptitis B Virus Activity of Extracts from Lysimachia fortunei Maxim[J]. 食品与营养科学, 2020, 09(01): 95-100. https://doi.org/10.12677/HJFNS.2020.91012

参考文献